Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera parningskraften hos manliga Aedes aegypti med fluorescerande färgämne som markör. Kvinnliga myggor utsätts för både märkta och omärkta män för kopulering. Efter parning undersöks deras spermathecae under ett fluorescensmikroskop för att bestämma deras parningspartner.
Abstract
Framgången för sterila eller inkompatibla insektsteknikbaserade populationsdämpningsprogram beror på förmågan hos frisläppta män att konkurrera om vilda honor och inducera sterilitet i målpopulationen. Därför är laboratoriebedömning av manlig parningskonkurrenskraft avgörande för att utvärdera frisättningsstammens kondition före fältfrisättning. Konventionellt utförs en sådan analys genom att bestämma andelen livskraftiga ägg som produceras av honorna efter att samtidigt ha utsatts för två uppsättningar hanar (vilda och frisättningsstammar) för kopulering. Denna process är dock tidskrävande och mödosam på grund av behovet av att först blodmata kvinnorna för äggproduktion och sedan kläcka och räkna upp de kläckta äggen för att bestämma äggets livskraft.
Dessutom kan denna metod inte urskilja graden av konkurrenskraft mellan två sterila eller Wolbachia-infekterademygglinjer eftersom vilda kvinnliga myggor bara kommer att producera icke-livskraftiga ägg vid parning med båda. För att kringgå dessa begränsningar beskriver detta dokument en mer direkt metod för att mäta manlig myggparnings konkurrenskraft i laboratoriemiljöer med hjälp av fluorescerande färgämne, rhodamin B (RhB), som kan användas för att markera män genom att mata dem i sackaroslösning som innehåller RhB. Efter parningsanalysen kan närvaron av fluorescerande spermier i spermathecae hos en kvinna användas för att bestämma hennes parningspartner. Denna metod är kostnadseffektiv, minskar försökstiden med 90% och möjliggör jämförelse av parningsträning mellan två sterila eller Wolbachia-infekteradelinjer.
Introduction
Uppfödning och frisättning av sterila eller inkompatibla hanar för undertryckande av Aedes myggpopulationer utvärderas för närvarande på fältet som ett nytt verktyg för att förhindra utbrott av denguefeber och andra Aedes-burnasjukdomar1. Strategier för undertryckande av manligt frisättning som för närvarande finns i fältförsök inkluderar användning av dengenetiska metoden 2,bestrålning (steril insektsteknik, SIT)3, endosymbiotiska bakterier Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, eller en kombination av de två senareteknikerna 5,6. Framgången med dessa tillvägagångssätt är till stor del beroende av de frisläppta männens förmåga att konkurrera ut vilda män och söka kvinnor för att säkra kopulering. Annars kan sterilitet inte framkallas i målgruppen.
I ett klassiskt SIT-program kan till exempel manlig parningsträning påverkas av faktorer som bestrålningsdos7,8,9,massuppfostringsprotokoll och omfattningen av inavel ikolonin 10,11,12,13,14. Dessutom kan studier om parningskraften ge viktig kunskap om myggparningsbeteende som kan användas för att informera vektorkontrollstrategier.
I SIT och IIT bedöms parningskraften hos manliga myggor vanligtvis genom att tillåta både vildtyp och frisättningsstam att konkurrera om vilda kvinnor i en bur8,11,15,16. Kvinnor blodmatas sedan och deras ägg kläcks för att bestämma livskraften. Honor som lägger icke-livskraftiga ägg eller ägg med låg kläckhastighet antas ha parat sig med frisättningsstam hanar, medan honor som producerar livskraftiga ägg antas ha parat sig med vilda män. Parningskraften beräknas sedan med Fried Index17. Tyvärr är denna metod resurskrävande och tidskrävande, och det övergripande Fried Index kan påverkas av externa förvirrande faktorer som påverkar äggets livskraft som dålig ägghantering och överuttorkning kan resultera i en låg kläckningshastighet i kompatibilitetskorset som sedan kan leda till ett artificiellt lågt stekt index.
Dessutom tillåter denna metod inte direkt jämförelse av parningskonkurrensen mellan Aedes myggor som är infekterade med olika stammar av Wolbachia eller som utsätts för olika doser av bestrålning. Därför krävs en mer direkt metod för att ta itu med dessa utmaningar. Nyligengenomförda studier 18,19 har visat effektiviteten av att använda fluorescerande färgämnet, RhB, för att markera manliga myggors seminalvätska. Märkt seminalvätska överförs och lagras i de kvinnliga myggornas spermathecae vid framgångsrik parning, vilket möjliggör direkt mätning av kvinnlig parningsinteraktion med markerade män. Rhodamin B är ett tioreaktivt fluorfärgämne som ofta används som biomarkör för ekologiska och beteendemässiga forskningsstudier på djur inklusive insekter20. För myggstudier introduceras RhB genom utfodring med socker eller honungsvatten som innehåller upplöst RhB-pulver18,19,21,22,23,24. Vid upptag binder RhB-färgämnet till proteiner, färgar kroppsvävnad med en rödrosa fläck som fluorescerar ljusorange under en fluorescerande ljuskälla.
Den starka fluorescenssignalen och stabiliteten hos märkningen, i kombination med dess förmåga att färga insektssädesvätskor, möjliggör övervakning av överföringen av märkt seminalvätska från den märkta hanen till spermielagringsorganen hos den kvinnliga insekten för parningsstudier18,19,21,24. Användningen av RhB i en manlig parnings konkurrenskraftsanalys möjliggör inte bara direkt mätning av parningsinteraktionen hos kvinnor med antingen markerade och omärkta män, utan resultaten kan också erhållas inom 24 timmar eftersom det undanrömar processen för att bestämma äggets livskraft, vilket vanligtvis kräver cirka 10 till 14 dagar. Dessutom övervinner denna metod den potentiella förlusten av data när de kvinnliga myggorna inte blodmatar eller dör före ovipositioning. Detta är särskilt viktigt eftersom i semifältförsök, där kvinnliga myggor är benägna att skada och dö under efterparning samling med hjälp av en ryggsäck eller mekanisk aspirator. För att ta itu med de nuvarande begränsningarna med att använda kvinnlig fertilitet till presenterar vi en alternativ metod som använder RhB-färgning för att direkt mäta manlig myggparnings konkurrenskraft. Metoden förenklar arbetsflödet, förkortad experimentell tid från cirka två veckor till en dag, vilket gör det möjligt att utföra mer experimentella replikat och möjliggör jämförelse mellan två frisättningsstammar. Detta protokoll kommer att vara lämpligt för laboratorier som påbörjar manliga frisättningsbaserade myggpopulationsdämpningsprogram och kan användas för rutinmässig kvalitetskontroll och stamutvärdering.
Protocol
1. Uppfödning av myggor
- Utför all mygguppfödning och den manliga parningskraftsanalysen under normala insektsförhållanden på 27 ± 1 °C och 75-80% relativ fuktighet, med en fotoperiod på 12 h: 12 h ljus: mörka cykler.
- Ange de två uppsättningarna konkurrerande hanar som set A och set B för enkel referens i den metod som beskrivs i detta dokument. Bakre myggorna under standardiserade förhållanden för att säkerställa en rättvis jämförelse av deras kondition under analysen. Bakre myggorna vid en larvtäthet på 500 larver i 2 L vatten och mata dem med markfiskmatpulver ad libitum.
OBS: För genereringen av de representativa resultaten var set A och set B inavlade och outcross män av Wolbachia-infekterade Ae. Aegypti, respektive. - Sexhane- och honmyggor på pupalstadiet och innehåller dem separat i burar (se materialtabellen)av dimensionerna W 32,5 cm x D 32,5 cm x H 32,5 cm, med en maskstorlek på 150 x 150 och 160 μm bländare. Underhåll alla vuxna myggor med 10% sackaroslösning.
2. Förberedelse av manliga och kvinnliga myggor
- Kön manliga och kvinnliga myggor på poppstadiet enligt deras storleksskillnader (manliga puppor är mindre än kvinnliga puppor) (Figur 1).
- För varje uppsättning myggor (Set A eller Set B), överför 100 manliga puppar vardera till en förmärkt bur för sackarosmatning eller RhB-sackarosmatning.
- Placera honpupporna i små partier på 40-50 per bur. När imagoerna uppstår, kontrollera burarna för närvaron av manliga myggor.
OBS: Vuxna manliga myggor är mindre än kvinnor och har buskigare och hårigare antenner (Figur 2). Använd endast jungfruliga kvinnliga myggor för parning konkurrenskraftsanalyser. Användningen av pre inseminerade honor kommer att göra alla resulterande data ogiltiga. Således måste extrem försiktighet tas under sexing på poppstadiet. Använd inte de kvinnliga myggorna från en bur som har förorenats med manliga myggor. Extra burar av kvinnor bör förberedas.
3. Beredning av 0,2% RhB - sackaroslösning
OBS: RhB är ett grönt pulver i torr form och rödrosa i lösning. Personlig standardskyddsutrustning (PPE: laboratorieskyddsrock, nitrilhandskar och ögonskydd) ska bäras vid hantering av denna kemikalie. För att undvika inandning, väg RhB-pulvret i en rökhuv.
- För att förbereda en 0,2% w/v RhB-sackaroslösning, lös upp 200 mg RhB pulver för varje 100 ml 10% w/ v / sackaroslösning. Blanda väl för att säkerställa att allt pulver är upplöst.
OBS: Eftersom RhB är ljuskänsligt, använd bärnstensflaskor eller linda klara flaskor helt med aluminiumfolie.
4. Utfodring av manliga myggor
OBS: Data från RhB-sackaros utfodring optimering presenteras i kompletterande material, avsnitt 1.
- Förbered 20 sockermatarflaskor med en veke. Tillsätt 10 ml 10% sackaros i 10 matarflaskor och 10 ml 0,2% RhB-sackaroslösning i de andra 10 matarflaskorna (använd bärnstensflaskor eller linda flaskorna i aluminiumfolie).
- Placera matarflaskorna i respektive hanbur (5 flaskor per bur) som bereds i steg 2.2 och 2.3. Låt de manliga myggorna mata i tre dagar före parningsexperimentet.
5. Kontroll av RhB fluorescens i manliga myggor
- Aspirera RhB-sackarosmatade manliga myggor och observera dem under ett fluorescensstereomikroskop för att säkerställa att alla RhB-sackarosmatade manliga myggor framgångsrikt har märkts med RhB.
- Slå på kvicksilverbrännarlampan och stereomikroskopet. Låt ljuskällan på kvicksilverbrännaren stabiliseras i 10 minuter. Ställ in fluorescensfiltren för rött fluorescensprotein 1 (RFP1) (excitationsvåglängd 540 nm, emissionsvåglängd 625 nm).
- Aspirera ett litet antal myggor (fyra eller fem) åt gången i den orala aspiratorns glasrör. Genom glasröret, observera kroppen av de manliga myggorna under fluorescensstereomikroskopet. Uteslut manliga myggor som inte är märkta med RhB från experimentet.
OBS: Buken av manliga myggor märkta med RhB kommer att se rosa ut under vitt ljus (Figur 3A) och glöda ljusorange under fluorescerande ljus (Figur 3B). - Överför set A hanmyggor till 12 pappersmuggar säkrade med nät (nätstorlek 150 x 150, 160 μm bländare); 6 koppar vardera med 10 sackarosmatade manliga myggor och de andra 6 kopparna vardera med 10 RhB-sackarosmatade manliga myggor. Upprepa det här steget för Set B manliga myggor.
6. Analys av konkurrenskraften
- Ställ in 12 W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm burar med nätstorlek 44 x 32, 650 μm bländare för parningsanalysen. I var och en av de sex burarna, inkludera 10 Set A (RhB-märkta) manliga myggor, 10 Set B (omärkta) manliga myggor och 10 jungfruliga vilda kvinnliga myggor. I de andra sex burarna, inkluderar 10 Set A (omärkta) manliga myggor, 10 Set B (RhB-märkta) manliga myggor och 10 jungfruliga vilda kvinnliga myggor. Märk dessa burar för att tydligt skilja mellan de två parningskombinationerna.
OBS: Baserat på erfarenhet användes en 60 cm x 60 cm x 60 cm bur för parningsanalysen eftersom en mindre bur kan uppmuntra blandad parning. - Placera respektive koppar av män beredda i steg 5.4 i parningsburarna enligt etiketten i steg 6.1. Ta bort nätet och knacka försiktigt på koppen för att knuffa männen ut ur koppen. Ta försiktigt bort papperskoppen och nätet från buret för att säkerställa att inga myggor flyr från buret. Låt de manliga myggorna acklimatisera sig i parningsburen i minst en timme.
- Använd en oral aspirator, överför jungfruliga vilda kvinnliga myggor i 12 papperskoppar, med varje kopp som innehåller 10 myggor.
- Efter acklimatiseringsperioden för de manliga myggorna, överför en kopp honor till varje parningsbur och ta bort nätet. Jostle försiktigt koppen för att uppmuntra eventuella återstående kvinnliga myggor ur koppen. Ta försiktigt bort papperskoppen och nätet från buret för att säkerställa att inga myggor flyr från buret.
- Låt parning ske i 3 timmar.
OBS: Rekommenderad parningstid fastställdes genom tidigare observationer av vilda Ae. aegypti. I experiment med 10 honor och 20 män som hölls i en 60 cm x 60 cm x 60 cm bur uppnåddes 90% kvinnlig insemination i 3 h (Kompletterande material, avsnitt 2). Stör inte buret under denna period eftersom agitation kan leda till avbruten och blandad parning. Blandad parning (där honan har parat sig med både märkta och omärkta män) resulterar i en förspänning mot RhB-märkta män eftersom det är svårt att skilja omärkta spermier från RhB-märkta spermier under ett fluorescensmikroskop. - För att avsluta parningsexperimentet, ta bort alla myggor från varje bur med en mekanisk aspirator. Kall bedöva myggorna på is i minst 5 minuter. När myggorna är helt sövda, plocka försiktigt upp de kvinnliga myggorna och husera dem i en separat papperskopp säkrad med nät (nätstorlek 150 x 150, 160 μm bländare). Märk papperskoppen genom att överföra respektive etikett från parningsburen till papperskoppen.
OBS: Det är möjligt att pausa experimentet vid denna tidpunkt och behålla honorna med 10% sackaroslösning. Den RhB-märkta seminalvätskan kommer att förbli stabil inuti den kvinnliga spermathecaen i minst en vecka. Det är bäst att hålla kvinnorna vid liv innan dissekering som döda och uttorkade exemplar är svåra att dissekera. - För att få den kvinnliga spermathecaen bedövar kyla de kvinnliga myggorna på is i minst 5 minuter före dissekering under ett stereomikroskop (Video 1). Undersök spermathecaen under ett sammansatt ljusmikroskop (förstoring 100x) för deras inseminationsstatus (figur 4). För inseminerade individer, bestäm om spermathecae innehåller RhB-märkt seminalvätska genom att undersöka dem under fluorescensstereomikroskopet utrustat med ett RFP1-filter och ett kameraavbildningssystem.
OBS: Vid användning av ett fluorescensstereomikroskop med ett bifogat bildsystem rekommenderas att använda en förlängd exponeringstid (5 s) för att öka detektionskänsligheten. Om den kvinnliga myggan har parat sig med en märkt hane, kommer hennes spermathecae att fluorescera ljusorange (Figur 5A). Men om den kvinnliga myggan har parat sig med en omärkt hane, kommer hennes inseminerade spermathecae inte att fluorescera (Figur 5B).
7. Bortskaffande av RhB-avfall
- Behandla vattenhaltigt RhB-avfall med aktivtkol 25 innan det laddas ur som allmänt avloppsvatten. Kassera fast RhB-avfall (myggor märkta med RhB, pappershanddukar och vekar blötlagda med RhB) som kemiskt avfall. Använd inte standard PPE vid hantering av RhB-avfall.
Representative Results
w (på andra) AlbB-SG är en lokaliserad (Singapore) Ae. aegypti linje stabilt infekterad med wAlbB stam av Wolbachia. Med hjälp av protokollet som beskrivs i detta dokument utvärderade vi den manliga parnings konkurrenskraften hos en inavlad och en outcrossed linje av wAlbB-SG för att avgöra om inavel resulterar i en förlust i manlig parning fitness. Den inavlade linjen hade underhållits i 11 generationer i insektsmedlet, medan den överblivna linjen genererades genom att backcrossing honorna med vild typ manlig Ae. aegypti, det är jag. Hanar från de inavlade och outcrossed linjerna tävlades mot varandra för parning med vilda vilda typ kvinnliga Ae. aegypti. Parningstestet för konkurrenskraft genomfördes i tre exemplar.
Resultaten visade att RhB inte påverkade männens lämplighet eftersom uppgifterna för kvinnlig insemination inte var partiska mot eller mot parning med RhB-sackarosmatade män (tabell 1 och figur 6) Eftersom RhB inte påverkar männens parningsform, fortsätter vi att analysera uppgifterna baserat på andelen inseminerade kvinnor som paras av antingen den inavlade eller outcrossed linjen (tabell 2 och figur 7). Resultatet över de experimentella triplikaterna var konsekvent; det fanns en betydligt högre andel kvinnor parat med outcross män än med inavlade män i alla tre replikat (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Dessa resultat tyder på en potentiell förlust i manliga parning fitness efter flera generationer av inavel i laboratoriet.
Figur 1:Sidovy av manliga (vänster) och kvinnliga (höger) Aedes aegypti puppar. Under samma uppfödningsförhållanden kan Ae. aegypti könsbestämas på pupalstadiet beroende på storlek; män är betydligt mindre än kvinnor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Differentiering av vuxna män (vänster) och kvinnor (höger) Aedes aegypti. Vuxna manliga myggor (vänster) har buskigare och hårigare antenner än den vuxna kvinnan; de röda pilarna indikerar antennerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Rhodamin B-märkning av hanmygga. B)Fluorescensmikroskopi. Myggan till vänster är omarkerad (matas med 10% w/v sackaros), medan den till höger är markerad (matas med 0,2% RhB-sackaros). Märkta myggor har en synlig rosa buk under vitt ljus (myggan till höger i A), som fluorescerar ljusorange under fluorescensmikroskopi (B). Skalstänger = 5 mm. Förkortning: RhB = Rhodamine B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:Inseminerad och icke-inseminerad kvinnlig spermathecae under ett sammansatt ljusmikroskop (100x förstoring). Inseminationsstatusen hos en kvinnlig mygga kan bestämmas genom att observera dess spermathecae under ett sammansatt ljusmikroskop. En inseminerad kvinnlig mygga kommer att innehålla minst en fylld spermatheca medan alla tre spermathecae av en icke-inseminerad kvinnlig mygga kommer att vara tom. Trådliknande, motila spermier kommer att vara synliga i en fylld spermatheca under ett sammansatt ljusmikroskop. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:Kvinnlig mygga spermathecae inseminerad med seminalvätskor under ett fluorescensstereomikroskop. (A) RhB-märkt och (B) omärkt spermathecae inseminerad med RhB-märkta seminalvätskor kommer att fluorescera ljusorange under fluorescensmikroskopi. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Antal vilda honor som inseminerats av antingen de inavlade eller outcrosshanarna i de experimentella triplicaterna med ömsesidig märkning. (A) De inavlade hanarna var märkta med RhB medan outcrosshanarna var omarkerade. B) Outcross-männen var märkta med RhB medan de inavlade männen var omarkerade. Ett högre antal honor observerades ha parat sig med outcross män oavsett deras märkning status. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Andel inseminerade honor parat med inavlade eller outcrosshanar i de 3 experimentella replikaten. För varje experimentell replikat finns det en betydligt högre andel honor parat med outcross-hanarna (P ≤ 0,05, Mann-Whitney U-test). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Dissekering av kvinnliga Aedes aegypti för spermathecae under ett lätt stereomikroskop. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| ♀ x Inavlade (RhB) ♂ a | ♀ x Outcross (omarkerad) ♂ b | ♀ x Inavlade (omarkerade) ♂ c | ♀ x Outcross (RhB) ♂ d | Total inseminationsgrad (a+b+c+d/120) |
|
| Replikera 1 | 11 | 35 | 7 | 40 | 77.5% (93/120) |
| Replikera 2 | 6 | 29 | 8 | 31 | 61.7% (74/120) |
| Replikera 3 | 6 | 36 | 6 | 33 | 67.5% (81/120) |
Tabell 1: Antal honor parat med RhB-märkta och omarkerade wAlbB-Sg Aedes aegypti inavlade och outcross män. Totalt användes 120 honor i varje replikat.
| Procent inseminerade honor | ||
| Inavlade män | Outcross män | |
| Replikera 1 | 19% (18/93) | 81% (75/93) |
| Replikera 2 | 19% (14/74) | 81% (60/74) |
| Replikera 3 | 15% (12/81) | 85% (69/81) |
Tabell 2: Procentandel inseminerade honor parat med wAlbB-Sg Aedes aegypti inavlade och outcross män.
Kompletterande figur S1: Jämförelse av arbetsflödet för RhB-baserad och konventionell parning konkurrenskraftsanalys. Jämfört med den konventionella analysen av parningskraften minskar det förenklade och förkortade arbetsflödet för RhB-baserad konkurrensanalys för parning avsevärt försökstiden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Kaplan Meier överlevnadskurvor av manliga vuxna Aedes aegypti under och efter utfodring med 0,2% och 0,4% rhodamin B-sackaros utfodring. Procent överlevnad av (A) manlig vildtyp och (B) wAlbB-Sg Ae. aegypti under och efter tre dagars utfodring på 0,2% och 0,4% RhB-sackaros, jämfört med kontroller som endast matades med sackaros. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S1: Inseminationshastighet för kvinnor i en W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm bur (förhållandet mellan 10 honor och 20 hanar) vid 1-, 2- och 3-h-tidpunkter. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Märkning används ofta i entomologisk forskning för att studera insektspopulationsdynamik, spridning, beteende och parningsbiologi26. I SIT- och IIT-program utförs märkning för att skilja frisättningsstammen från fältpopulationen för att studera deras spridning och optimera frisättningsförhållandet. De märkningsmetoder som används inkluderargenetisk märkning 27,28, som innehåller isotoper i larvmat29,30,fluorescerandedamm 31ochfärgämne 32. För undertryckande av myggpopulationer med SIT eller IIT, där manlig parningsträning är en kritisk komponent, har fluorescerande färgämnen använts som markörer för att studera myggparningsbiologi18,19.
Konventionellt har bedömningen av manlig parning konkurrenskraft av frisättningsstammen bedömts med hjälp av kvinnliga fertilitetsanalyser. Denna analys är dock tidskrävande och arbetsintensiv på grund av nedströms experimentella processer efter parning (Kompletterande figur S1). Dessa processer inkluderar blodmatning av kvinnorna, äggsamling, kläckning av äggen och uppräkning av andelen kläckta ägg för att bestämma äggets livskraft. I genomsnitt kräver denna analys 30 mantimmar och två veckors experimentellt arbete (från inrättandet av konkurrenskraftsanalysburarna) till den slutliga bestämningen av manlig parnings konkurrenskraft.
hans papper presenterar användningen av ett fluorescerande färgämne, RhB, (matas som 0,2% RhB-sackaros till myggorna, kompletterande figur S2) för att direkt mäta parningsinteraktioner mellan honor och RhB-märkta män. Även om detta protokoll kräver ett fluorescensstereomikroskop, undanröter det behovet av att utföra de tidskrävande experimentella procedurer som nämns ovan. I genomsnitt kräver denna RhB-baserade analys cirka 10 mantimmar och ungefär en dag för att få data som motsvarar dem från kvinnliga fertilitetsanalyser. Detta >90% tidsbesparingar gör det möjligt för forskare att utföra flera experimentella replikat, vilket ger en mer robust validering av manlig parningsträning. Dessutom kan denna analys användas för att jämföra parningskonkurrenskraften mellan två sterila eller Wolbachia-infekterade mygglinjer.
Denna typ av jämförelse är inte möjlig med konventionella kvinnliga fertilitetsanalyser, eftersom kvinnor skulle ge icke-livskraftiga ägg vid parning med båda sådana linjer. Trots detta kommer varje blandad parning i experimentet att resultera i partiskhet mot den markerade populationen eftersom det är svårt att identifiera omärkta spermier i kvinnliga spermathecae som innehåller seminalvätska från både RhB-märkta och omärkta män. En liknande slutsats gjordes i en studie som utvärderade parning konkurrenskraften hos Anopheles gambiae med RhB18, varigenom en större andel kvinnor i parningsanalysen befanns paras av markerade män. Eftersom polyandry är mer sannolikt att uppstå hos kvinnor som tidigare hade engagerat sig i en avbrutenparning 33, minskade sannolikheten för att detta inträffar i denna studie genom att använda färre myggor (20 män till 10 honor) i en större burvolym (0,216 m3) i dessa experiment.
Resultaten visade ingen partiskhet mot den RhB-märkta populationen, vilket tyder på att blandad parning var begränsad. Sammanfattningsvis är införlivandet av RhB för att markera män i en parning konkurrenskraftsanalys ett ekonomiskt och snabbt sätt att utvärdera manlig parnings kondition. Denna metod möjliggör också en direkt jämförelse av parningskonkurrensen mellan män som utsätts för olika doser av bestrålning, uppfödda i olika uppfödningssystem, eller de som är infekterade med olika stammar av Wolbachia, vilket gör det till ett värdefullt verktyg för utvärdering av manlig parningskondition för alla manliga frisättningsbaserade myggpopulationsdämpningsprogram.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av National Environment Agency (NEA), Singapore. Vi tackar Chew Ming Fai, vice verkställande direktör (folkhälsa), NEA, för hans godkännande att publicera studien, och A/Prof Ng Lee Ching, gruppchef (Environmental Health Institute Group), NEA, för hennes stöd i denna studie. Vi tackar också Dr Shuzhen Sim och Dr Denise Tan för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
| Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
| Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
| Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
| 6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
| Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
| Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
| Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
| TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |
References
- Achee, N. L., et al. A critical assessment of vector control for dengue prevention. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003655 (2015).
- Carvalho, D. O., et al. Suppression of a field population of Aedes aegypti in Brazil by sustained release of transgenic male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003964 (2015).
- Lees, R. S., Gilles, J. R. L., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B., Bourtzis, K. Back to the future: the sterile insect technique against mosquito disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 156-162 (2015).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R. L., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II--A safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), 0135194 (2015).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- Balestrino, F., et al. Gamma ray dosimetry and mating capacity studies in the laboratory on Aedes albopictus males. Journal of Medical Entomology. 47 (4), 581-591 (2010).
- Bellini, R., et al. Mating competitiveness of Aedes albopictus radio-sterilized males in large enclosures exposed to natural conditions. Journal of Medical Entomology. 50 (1), 94-102 (2013).
- Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G.
- Aldersley, A., et al. Too "sexy" for the field? Paired measures of laboratory and semi-field performance highlight variability in the apparent mating fitness of Aedes aegypti transgenic strains. Parasites & Vectors. 12 (1), 357 (2019).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malaria Journal. 8 (2), 4 (2009).
- Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56124 (2017).
- Ross, P. A., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. A comprehensive assessment of inbreeding and laboratory adaptation in Aedes aegypti mosquitoes. Evolutionary Applications. 12 (3), 572-586 (2019).
- Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3294 (2014).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Bourtzis, K., Gilles, J. R. Combining the sterile insect technique with the incompatible insect technique: III-Robust mating competitiveness of irradiated triple Wolbachia-infected Aedes albopictus males under semi-field conditions. PloS One. 11 (3), 0151864 (2016).
- Fried, M.
- Aviles, E. I., Rotenberry, R. D., Collins, C. M., Dotson, E. M., Benedict, M. Q. Fluorescent markers rhodamine B and uranine for Anopheles gambiae adults and matings. Malaria Journal. 19 (1), 236 (2020).
- Johnson, B. J., et al. Use of rhodamine B to mark the body and seminal fluid of male Aedes aegypti for mark-release-recapture experiments and estimating efficacy of sterile male releases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005902 (2017).
- Fisher, P. Review of using rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Blanco, C. A., Perera, O., Ray, J. D., Taliercio, E., Williams, L. Incorporation of rhodamine B into male tobacco budworm moths Heliothis virescens to use as a marker for mating studies. Journal of Insect Science. 6, 5 (2006).
- Mascari, T. M., Foil, L. D. Laboratory evaluation of the efficacy of fluorescent biomarkers for sugar-feeding sand flies (Diptera: Psychodidae). Journal of Medical Entomology. 47 (4), 664-669 (2014).
- Sarkar, D., Muthukrishnan, S., Sarkar, M. Fluorescent marked mosquito offer a method for tracking and study mosquito behaviour. International Journal of Mosquito Research. 4, 5-9 (2017).
- South, A., Sota, T., Abe, N., Yuma, M., Lewis, S. M. The production and transfer of spermatophores in three Asian species of Luciola fireflies. Journal of Insect Physiology. 54 (5), 861-866 (2008).
- Üner, O., Geçgel, Ü, Kolancilar, H., Bayrak, Y. Adsorptive removal of rhodamine B with activated carbon obtained from okra wastes. Chemical Engineering Communications. 204 (7), 772-783 (2017).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: current techniques and future prospects. Annual Review of Entomology. 46, 511-543 (2001).
- Scolari, F., et al. Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae). New Biotechnology. 25 (1), 76-84 (2008).
- Ahmed, H. M. M., Hildebrand, L., Wimmer, E. A. Improvement and use of CRISPR/Cas9 to engineer a sperm-marking strain for the invasive fruit pest Drosophila suzukii. BMC Biotechnology. 19 (1), 85 (2019).
- Botteon, V., Costa, M. L. Z., Kovaleski, A., Martinelli, L. A., Mastrangelo, T. Can stable isotope markers be used to distinguish wild and mass-reared Anastrepha fraterculus flies. PloS One. 13 (12), 0209921 (2018).
- Hood-Nowotny, R., Mayr, L., Islam, A., Robinson, A., Caceres, C. Routine isotope marking for the Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 102 (3), 941-947 (2009).
- Schroeder, W. J., Mitchell, W. C. Marking Tephritidae fruit fly adults in Hawaii for release-recovery studies. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 23 (3), 437-440 (1981).
- Akter, H., Taylor, P. W., Crisp, P. Visibility and persistence of fluorescent dyes, and impacts on emergence, quality, and survival of sterile Queensland fruit fly Bactrocera tryoni (Diptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 113 (6), 2800-2807 (2020).
- Oliva, C. F., Damiens, D., Benedict, M. Q. Male reproductive biology of Aedes mosquitoes. Acta Tropica. 132, Suppl 12-19 (2014).
