Summary
Her præsenterer vi en protokol for undersøgelse parring konkurrenceevne mandlige Aedes aegypti ved hjælp af fluorescerende farvestof som en markør. Kvindelige myg udsættes for både markerede og umærkede mænd til copulation. Post parring, deres spermathecae undersøges under en fluorescens mikroskop til at bestemme deres parring partner.
Abstract
Succesen af sterile eller uforenelige insekt teknik-baserede befolkning undertrykkelse programmer afhænger af evnen til frigivet mænd til at konkurrere om vilde-type kvinder og fremkalde sterilitet i målgruppen. Derfor er laboratorievurdering af mandlig parrings konkurrenceevne afgørende for at evaluere frigivelsesstammens egnethed før feltudslip. Konventionelt udføres en sådan analyse ved at bestemme andelen af levedygtige æg produceret af hunnerne efter samtidig at være blevet udsat for to sæt hanner (vilde type- og frigivelsesstammer) til kopulation. Denne proces er imidlertid tidskrævende og besværlig på grund af behovet for først at blodfodre hunnerne til ægproduktion og derefter luge og opregne de udklækkede æg for at bestemme ægs levedygtighed.
Desuden kan denne metode ikke skelne graden af konkurrenceevne mellem to sterile eller Wolbachia-inficeredemyglinjer, da vilde kvindelige myg kun vil producere ikke-levedygtige æg ved parring med begge. For at omgå disse begrænsninger beskriver dette papir en mere direkte metode til måling af mandlig myggeparing konkurrenceevne i laboratoriemiljøer ved hjælp af fluorescerende farvestof, rhodamin B (RhB), som kan bruges til at markere mænd ved at fodre dem i saccharoseopløsning, der indeholder RhB. Efter parringsanalysen kan tilstedeværelsen af fluorescerende sædceller i spermathecae af en kvinde bruges til at bestemme hendes parringspartner. Denne metode er omkostningseffektiv, reducerer forsøgstiden med 90% og gør det muligt at sammenligne parringsformen mellem to sterile eller Wolbachia-inficeredelinjer.
Introduction
Opdræt og frigivelse af sterile eller uforenelige hanner til undertrykkelse af Aedes mygpopulationer er i øjeblikket ved at blive evalueret i marken som et nyt værktøj til at forhindre udbrud af denguefeber og andre Aedes-båretsygdom1. Strategier for undertrykkelse af mænd, der i øjeblikket er i feltforsøg, omfatter brugen af den genetiske metode2, bestråling (Steril Insect Technique, SIT)3, endosymbiotiske bakterier Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4eller en kombination af de to sidstnævnte teknikker5,6. Succesen af disse tilgange er i høj grad afhængig af de frigivne mænds evne til at udkonkurrere vilde mænd og søge kvinder for at sikre copulation. Ellers kan sterilitet ikke induceres i målgruppen.
I et klassisk SIT-program kan mandlig parringsfitness for eksempel påvirkes af faktorer som bestrålingsdosis7,8,9, masseopdrætsprotokol og omfanget af indavl i kolonien10,11,12,13,14. Desuden kan undersøgelser af parringskonkurrenceevnen give vigtig viden om myg parring adfærd, som kan bruges til at informere vektor kontrol strategier.
I SIT og IIT vurderes parringskonkurrenceevnen for mandlige myg typisk ved at tillade både vildtype og frigivelsesstamme at konkurrere om vilde kvinder i et bur8,11,15,16. Kvinder er derefter blod-fodret og deres æg udklækket til at bestemme levedygtigheden. Kvinder, der lægger ikke-levedygtige æg eller æg med lav lugehastighed, antages at have parret sig med frigivelse stamme mænd, mens kvinder, der producerer levedygtige æg antages at have parret sig med vilde mænd. Parringskonkurrenceevnen beregnes derefter med Fried Index17. Desværre er denne metode ressourcekrævende og tidskrævende, og det samlede Fried Index kan påvirkes af eksterne forvirrende faktorer, der påvirker ægs levedygtigheden, såsom dårlig æghåndtering og overudledning, kan resultere i en lav lugehastighed i kompatibilitetskrydset, som derefter kan føre til et kunstigt lavt stegt indeks.
Desuden giver denne metode ikke mulighed for direkte sammenligning af parringskonkurrenceevnen mellem Aedes myg, der er inficeret med forskellige stammer af Wolbachia, eller som udsættes for forskellige doser bestråling. Der er derfor behov for en mere direkte metode til at tackle disse udfordringer. Nylige undersøgelser18,19 har vist effektiviteten af at bruge fluorescerende farvestof, RhB, at markere mandlige myg 'sædvæske. Markeret sædvæske overføres og opbevares i de kvindelige mygs spermathecae ved vellykket parring, hvilket giver mulighed for direkte måling af kvindelig parring interaktion med markerede mænd. Rhodamine B er en thiol-reaktiv fluor farvestof almindeligt anvendt som biomarkør for økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser af dyr, herunder insekter20. Til myggeundersøgelser introduceres RhB ved fodring med sukker eller honningvand, der indeholder opløst RhB-pulver18,19,21,22,23,24. Ved optagelse binder RhB-farvestoffet sig til proteiner og farvning af kropsvæv med en rødlig-lyserød plet, der fluorescerer lyse orange under en fluorescerende lyskilde.
Det stærke fluorescenssignal og stabiliteten af mærkningen kombineret med dets evne til at plette insektskelvæsker giver mulighed for overvågning af overførslen af mærket sædvæske fra den mærkede han til sædopbevaringsorganerne hos det kvindelige insekt til parringsundersøgelser18,19,21,24. Brugen af RhB i en mandlig parring konkurrenceevne assay ikke kun tillader direkte måling af parring interaktion af kvinder med enten mærkede og umærkede mænd, men resultaterne kan også opnås inden for 24 timer, da det undgår processen med at bestemme æg levedygtighed, som typisk kræver omkring 10 til 14 dage. Desuden overvinder denne metode det potentielle tab af data, når de kvindelige myg ikke blodføder eller dør før ovipositionering. Dette er især afgørende, fordi i semi-felt forsøg, hvor kvindelige myg er tilbøjelige til at skade og død under post-parring indsamling ved hjælp af en rygsæk eller mekanisk aspirator. For at løse de nuværende begrænsninger ved at bruge kvindelig fertilitet til præsenterer vi en alternativ metode, der bruger RhB farvning til direkte at måle mandlige myg parring konkurrenceevne. Metoden forenkler arbejdsgangen, forkortede eksperimentel tid fra omkring to uger til en dag, hvilket giver mulighed for mere eksperimentelle replikeringer, der skal udføres og gør det muligt at sammenligne to frigivelsesstammer. Denne protokol vil være egnet til laboratorier, der er i gang med mandlige release-baserede myg befolkning undertrykkelse programmer, og kan bruges til rutinemæssig kvalitetskontrol og stamme evaluering.
Protocol
1. Opdræt af myg
- Udfør al myggeopdræt og analyse af mandlig parrings konkurrenceevne under standard insektforhold på 27 ± 1 °C og 75-80% relativ luftfugtighed med en fotoperiode på 12 timer:12 h lys: mørke cyklusser.
- Udpege de to sæt konkurrerende mænd som sæt A og sæt B for nem reference i den metode, der er beskrevet i dette papir. Bag myggene under standardiserede forhold for at sikre en rimelig sammenligning af deres egnethed under analysen. Bag myggene ved en larvetæthed på 500 larver i 2 L vand og fodre dem med jorden fiskefoderpulver ad libitum.
BEMÆRK: For generering af de repræsentative resultater, sæt A og sæt B var indavlede og outcross mænd af Wolbachia-inficerede Ae. Henholdsvis Aegypti. - Sex mandlige og kvindelige myg på pupalstadiet og indeholder dem separat i bure (se materialetabellen)af dimensioner W 32,5 cm x D 32,5 cm x H 32,5 cm med maskestørrelse på 150 x 150 og 160 μm blænde. Vedligehold alle voksne myg med 10% saccharoseopløsning.
2. Tilberedning af mandlige og kvindelige myg
- Køn de mandlige og kvindelige myg på pupalstadiet i henhold til deres størrelsesforskelle (hanunge er mindre end kvindelige pupper) (Figur 1).
- For hvert sæt myg (sæt A eller sæt B) overføres 100 hanunge hver til et præmærket bur til saccharosefodring eller RhB-saccharosefodring.
- Placer den kvindelige pupper i små partier på 40-50 pr bur. Ved fremkomsten af imagoes skal du kontrollere burene for tilstedeværelsen af mandlige myg.
BEMÆRK: Voksne mandlige myg er mindre end kvinder og har buskede og mere behårede antenner (Figur 2). Brug kun jomfru kvindelige myg til parring konkurrenceevne assays. Brugen af forinminerede kvinder vil gøre alle resulterende data ugyldige. Således skal der udvises ekstrem omhu under sexing på puppestadiet. Brug ikke de kvindelige myg fra et bur, der er blevet forurenet med mandlige myg. Ekstra bure af kvinder skal forberedes.
3. Forberedelse af 0,2% RhB - saccharoseopløsning
BEMÆRK: RhB er et grønt pulver i tør form og rødlig-pink i opløsning. Der skal bæres personlige standardværn (PPE: laboratoriebeskyttelseskjole, nitrilhandsker og øjenbeskyttelse) ved håndtering af dette kemikalie. For at undgå indånding skal rhbpulveret vejes i en røghætte.
- For at fremstille en 0,2% w/v RhB-saccharoseopløsning opløses 200 mg RhB-pulver for hver 100 mL 10% w/v/ saccharoseopløsning. Bland godt for at sikre, at alt pulveret er opløst.
BEMÆRK: Da RhB er lysfølsomt, skal du bruge gule flasker eller pakke klare flasker helt ind med aluminiumsfolie.
4. Fodring af mandlige myg
BEMÆRK: Data fra RhB-saccharose fodring optimering er præsenteret i supplerende materiale, afsnit 1.
- Forbered 20 sukker feeder flasker med en væge. Tilsæt 10 mL 10% saccharose i 10 feeder flasker og 10 mL af 0,2% RhB-saccharoseopløsning i de andre 10 feeder flasker (brug ravflasker, eller wrap flaskerne i aluminiumsfolie).
- Foderflaskerne placeres i de respektive hanbure (5 flasker pr. bur), der er fremstillet i trin 2.2 og 2.3. Lad de mandlige myg fodre i tre dage før parringseksperimentet.
5. Kontrol for RhB fluorescens hos mandlige myg
- Aspirate RhB-saccharose-fodret mandlige myg, og observere dem under en fluorescens stereo mikroskop for at sikre, at alle RhB-saccharose-fodret mandlige myg er blevet med succes markeret med RhB.
- Tænd kviksølvbrænderlampen og stereomikroskopet. Lad lyskilden til kviksølvbrænderlampen stabilisere sig i 10 min. Indstil fluorescensfiltrene for rødt fluorescensprotein 1 (RFP1) (excitationsbølgelængde 540 nm, emissionsbølgelængde 625 nm).
- Aspirere et lille antal myg (fire eller fem) ad gangen i glasrøret af den mundtlige aspirator. Gennem glasrøret observerer de mandlige mygs krop under fluorescens stereomikroskopet. Ekskluder mandlige myg, der ikke er markeret med RhB fra eksperimentet.
BEMÆRK: Underlivet af mandlige myg markeret med RhB vil fremstå lyserødt under hvidt lys (Figur 3A) og lyser lyse orange under fluorescerende lys (Figur 3B). - Overfør Sæt A mandlige myg i 12 papirkopper sikret med net (maskestørrelse 150 x 150, 160 μm blænde); 6 kopper hver med 10 saccharose-fodret mandlige myg og de andre 6 kopper hver med 10 RhB-saccharose-fodret mandlige myg. Gentag dette trin for Sæt B mandlige myg.
6. Parring konkurrenceevne assay
- Opsætning af 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm bure med maskestørrelse 44 x 32, 650 μm blænde til parringsanalysen. I hvert af de seks bure, omfatter 10 Sæt A (RhB-mærket) mandlige myg, 10 Sæt B (umærkede) mandlige myg og 10 jomfru vilde kvindelige myg. I de andre seks bure omfatter 10 Sæt A (umærkede) mandlige myg, 10 Sæt B (RhB-mærket) mandlige myg og 10 jomfru vilde kvindelige myg. Mærk disse bure for klart at skelne mellem de to parringskombinationer.
BEMÆRK: Baseret på erfaring blev et bur på 60 cm x 60 cm x 60 cm brugt til parringsanalysen, da et mindre bur kan fremme blandet parring. - Læg de respektive kopper mænd tilberedt i trin 5.4 i parringsburene i henhold til etiketten i trin 6.1. Fjern nettet og tryk forsigtigt på koppen for at skubbe hannerne ud af koppen. Fjern forsigtigt papirkoppen og nettet fra buret for at sikre, at ingen myg slipper ud af buret. Lad de mandlige myg akklimatificere i parringsburet i mindst en time.
- Ved hjælp af en oral aspirator overføres jomfru vilde kvindelige myg til 12 papirkopper, hvor hver kop indeholder 10 myg.
- Efter akklimatationsperioden for de mandlige myg overføres en kop kvinder til hvert parringsbur og fjerner nettet. Forsigtigt skubbe koppen for at opmuntre eventuelle resterende kvindelige myg ud af koppen. Fjern forsigtigt papirkoppen og nettet fra buret for at sikre, at ingen myg slipper ud af buret.
- Lad parringen finde sted i 3 timer.
BEMÆRK: Den anbefalede parringsvarighed blev bestemt ved forudgående observationer af Ae. aegyptiaf vild type . I forsøg med 10 hunner og 20 hanner, der holdes i et 60 cm x 60 cm x 60 cm bur, blev der opnået 90% kvindelig insemination i 3 timer (supplerende materiale, afsnit 2). Forstyr ikke buret i denne periode, da omrøring kan føre til afbrudt og blandet parring. Blandet parring (hvor kvinden har parret sig med både markerede og umærkede hanner) resulterer i en bias mod RhB-mærkede hanner, da det er svært at skelne umærkede sædceller fra RhB-mærkede sædceller under et fluorescensmikroskop. - For at afslutte parringseksperimentet skal du fjerne alle myg fra hvert bur ved hjælp af en mekanisk aspirator. Kold bedøve myg på is i mindst 5 minutter. Når myggene er fuldt bedøvet, skal du forsigtigt afhente de kvindelige myg og huse dem i en separat papirkop fastgjort med net (maskestørrelse 150 x 150, 160 μm blænde). Mærk papirbægeret ved at overføre den respektive etiket fra parringsburet til papirkoppen.
BEMÆRK: Det er muligt at sætte eksperimentet på pause på dette tidspunkt og opretholde hunnerne med 10% saccharoseopløsning. Den RhB-mærkede sædvæske vil forblive stabil inde i den kvindelige spermathecae i mindst en uge. Det er bedst at holde hunnerne i live, før dissektion som døde og udtørrede prøver er vanskelige at dissekere. - For at score den kvindelige spermathecae, kold bedøve de kvindelige myg på is i mindst 5 minutter før dissektion under et stereomikroskop (Video 1). Undersøg spermathecae under et sammensat lysmikroskop (forstørrelse 100x) for deres inseminationsstatus (Figur 4). For inseminerede personer, afgøre, om spermathecae indeholder RhB-mærket sædvæske ved at undersøge dem under fluorescens stereo mikroskop udstyret med en RFP1 filter og et kamera imaging system.
BEMÆRK: Når du bruger et fluorescens stereomikroskop med et vedhæftet billedsystem, anbefales det at bruge en forlænget eksponeringstid (5 s) for at øge detektionsfølsomheden. Hvis den kvindelige myg har parret sig med en mærket mand, vil hendes spermathecae fluorescere lys orange (Figur 5A). Men hvis den kvindelige myg har parret sig med en umærket mand, vil hendes inseminerede spermathecae ikke fluorescere (Figur 5B).
7. Bortskaffelse af RhB affald
- Forkæl vandig RhB-affald med aktivt kul25, før det udledes som almindeligt spildevand. Bortskaffes fast RhB affald (myg markeret med RhB, papirhåndklæder, og væger gennemblødt med RhB) som kemisk affald. Don standard PPE ved håndtering af RhB affald.
Representative Results
w AlbB-SG er en lokaliseret (Singapore) Ae. aegypti linje stabilt inficeret med wAlbB stamme wolbachia. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i dette papir, evaluerede vi den mandlige parring konkurrenceevne af en indavlet og en over krydset linje wAlbB-SG at afgøre, om indavl resulterer i et tab i mandlige parring fitness. Den indavlede linje var blevet opretholdt i 11 generationer i insektet, mens den krydsede linje blev genereret ved at krydse hunnerne med vild type mandlige Ae. aegypti. Mænd fra de indavlede og krydsede linjer blev konkurreret mod hinanden for parring med vilde-type vilde type kvindelige Ae. aegypti. Parringskonkurrencen blev udført i tredobling.
Resultaterne viste, at RhB ikke påvirkede mændenes egnethed, da dataene for kvindelig insemination ikke var forudindtaget over for eller mod parring med RhB-saccharosefodrede hanner (tabel 1 og figur 6) Da RhB ikke påvirker mændenes parringsform, analyserer vi dataene baseret på procentdelen af inseminerede hunner, der parres med enten den indavlede eller krydsede linje (tabel 2 og figur 7). Resultatet på tværs af de eksperimentelle triplikater var konsistente; der var en signifikant højere procentdel af kvinder parret med outcross hanner end med de indavlede hanner i alle tre replikater (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Disse resultater tyder på et potentielt tab i mandlig parring fitness efter flere generationer af indavl i laboratoriet.
Figur 1: Lateral visning af hanner (venstre) og hunner (højre) Aedes aegypti pupae. Under de samme opdrætsbetingelser kan Ae. aegypti sexes på hvalpestadiet efter størrelse; mænd er betydeligt mindre end kvinder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Differentiering af mandlige (venstre) og kvindelige (højre) Aedes aegypti voksne. Voksne mandlige myg (venstre) har buskede og mere behårede antenner end den voksne kvinde; de røde pile angiver antennerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rhodamin B-mærkning af hanmyg. (A) Let mikroskopi; (B) fluorescensmikroskopi. Myggen til venstre er umærket (fodret med 10% w / v saccharose), mens den til højre er markeret (fodret med 0,2% RhB-saccharose). Markerede myg har en synlig lyserød mave under hvidt lys (myggen til højre i A), som fluorescerer lys orange under fluorescensmikroskopi (B). Skalabarer = 5 mm. Forkortelse: RhB = Rhodamine B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Insemineret og ikke-insemineret kvindelig spermathecae under et sammensat lysmikroskop (100x forstørrelse). Inseminationsstatus for en kvindelig myg kan bestemmes ved at observere dens spermathecae under et sammensat lysmikroskop. En insemineret kvindelig myg vil indeholde mindst en fyldt spermatheca, mens alle tre spermathecae af en ikke-insemineret kvindelig myg vil være tom. Tråd-lignende, motile sædceller vil være synlige i en fyldt spermatheca under en sammensat lys mikroskop. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kvindelige mygge spermathecae insemineret med sædvæsker under et fluorescens stereomikroskop. (A) RhB-mærket og (B) umærket spermathecae insemineret med RhB-mærkede sædvæsker vil fluoresce lyse orange under fluorescens mikroskopi. Skalalinjer = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Antal vilde hunner, der blev insemineret af enten indavlede eller udkongerede hanner i de eksperimentelle triplikater med gensidig mærkning. (B) Outcross hannerne var mærket med RhB, mens de indavlede hanner var umærkede. Et højere antal kvinder blev observeret at have parret sig med outcross mænd uanset deres mærkning status. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Andelen af inseminerede hunner parret med indavlede eller outcross hanner i de 3 eksperimentelle replikerer. For hver eksperimentel replikation er der en betydeligt højere procentdel af kvinder parret med outcross hannerne (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Dissektion af kvindelige Aedes aegypti til spermathecae under et lys stereomikroskop. Klik her for at downloade denne video.
| ♀ x Indavlet (RhB) ♂ en | ♀ x Outcross (umarkeret) ♂ b | ♀ x Indavlet (umærket) ♂ c | ♀ x Outcross (RhB) ♂ d | Samlet insemination sats (a+b+c+d/120) |
|
| Repliker 1 | 11 | 35 | 7 | 40 | 77.5% (93/120) |
| Repliker 2 | 6 | 29 | 8 | 31 | 61.7% (74/120) |
| Repliker 3 | 6 | 36 | 6 | 33 | 67.5% (81/120) |
Tabel 1: Antal kvinder parret med RhB-mærkede og umærkede wAlbB-Sg Aedes aegypti indavlede og outcross hanner. I alt blev der anvendt 120 kvinder i hver replikation.
| Procent inseminerede kvinder | ||
| Indavlede hanner | Outcross mænd | |
| Repliker 1 | 19% (18/93) | 81% (75/93) |
| Repliker 2 | 19% (14/74) | 81% (60/74) |
| Repliker 3 | 15% (12/81) | 85% (69/81) |
Tabel 2: Procentdel af inseminerede hunner parret med wAlbB-Sg Aedes aegypti indavlede og outcross hanner.
Supplerende figur S1: Sammenligning af arbejdsgange for RhB-baserede og konventionelle parring konkurrenceevne assay. I forhold til den konventionelle parringskonkurrenceevne reducerer den forenklede og forkortede arbejdsgang for RhB-baseret parringskonkurrence betydeligt den eksperimentelle varighed. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Kaplan Meier overlevelseskurver for mandlige voksne Aedes aegypti under og efter fodring med 0,2% og 0,4% rhodamin B-saccharose fodring. Procent overlevelse af (A) mandlige vilde-type og (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti under og efter tre dage med fodring på 0,2% og 0,4% RhB-saccharose, sammenlignet med kontrol, der blev fodret med saccharose kun. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Inseminationshastighed for kvinder i et W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm bur (forholdet mellem 10 hunner og 20 hanner) ved 1-, 2-og 3-timers tidspunkter. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Mærkning er almindeligt anvendt i entomologisk forskning for at studere insektpopulationsdynamik, spredning, adfærd og parringsbiologi26. I SIT- og IIT-programmer udføres mærkning for at differentiere frigivelsesstammen fra feltpopulationen for at studere deres spredning og optimere frigivelsesforholdet. De anvendte mærkningsmetoder omfatter genetisk mærkning27,28, der indeholder isotoper i larvefødevarer29,30, fluorescerende støv31ogfarvestof 32. Til undertrykkelse af mygpopulationer ved hjælp af SIT eller IIT, hvor mandlig parringsfitness er en kritisk komponent, er fluorescerende farvestoffer blevet brugt som markører til at studere mygparringsbiologi 18,19.
Konventionelt, vurdering af mandlige parring konkurrenceevne frigivelse stamme er blevet vurderet ved hjælp af kvindelige fertilitet assays. Denne analyse er imidlertid tidskrævende og arbejdskrævende på grund af downstream-eksperimentelle processer efter parring (supplerende figur S1). Disse processer omfatter blodfodring af hunnerne, ægopsamling, udklækning af æggene og optælling af andelen af udklækkede æg for at bestemme ægs levedygtighed. I gennemsnit kræver denne analyse 30 mandetimer og to ugers eksperimentelt arbejde (startende fra oprettelsen af konkurrenceevne assay bure) til den endelige bestemmelse af mandlige parring konkurrenceevne.
hans papir præsenterer brugen af et fluorescerende farvestof, RhB, (fodret som 0,2% RhB-saccharose til myggene, supplerende figur S2) til direkte at måle parringsinteraktioner mellem kvinder og RhB-mærkede hanner. Mens denne protokol kræver en fluorescens stereo mikroskop, det undgår behovet for at udføre de tidskrævende eksperimentelle procedurer, der er nævnt ovenfor. I gennemsnit kræver denne RhB-baserede analyse ca. 10 mandetimer og omkring en dag for at få data svarende til data fra kvindelige fertilitetsanalyser. Dette Dette >90% tidsbesparelser giver forskerne forskere mulighed for at udføre flere eksperimentelle replikter, hvilket giver en mere robust validering af mandlig parring fitness. Derudover kan denne analyse bruges til at sammenligne parringskonkurrenceevnen mellem to sterile eller Wolbachia-inficerede myglinjer.
Denne type sammenligning er ikke mulig med konventionelle kvindelige fertilitet assays, som kvinder ville give ikke-levedygtige æg ved parring med begge sådanne linjer. Uanset, enhver blandet parring i eksperimentet vil resultere i bias mod den markerede befolkning, da det er vanskeligt at identificere umærkede sædceller i kvindelige spermathecae, der indeholder sædvæske fra både RhB-mærket og umærkede mænd. En lignende konklusion blev draget i en undersøgelse, der vurderede, at Anopheles gambiaes konkurrenceevne ved hjælp af RhB18, hvorved en større andel af hunnerne i parringsanalysen viste sig at være parret med mærkede hanner. Da polyandry er mere tilbøjelige til at forekomme hos kvinder, der tidligere havde engageret sig i en afbrudt parring33, blev sandsynligheden for, at dette skete, reduceret i denne undersøgelse ved at bruge færre myg (20 hanner til 10 kvinder) i et større burvolumen (0,216 m3) i disse eksperimenter.
Resultaterne viste ingen bias mod RhB-mærket befolkning, hvilket indikerer, at blandet parring var begrænset. Sammenfattende, inkorporering af RhB at markere mænd i en parring konkurrenceevne assay er en økonomisk og hurtig måde at evaluere mandlige parring fitness. Denne metode giver også mulighed for direkte sammenligning af parring konkurrenceevne mellem mænd udsat for forskellige doser af bestråling, opdrættet i forskellige opdræt regimer, eller dem, der er inficeret med forskellige stammer af Wolbachia, hvilket gør det til et værdifuldt redskab til evaluering af mandlig parring fitness for enhver mandlig release-baseret myg befolkning undertrykkelse program.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af National Environment Agency (NEA), Singapore. Vi takker Hr. Chew Ming Fai, viceadministrerende direktør (Folkesundhed), NEA, for hans godkendelse til at offentliggøre undersøgelsen, og A / Prof Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, for hendes støtte i denne undersøgelse. Vi takker også Dr. Shuzhen Sim og Dr. Denise Tan for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
| Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
| Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
| Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
| 6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
| Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
| Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
| Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
| TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |
References
- Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655 (2015).
- Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964 (2015).
- Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194 (2015).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
- Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
- Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G.
- Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357 (2019).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4 (2009).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124 (2017).
- Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
- Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864 (2016).
- Fried, M.
- Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236 (2020).
- Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902 (2017).
- Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5 (2006).
- Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
- Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
- South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
- Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
- Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85 (2019).
- Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921 (2018).
- Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
- Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
- Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
- Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).
