Summary
Den kroniske psykosociale stress (CGS) paradigme beskæftiger klinisk relevante stressfaktorer under graviditet hos mus til model psykiatriske lidelser hos mødre og spædbørn. Her tilbyder vi en trinvis procedure for anvendelse af CGS-paradigme- og downstream-vurderingerne for at validere denne model.
Abstract
Peripartumperioden betragtes som en følsom periode, hvor negative modereksponeringer kan resultere i langsigtede negative konsekvenser for både mor og afkom, herunder udvikling af neuropsykiatriske lidelser. Risikofaktorer i forbindelse med fremkomsten af affektiv dysregulering i maternel-spædbarn dyad er blevet grundigt undersøgt. Eksponering for psykosocial stress under graviditet har konsekvent vist sig som en af de stærkeste prædiktorer. Flere gnavermodeller er blevet oprettet for at udforske denne forening; Disse modeller er imidlertid afhængige af brugen af fysiske stressorer eller et begrænset antal psykosociale stressorer, der præsenteres på en gentagen måde, som ikke nøjagtigt fanger typen, intensiteten og hyppigheden af stressorer, der opleves af kvinder. For at overvinde disse begrænsninger blev der genereret et kronisk psykosocialt stressparadigme (CGS), der anvender forskellige psykosociale fornærmelser af forskellig intensitet præsenteret på en uforudsigelig måde. Manuskriptet beskriver denne roman CGS paradigme, hvor gravide kvindelige mus, fra svangerskabsdag 6,5 til 17,5, udsættes for forskellige stressfaktorer i løbet af dagen og natten over. Dag stressorer, to om dagen adskilt af en 2 timers pause, spænder fra eksponering for fremmedlegemer eller rovdyr lugt til hyppige ændringer i strøelse, fjernelse af sengetøj, og bur vippe. Natten stressfaktorer omfatter kontinuerlig lyseksponering, skiftende bur kammerater, eller betting strøelse. Vi har tidligere vist, at eksponering for CGS resulterer i udviklingen af moderens neuroendokrine og adfærdsmæssige abnormiteter, herunder øget stressreaktivitet, fremkomsten af fragmenterede moderplejemønstre, anhedonia og angstrelateret adfærd, kernefunktioner hos kvinder, der lider af perinatal stemning og angstlidelser. Denne CGS-model bliver derfor et unikt værktøj, der kan bruges til at belyse molekylære defekter, der ligger til grund for moderens affektive dysregulering, samt trans-placentale mekanismer, der påvirker fosterneuroudvikling og resulterer i negative langsigtede adfærdsmæssige konsekvenser hos afkom.
Introduction
De mekanismer, der ligger til grund for øget modtagelighed for neuropsykiatriske lidelser hos mødre og spædbørn efter negative mødreeksponeringer i peripartumperioden, er stort set ukendte. Væsentlige morlige fysiologiske ændringer opstår under graviditeten og overgangen til postpartumperioden, herunder flere neuroendokrine tilpasninger, der er hypoteser for at være kritiske ikke kun for sund afkom neuroudvikling, men også for at bevare moderens mentale sundhed1,2. På niveau med den maternel hypothalamic hypofyse binyre (HPA) akse observeres tilpasninger i både døgnrytmen og stressinducerede niveauer af glucocorticoidudslip, herunder en mere fladt rytme af døgnfarvet HPA-akseaktivitet og dæmpet HPA-akserespons på akutte stressorer3,4,5. I betragtning af at øget HPA-akseaktivitet rapporteres hos en delmængde af kvinder med postpartum-affektiv dysregulering, herunder øgede niveauer af cirkulerende glucocorticoider og hæmmet negativ feedback6,7,8,eksponering for stressorer, der resulterer i øget postpartum stressreaktivitet og forhindrer hpa-aksetilpasninger hos mødre, menes at øge modtageligheden for neuropsykiatriske lidelser.
For at belyse virkningerne af stress på affektiv dysregulering hos mødre og spædbørn er der genereret flere gnavermodeller af stress i peripartumperioden. Et flertal af disse modeller er kendetegnet ved anvendelse af fysiske stressorer, der resulterer i homeostatiske udfordringer og ændringer i dæmningens fysiologiske status9, såsom kronisk tilbageholdenhedsstress10 og svømmestress under svangerskab11eller postpartum chokeksponering12. Selv om disse paradigmer har vist sig at resultere i fremkomsten af postpartum depressive-lignende adfærd og ændringer i moderens pleje10,11,12, de har været begrænset af deres manglende evne til præcist at fange den psykosociale karakter af stressorer, der almindeligvis opleves af menneskelige mødre. Dette bliver især vigtigt, når man forsøger at afsløre de neuroendokrine konsekvenser af kronisk stress i peripartumperioden, da behandling af forskellige typer stressorer menes at være medieret af forskellige neurale netværk, der orkestrerer HPA-akseaktivering9.
For at overvinde denne begrænsning har flere grupper designet stressparadigmer, der anvender psykosociale fornærmelser eller en kombination af fysiske og psykosociale stressorer. Moderens separationsmodel, hvor dæmninger er adskilt fra hendes hvalpe i flere timer om dagen i postpartumperioden13,14, og den kroniske sociale stressmodel, hvor dæmningerne udsættes for en mandlig ubuden gæst i nærværelse af deres kuld15,16, har været i stand til at reproducere fremkomsten af abnormiteter i moderpleje og depressive-lignende fænotyper forbundet med fysiske stressparadigmer. Den kroniske ultramild stress paradigme, hvor gravide kvindelige mus er udsat for en række psykosociale fornærmelser, herunder bur tilt og natten belysning, samt betydelige fysiologiske fornærmelser, såsom tilbageholdenhed stress og fødevarebegrænsning, har yderligere afsløret eksponering for en blandet karakter af stressorer resulterer i abnormiteter i moderens adfærd, herunder svækkelser i moderens aggression, samt dysregulering i døgnrytmen aktivitet HPA akse17,18. I overensstemmelse med disse resultater resulterer en vekslende fastholdelsesstress og overbelægningsmodel under svangerskabet i stigninger i postpartum maternal circadian corticosterone niveauer samt ændringer i moderplejen, selv om der ikke observeres nogen forskelle i HPA-aksen reaktivitet efter postpartum eksponering for nye akutte fornærmelser1.
En udvidelse af dette arbejde, der genererer et svangerskabsmæssigt stressparadigme, der anvender flere psykosociale fornærmelser præsenteret på en uforudsigelig måde og minimerer brugen af fysiologiske stressorer. Undersøgelser har tidligere vist, at dette kroniske psykosociale stressparadigme (CGS) resulterer i udviklingen af moderens HPA-akse dysfunktion, herunder øget stressreaktivitet i den tidlige postpartumperiode19. Disse ændringer er forbundet med abnormiteter i moderens adfærd, herunder ændringer i kvaliteten af moderpleje modtaget af hvalpe, og fremkomsten af anhedoniske og angstlignende adfærd19, funktioner i overensstemmelse med perinatal stemning og angstlidelser20,21. Desuden afkom vægtøgning reducerer i løbet af postnatal periode efter in-utero eksponering for CGS19, tyder CGS kan have vedvarende negative programmering virkninger i fremtidige generationer.
Målet med at udvikle CGS paradigme var primært at udnytte klinisk relevante stressfaktorer, som præcist fange den type, intensitet og hyppighed af fornærmelser ofte forbundet med neuroendokrine dysregulering og udvikling af perinatal stemning og angstlidelser. Her giver undersøgelsen en detaljeret protokol over, hvordan gravide hunmus udsættes for CGS, samt downstream-vurderinger, der kan bruges til at teste modellens gyldighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Medical Center og var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer. Ad libitum adgang til standard gnaver chow og vand blev givet til enhver tid til mus, herunder under CGS paradigme. Mus blev anbragt på en 14 timer / 10 h lys-mørk cyklus (lys på 06:00 h), medmindre andet er angivet (dvs. udsættelse for lys natten over).
1. Forberedelse til tidslte parringer
- Mindst 2 uger før opsætning af tidsinddelte parringer skal du huse de voksne hunmus sammen i et standard musebur (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), fire mus pr. Bur. Mærk hver kvindelig mus med et specifikt ID-nummer via et øremærke.
BEMÆRK: C57BL6 hunmus uden forudgående graviditet og mellem 3 og 6 måneder blev brugt til denne protokol. - Mindst 1 uge før opsætning af tidsoplagte parringer huser de voksne hanmus, der skal bruges til parring.
2. Opsætning af tidsoplagte parringer
- Sæt de tidsoplagte parringer op kl. Tag to kvindelige mus og læg dem inde i et bur, der holder en individuelt opstaldet mandlig mus. Adskil de tidsperler parringer den følgende morgen med 08:00 h.
3. Kontrol af copulatory stik, udpeget som svangerskabsdag 0,5 (G0,5)
- Umiddelbart efter adskillelse af tidsinddelte parringer skal du kontrollere tilstedeværelsen af et copulatory stik i de kvindelige mus. Tilstedeværelsen af en copulatory stik vil markere G0.5. Lad musen holde trådgitteret inde i buret og forsigtigt løfte det ved halen for at visualisere vaginal åbning.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af et copulatory stik indikerer seksuel aktivitet er opstået, men garanterer ikke en graviditet. Når du forsøger at beregne antallet af forsøgsmus, der er nødvendige, skal du forvente, at 50% af musene tilsluttes fra tidsoplagte parringer og en graviditet for at tilslutte forekomsten på 60%-70%. - Brug simpel visuel undersøgelse til at identificere tilstedeværelsen af en copulatory plug (en uigennemsigtig hvidlig hærdet masse inden for eller lidt fremspringende fra vaginal åbning). Hvis copulatory stikket ikke er let identificeres ved simpel visuel undersøgelse, forsigtigt indsætte en stump ende sonde i vaginal åbning. Identificer stik placeret længere tilbage i skeden ved modstanden af sonde indsættelse.
- Adskil de kvindelige mus med copulatory stik og gruppehus i standard musebure, 3 til 4 mus pr. Bur.
4. Forberedelse til CGS paradigme
- Tilfældigt tildele bure boliger kvindelige mus med copulatory stik i to grupper på G5.5: Control og CGS gruppe. Forsøg at randomisere bure for at have et omtrent lige antal mus pr. Gruppe. Overfør musene for at rengøre standard musebure og mærke med et "forstyr ikke" tegn. Udpeg disse bure som "hjemmebure" for mus at placere dem i slutningen af hver stressor.
- Udpege et separat rum i musen facilitet til at udføre CGS paradigme. Design en 11-dages stressor regime, der løber fra G6.5 til G17.5, til at udnytte hver af de 7 dages stressorer [eksponering for fremmedlegemer (kugler eller legos), rovdyr lugt eksponering (beskidt rotte strøelse), 30 ° bur tilt, hyppige ændringer af sengetøj, strøelse fjernelse, bevægelse på shaker] to gange om dagen, og at udnytte hver af de 3 nat stressorer (natten lys på, bur mate forandring, udsættelse for vådt sengetøj) natten over på en tilfældig måde. Du kan finde en mulig prøveplan og et skema over eksperimenter som beskrevet nedenfor i figur 1.
BEMÆRK: Hver dag skal stressoren falde inden for musens lyscyklus (lys på 06:00 h-20:00 h) og vare 2 timer med mindst 2 timers pause mellem stressorer. Hver nat stressor bør sættes op i begyndelsen af den mørke cyklus (lys slukkes 20:00 h) og adskilles i starten af lys cyklus (lys på 06:00 h).
5. Udførelse af CGS paradigme
- Opret specifikke stressfaktorer på et standard statisk bur med filtreret top og vandflaske i det rum, der er udpeget til CGS-paradigmet. Forbered antallet af statiske bure, der er nødvendige for forsøget, afhængigt af antallet af musebure, der er udpeget til at gennemgå CGS under randomisering. Før du starter hver stressor, skal du overføre museburene i CGS-gruppen fra boligrummet til CGS-rummet.
BEMÆRK: Udfør håndtering/overførsel af mus fra hjemmeburet til forsøgsburet og tilbage i laminar flowhætter. - Påfør følgende stressfaktorer i henhold til det foruddesignede regime (se trin 4.2).
- Udsættelse for fremmedlegemer (marmor eller lego): Placer seks kugler (14 mm i diameter) eller seks legos (forskellige former, ikke at overstige 4 cm i højden) tilfældigt fordelt i en ren statisk bur med mus strøelse, uden at medtage musen nestlets. Placer musene sammen med deres hjemmebur kolleger i det statiske bur med fremmedlegemer i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
BEMÆRK: Rengør fremmedlegemer efter brug. - Predator lugt eksponering (beskidt rotte strøelse): Placer 1 cm i dybden af friske beskidte rotte strøelse fra kvindelige rotter i en ren statisk bur uden mus strøelse, uden at medtage musen nestlets. Placer musene sammen med deres hjemmebur kolleger i det statiske bur med beskidt rotte sengetøj i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- 30° burhældning: Placer musene med deres modstykker til hjemmeburet i et rent statisk bur med musestrøelse uden at medtage muse nestlets. Vip buret ved 30° mod væggen i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Hyppige ændringer af strøelse: Placer musene med deres hjemmebur kolleger i et rent statisk bur med musestrøelse, uden at inkludere musen nestlets. Udskift musestrøe med rent musestrøelse hvert 10. minut i 2 timer. Under musestrøelse ændres, skal du forsigtigt placere musene i et andet rent bur for at undgå direkte kontakt med musene. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Fjernelse af sengetøj: Placer musene sammen med deres hjemmeburkolleger i et tomt rent statisk bur (uden musestrøelse eller nestlets) i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Bevægelse på shaker: Placer musene med deres hjemmebur kolleger i en ren statisk bur med mus strøelse, uden at medtage musen nestlets. Placer det statiske bur oven på en gensidig lab shaker indstillet til 140 slag per min i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Natten over udsættelse for lys: Placer musene med deres hjem bur kolleger i en ren statisk bur med mus strøelse, uden at medtage musen nestlets. Hold lyset tændt natten over (20:00 h-06:00 h) for at forstyrre mørk cyklus. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Cage mate forandring: Overfør musen til en ren statisk bur med mus strøelse, som er ved at blive opstaldet af en anden gruppe af to kvindelige mus (intakt hunner ikke en del af behandling eller kontrol gruppe). Hold musen i det statiske bur med ukendte burkammerater natten over. Returner musen til sit hjemmebur med sine specifikke hjemmeburmodparter ved stressorens konklusion.
- Udsættelse for vådt sengetøj: Fyld det statiske bur med musestrøelse med rent vand, der holdes ved 24 °C, indtil strøelse er mættet med vand. Placer musene sammen med deres hjemmebur kolleger i det statiske bur med vådt sengetøj natten over. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Udsættelse for fremmedlegemer (marmor eller lego): Placer seks kugler (14 mm i diameter) eller seks legos (forskellige former, ikke at overstige 4 cm i højden) tilfældigt fordelt i en ren statisk bur med mus strøelse, uden at medtage musen nestlets. Placer musene sammen med deres hjemmebur kolleger i det statiske bur med fremmedlegemer i 2 timer. Returner musene til deres hjemmebur med de samme modstykker ved stressorens konklusion.
- Under CGS paradigme, holde kontrol mus uforstyrret i deres hjem bure inde i boligrummet.
- Udskift de brugte hjemmebure med nye hjemmebure på G10.5. På G17.5, ved afslutningen af natten stressor, enkelt-hus alle de eksperimentelle mus til at forberede sig til parturition og downstream funktionelle vurderinger.
6. Overvågning af forsøgsmus under CGS-paradigmet
- Overvåg musene hver 1. time under stressorapplikationen, undtagen under stressfaktorer natten over.
- Ekskluder mus, der udviser nødsignaler, herunder sår, sløvhed eller fysisk abnormitet fra eksperimentet. Kontakt veterinærpersonalet efter behov.
7. Måling af den procentvise kropsvægtforøgelse under svangerskabet hos forsøgsmusene (valgfrit)
- På G6.5 vejes musene individuelt før eksponering for stressorer. På G17.5, ved afslutningen af natten stressor, vejer musene individuelt. Afveje kontrolmusene på de tilsvarende svangerskabspunkter.
- Mål den procentvise kropsvægtøgning under svangerskabet ved at indstille vægten af den første dag i CGS paradigme (G6.5) som 100%.
8. Måling af postpartum relative binyrerne vægte i eksperimentelle mus (valgfrit)
- På postpartum dag 2 (PP2), vejer kontrol og CGS dæmninger individuelt. Aflive dæmninger ved kuldioxid indånding efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation i en røg hætte.
- Placer musene på en dissektion plade, sterilisere abdominalområdet med 70% ethanol, og åbne bughulen ved hjælp af en saks til at gøre en lodret snit. Isoler binyrerne placeret ved siden af den forreste pol i nyrerne med pincet, bilateralt. Disseker forsigtigt fedtvævet omkring binyrerne under et dissekerende mikroskop.
- Afvej de bilaterale binyrerne individuelt. Beregn den relative binyrerne vægt i milligram per gram (samlet vægt af højre og venstre binyrerne / kropsvægt).
9. Måling af postpartum hypothalamic hypofyse adrenal (HPA) akse aktivitet i de eksperimentelle mus (valgfrit)
- Som forberedelse til HPA-aksemålinger aflives kuld til 6 unger pr. kuld på postpartumdag 0 (PP0). Brug kuldioxid indånding, efterfulgt af halshugning med kirurgisk saks som en sekundær metode til aktiv dødshjælp.
- På postpartum dag 2 (PP2), individuelt fastholde kontrol og CGS dæmninger inde i et godt ventileret 50 mL polypropylen konisk rør i 20 min. Umiddelbart efter fastholdelsesspændingen skal du fjerne musen fra det koniske rør og fastholde musen med den ikke-dominerende hånd ved at holde den løse hud over skuldrene og bagest til ørerne for at få huden over mandiblen stram.
- Punktere den submandibulære vene med en lancet lidt bag underkæben, men forreste til øregangen. Opsamling af op til 100 μL moderblod i et serumseparatorrør. Efter prøveopsamlingen påføres blidt tryk med gaze på punkteringsstedet for at stoppe blødningen. Sæt dæmningerne tilbage i hjemmeburet, når blødningen stopper.
- Centrifuge serumseparatorrøret ved 21.130 x g i 6 minutter og fjern forsigtigt serumet. Serummet opbevares ved -20 °C til senere brug. Serummets kortikosteronkoncentration måles med et ELISA-sæt efter producentens protokol.
10. Måling af adfærdsændringer efter fødslen hos forsøgsmusene (valgfrit)
- For at forberede adfærdsanalysen, frasortering kuld til 6 hvalpe pr kuld på PP0.
- Udfør analyse af opsplitningen af mødreplejen fra PP2 til PP5. På hver dag, under lyscyklussen, udsætte dæmningerne for testrummet i en 5 minutters tilvænningsperiode, før de videooptagelser moderens adfærd i en 30 minutters periode.
- Vurder frasplitningen af mødreplejen ved at måle den gennemsnitlige længde af en individuel slikke-/plejekamp og det samlede antal anfald udført af dæmninger19.
BEMÆRK: Slikke / grooming adfærd er defineret som en adfærd, hvor dæmningen er ved at komme i kontakt med hvalpens krop med tungen, eller hvalpen bliver håndteret af dæmningen med hendes forepaws. En kamp er defineret som en uafbrudt periode, hvor dæmningen er involveret i slikke / grooming af hendes hvalpe.
- Vurder frasplitningen af mødreplejen ved at måle den gennemsnitlige længde af en individuel slikke-/plejekamp og det samlede antal anfald udført af dæmninger19.
- Foretage analyse af anhedonia via saccharosepræferencetest (SPT) fra PP0 til PP6. Udsætte dæmningerne for en 100 ml flaske rent vand og en 100 ml flaske 4% saccharoseopløsning i deres hjemmebur. Mængden af vand og saccharose, der forbruges (i mL), måles dagligt. Udskift flaskeplaceringen i hjemmeburet. Saccharosepræferencen beregnes ud fra gennemsnittet fra de sidste 4 dage: præferencepc = [(saccharoseforbrug / saccharose + vandforbrug) x 100].
- Udfør analyse af angst-lignende adfærd via forhøjet nul labyrint (EZM) på PP8. Placer dæmningerne individuelt på EZM-apparatet bestående af to lukkede kvadranter og to åbne kvadranter forhøjet fra gulvet. Lad dæmningerne udforske labyrinten uforstyrret i 5 minutter. Kvantificere den tid, der bruges i den åbne kvadrant, og antallet af indgange til de åbne kvadranter.
11. Måling af postnatal afkom vægtændringer (valgfrit)
- For at forberede afkom vægtanalyse, frasortering kuld til 6 hvalpe pr kuld på dagen for fødslen (postnatal dag 0, PN0).
- Optag vægten af unger på PN0 og på forskellige tidspunkter i den postnatale periode (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At udsætte de gravide hunmus for CGS resulterer i ændringer i kroniske stressrelevante parametre, herunder en reduktion i kropsvægtforøgelsen under graviditeten (figur 2A) og øget binyrerne i den tidlige postpartumperiode (figur 2B)19. Vigtigere er det, at eksponering for CGS resulterer i postpartum abnormiteter i moderens neuroendokrine funktion. CGS-dæmninger udviser en hyperaktiv HPA-akse, som det fremgår af de øgede kortikosteronniveauer for serum efter anvendelse af en ny akut fornærmelse (figur 3)19.
At udsætte de gravide hunmus for CGS resulterer yderligere i adfærdsmæssige abnormiteter i den tidlige postpartumperiode, der ser ud til at afspejle fremkomsten af en depressiv-lignende fænotype. CGS-dæmninger viser ændringer i moderplejen, hvilket afspejles i en stigning i graden af fragmentering af modersignaler modtaget af hvalpene. Den gennemsnitlige varighed af slikke / grooming anfald er reduceret og forbundet med en stigning i det gennemsnitlige antal anfald efter CGS, hvilket indikerer mange korte episoder af pleje adfærd (Figur 4A, B)19. Saccharosepræferencen er også trykket i CGS-dæmninger sammenlignet med kontroldæmninger, hvilket tyder på tilstedeværelsen af anhedoni (figur 4C)19. Endelig viser CGS-dæmningerne også øget angstrelateret adfærd målt ved en reduktion i den tid, der bruges i EZM's åbne kvadranter sammenlignet med kontroldæmninger (Figur 4D)19.
Hos afkommet resulterer eksponering for CGS in-utero i nedsat vægtforøgelse i den postnatale periode, fra postnatal dag 7 til 21, selv om der ikke observeres nogen ændringer ved fødslen. Denne reduktion i kropsvægtforøgelsen er til stede hos afkom af begge køn (figur 5)19. Bemærk, at CGS-paradigmet ikke havde nogen effekt på svangerskabslængde, kuldstørrelse eller kønsfordeling pr. kuld (data vist ikke)19.
Figur 1: Skematisk over CGS-paradigme- og funktionsvurderinger til validering. Dette tal er blevet ændret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ændringer i de kroniske stressrelaterede parametre i dæmningerne efter CGS-eksponering. (B) Relative moderens binyrerne vægte på PP2, Control = 20, CGS = 15. Data præsenteret som middelværdi + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Målinger af moderens HPA-akse efter CGS-eksponering. Maternel serum corticosteron niveauer målt efter 20 minutters tilbageholdenhed stress på PP2, Control = 8, CGS = 5. Data præsenteret som middelværdi + SEM. *p < 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Adfærdsændringer i den tidlige postpartumperiode i dæmninger efter CGS-eksponering. (A) Gennemsnitlig varighed og (B) antal slikke-/plejekampe registreret fra PP2-PP5, Control = 17, CGS = 17. (C) Procent saccharosepræference i SPT, Kontrol = 17, CGS = 19. (D) Samlet tid brugt i åben kvadrant af EZM i løbet af 5 min periode, Control = 17, CGS = 19. Data præsenteret som middelværdi + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Ændringer i afkommets kropsvægt under postnatal udvikling efter in-utero eksponering for CGS. Afkommets kropsvægt målt fra PN0 til PN21, Kontrol = 17 kuld, CGS = 17 kuld. Data præsenteret som middelværdi + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Zoubovsky, S.P. et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udsætter de gravide mus for CGS forstyrrer postpartum moderens neuroendokrine funktion, herunder HPA akse reaktion på nye stressorer, og er forbundet med forskellige adfærdsmæssige abnormiteter er relevante for perinatal stemning og angstlidelser. Da modellen anvender udnyttelse af en miljørisikofaktor , forventes der en højere fænotypisk variation end ellers observeret i genetiske modeller22. Ikke desto mindre kan resultater opnået fra anvendelsen af CGS paradigme være konsekvent på tværs af forskningslaboratorier, hvis der drages omsorg for at minimere variabler, der kan forvirre resultater.
Kritiske trin i protokollen omfatter trin relateret til generel opdrætspraksis, herunder boliger kontrolmus adskilt fra CGS-mus og tidsindinddelte parringstrin. Co-boliger kontrol og CGS mus kunne i sig selv være en stressende stimulus for kontrolgruppen og derfor forvirre neuroendokrine eller adfærdsmæssige resultater23,24. Ligeledes anbefales det ikke at indlede forsøg med gravide mus afsendt fra leverandøren. For at maksimere effektiviteten af tidsoplagte parringer anbefales det at huse voksne kvindelige mus sammen mindst 2 uger før opsætning af tidsoplagte parringer for at synkronisere deres østruscyklusser. Ligeledes vil brug af seksuelt erfarne voksne mandlige mus og forhindre mænd i at parre mindst 1 uge før opsætning af tidsindstillede parringer maksimere deres frugtbarhed og øge potentialet for vellykkede graviditeter. Tidslinjen for CGS paradigme skal også nøje følges. Anvendelse af disse stressorer af varierende intensitet for tidligt i svangerskabet kan påvirke livmoderdecidualisering og hæmme embryoimplantation25. Stresseksponering i forskellige svangerskabsuge tidsvinduer har også vist sig at bære varierende kønsspecifikke neuroudviklingssygdomsrisiko for afkom, hvor mandlige afkom er betydeligt mere sårbare end kvindelige afkom til stressorer i den tidlige svangerskab26,27. CGS-tidsplanen skal udformes på en sådan måde , at den sikrer uforudsigelighed for at forhindre udvikling af tilpasningsmekanismer og akklimatisering , der ofte er forbundet med gentagen eksponering for forudsigelige stressorer28. Endelig bør kuld aflives til seks unger på fødselsdagen for at sikre sammenlignelige forhold på tværs af alle dæmninger og forhindre kuldstørrelse variabilities fra forvirrende moderhormon eller adfærdsanalyse. Ligeledes bør forskellige kohorter anvendes til neuroendokrine og adfærdsmæssige vurderinger for at minimere forvirrende virkninger af tilbageholdenhed stress og submandibular blødninger på adfærd. Forskellige kohorter bør også anvendes til mødreplejevurdering og analyse af andre adfærdsmæssige parametre for at minimere forstyrrelser af moderens interaktion med hvalpene.
Der er flere begrænsninger for den aktuelle protokol. Den manglende evne til præcist at forudsige antallet af gravide mus forud for starten af CGS paradigme kan udgøre en betydelig økonomisk og animalsk brug byrde. Ændringer kunne foretages i protokollen for at opnå mere forudsigelig succes med tidsindstillede parringer, herunder evaluering af vaginal cytologi for at identificere mus i østrusstadiet, hvor både parring og ægløsning typisk forekommer29. Ultralydsundersøgelser af mus kan også indarbejdes i CGS-paradigmet som en alternativ ikke-invasiv teknik til præcist at identificere graviditeter fra meget tidlige stadier af svangerskabet30. Brugen af speciel avl chow, med øget fedtindhold, er også blevet ansat af andre grupper til at forbedre parringssucces31. Der skal dog udvises forsigtighed ved indførelse af ændringer i kosten, da dette kan påvirke moderens stressreaktivitet og adfærd32. Derudover har den nuværende protokol vist sig at være effektiv i vilde C57BL/6 mus, men ændringer af protokollen kan være nødvendige for forskellige stammer eller genetiske baggrunde såvel som arter, for de kan have store variationer i stressfølsomhed, moderpleje og følelsesmæssig regulering.
Sammenlignet med de nuværende eksisterende peripartum stress modeller, CGS paradigme viser sig at være mere translationelt relevant i betragtning af den resulterende sygdomsrelevante endophenotyper observeret, herunder øget maternel stress reaktivitet og postpartum abnormiteter i mødrepleje, anhedonia, og angst. Disse ændringer synes at opsummere kliniske fund forbundet med perinatal stemning og angstlidelser. Fremtidige anvendelser af denne model omfatter udnytte CGS paradigme til at identificere kønsspecifikke virkninger af moderens psykosociale stress på afkom hjernens udvikling og sygdom modtagelighed. Undersøgelse af CGS's virkninger på placentafunktionen bør overvejes, da dysfunktion i centrale placentale funktioner har vist sig at påvirke fostrets hjerneudvikling33. Indarbejde krydsfremmende eksperimenter med CGS paradigme ville yderligere bidrage til at forstå de enkelte bidrag in-utero CGS eksponering og tilhørende moderens hormonelle miljø ændringer versus postpartum abnormiteter i pleje adfærd spille i udformningen af afkom følelsesmæssige udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 tilskud og Cincinnati Children's Research Foundation. For data tilpasset fra Zoubovsky et al., 2019, Creative Common License kan findes på følgende placering: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
