Summary
Questo protocollo descrive i passaggi per la creazione di un modello di coniglio con due aneurismi digeriti con elastasi con emodinamica diversa (moncone e costellazione di biforcazione). Ciò consente la sperimentazione di nuovi dispositivi endovascolari in aneurismi con diverse condizioni di angioarchitettura ed emodinamica all'interno di un singolo animale.
Abstract
Modelli animali preclinici con caratteristiche emodinamiche, morfologiche e istologiche vicine agli aneurismi intracranici umani svolgono un ruolo chiave nella comprensione dei processi fisiopatologici e nello sviluppo e sperimentazione di nuove strategie terapeutiche. Questo studio mira a descrivere un nuovo modello di aneurisma del coniglio che consente la creazione di due aneurismi sacculari digeriti con elastasi con diverse condizioni emodinamiche all'interno dello stesso animale.
Cinque coniglie bianche neozelandesi femmina con un peso medio di 4,0 (± 0,3) kg e un'età media di 25 (±5) settimane sono state sottoposte a creazione di monconi microchirurgici e aneurisma di biforcazione. Un aneurisma (moncone) è stato creato dall'esposizione dell'arteria carotide comune destra (CCA) alla sua origine nel tronco brachiocefalico. Una clip temporanea è stata applicata all'origine CCA e un'altra, 2 cm sopra. Questo segmento è stato trattato con un'iniezione locale di 100 U di elastasi per 20 minuti. Un secondo aneurisma (biforcazione) è stato creato suturando una sacca arteriosa trattata con elastasi nell'anastomosi end-to-side del CCA destro al CCA sinistro. La pervietà è stata controllata mediante angiografia a fluorescenza immediatamente dopo la creazione.
La durata media dell'intervento è stata di 221 min. La creazione di due aneurismi nello stesso animale ha avuto successo in tutti i conigli senza complicazioni. Tutti gli aneurismi sono stati brevettati immediatamente dopo l'intervento chirurgico ad eccezione di un aneurisma di biforcazione, che ha mostrato una reazione tissutale estrema dovuta all'incubazione dell'elastasi e una trombosi intraluminale immediata. Non è stata osservata mortalità durante l'intervento chirurgico e fino a un mese di follow-up. La morbilità era limitata a una sindrome vestibolare transitoria (un coniglio), che si riprendeva spontaneamente entro un giorno.
Dimostrata qui per la prima volta è la fattibilità della creazione di un modello di coniglio a due aneurismi con caratteristiche emodinamiche del moncone e della biforcazione e condizioni di parete altamente degenerate. Questo modello consente lo studio del decorso naturale e delle potenziali strategie di trattamento sulla base della biologia dell'aneurisma in diverse condizioni di flusso.
Introduction
L'aneurisma intracranico è una condizione grave con un tasso di mortalità dopo la rottura che raggiunge il 50% e disabilità a lungo termine nel 10-20% dei pazienti1. L'ultimo decennio ha visto un rapido sviluppo di opzioni di trattamento endovascolare ma, allo stesso tempo, anche un aumento del tasso di recidiva con fino al 33% di ricanalizzazione dell'aneurisma dopo avvolgimento 2,3. Per comprendere meglio la fisiopatologia alla base dell'occlusione e della ricanalizzazione dell'aneurisma, nonché per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi dispositivi endovascolari, vi è attualmente la necessità di modelli preclinici affidabili le cui caratteristiche emodinamiche, morfologiche e istologiche imitino quelle degli aneurismi intracranici umani 4,5,6 . Ad oggi, non esiste un modello definito come standard per la sperimentazione preclinica e una vasta gamma di specie e tecniche sono disponibili per i ricercatori 7,8.
Tuttavia, il coniglio è una specie di particolare interesse a causa delle dimensioni e delle somiglianze emodinamiche tra le sue arterie del collo e i vasi cerebrali umani, nonché i suoi profili di coagulazione e trombolisi simili. Diversi modelli con aneurismi sacculari digeriti con elastasi sulle arterie carotidi comuni (CCA) hanno mostrato somiglianze qualitative e quantitative con gli aneurismi intracranici umani in termini di condizioni di flusso, caratteristiche geometriche e caratteristiche della parete 9,10,11,12. Questo studio mira a descrivere una tecnica per creare un nuovo modello di aneurisma di coniglio con aneurismi digeriti sia dal moncone che dalla biforcazione nello stesso animale. Le tecniche chirurgiche si ispirano a quelle di Hoh et al.13 e Wanderer et al.14 con lievi modifiche per fornire una buona standardizzazione e riproducibilità e per garantire bassa mortalità e morbilità.
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Protocol
NOTA: L'esperimento è stato approvato dal Comitato locale per la cura degli animali del Canton Berna, Svizzera (numero di domanda BE108/16), e tutte le cure e le procedure degli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e i principi 3R15,16. I dati sono riportati secondo le linee guida ARRIVE. La gestione perioperatoria è stata condotta da un anestesista veterinario certificato. Per lo studio, le femmine di coniglio bianco neozelandese, con un peso medio di 4,0 (± 0,3) kg e un'età media di 25 (±5) settimane, sono state alloggiate a una temperatura ambiente di 22-24 ° C con un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso ad acqua, pellet e fieno.
1. Fase pre-chirurgica e anestesia
- Eseguire un esame clinico come raccomandato dall'Associazione degli anestesisti veterinari e dall'European and American College of Veterinary Anesthesia and Analgesia per confermare che i conigli sono sani pesando ogni animale, valutando la mucosa, documentando il tempo di ricarica capillare e la qualità del polso ed eseguendo un'auscultazione polmonare e cardiaca e una palpazione addominale.
- Sulla base del risultato clinico, attribuire una classificazione dell'American Society of Anesthesiologists (ASA) a ciascun coniglio17. Eseguire interventi chirurgici solo su animali con un punteggio ASA I.
- Rasare entrambe le orecchie esterne e applicare la crema prilocaina-lidocaina sulle arterie e le vene auricolari. Ottenere una sedazione profonda con una combinazione di ketamina 20 mg / kg, dexmedetomidina 0,1 mg / kg e metadone 0,3 mg / kg iniettato per via sottocutanea (SC). Lasciare gli animali indisturbati per 15 min. Dare un'ossigenazione supplementare (3 L / min) attraverso una maschera facciale allentata e monitorare con un pulsossimetro.
- Posizionare una cannula da 22 G nell'arteria centrale auricolare sinistra e in una vena auricolare. Indurre l'anestesia generale con propofol 1-2 mg/kg per via endovenosa (IV) fino all'effetto (perdita del riflesso di deglutizione). Procedere con l'intubazione endo-tracheale tramite un tubo di silicone (diametro interno 3 mm).
- Rasare la fronte per posizionare i sensori elettroencefalografici pediatrici (EEG). Rasare il campo chirurgico e iniettare ropivacaina cloridrato 0,75% per via intradermica.
- Posizionare il coniglio sul tavolo operatorio in posizione dorsale, installare il monitoraggio completo e collegare il tubo endo-tracheale a un sistema di cerchio pediatrico a bassa resistenza. Mantenere l'anestesia con la somministrazione di isoflurano nell'ossigeno, mirando a una concentrazione massima di fine marea (Et) dell'1,3%.
- Fornire un'infusione continua di lattato di suoneria 5 ml/kg/h attraverso l'accesso venoso. Garantire il monitoraggio clinico e strumentale fino all'estubazione mediante pulsossimetria, doppler e pressione sanguigna invasiva, elettrocardiogramma a 3 derivazioni, EEG, temperatura rettale, gas inspirati ed espirati.
- Disinfettare il campo chirurgico con iodio povidone dal manubrium sterni agli angoli della mascella e applicare il drappeggio sterile. Durante l'intervento chirurgico, fornire analgesia con lidocaina (infusione a velocità costante (CRI) di 50 μg / kg / min) e fentanil (CRI di 3-10 μg / kg / h). Eseguire la ventilazione spontanea o assistita. Consentire l'ipercapnia permissiva.
- Eseguire almeno un'analisi dei gas del sangue arterioso durante l'intervento chirurgico. In caso di ipotensione (pressione arteriosa media inferiore a 60 mmHg), trattarla con noradrenalina, titolata fino all'effetto. Utilizzare una piastra riscaldante o un sistema di riscaldamento ad aria forzata per prevenire l'ipotermia (obiettivo: temperatura rettale 37,5-38,5 °C).
NOTA: Poiché la pressione arteriosa invasiva viene misurata all'arteria dell'orecchio sinistro, il taglio del CCA sinistro interromperà il flusso sanguigno e sopprimerà la curva. La pressione arteriosa deve quindi essere misurata con tecnica Doppler fino alla riapertura del vaso.
2. Chirurgia
- Avvicinarsi
- Fare un'incisione cutanea mediana dall'osso ioide fino a un punto caudale di 1,5 cm al manubrium sterni con un bisturi. Preparare il tessuto sottocutaneo e grasso dall'incisione mediale mentre si esegue un'emostasi meticolosa.
- Liberare il muscolo sternocefalo dal tessuto connettivo aderente e applicare la lidocaina localmente (2-4 mg / kg, preferire la lidocaina 1%) per evitare il mioclono. Esporre il CCA destro medialmente del muscolo sternocefalo e tenerlo bagnato con tamponi bagnati.
- Ora prepara le parti laterali e prossimali del muscolo sternocefalo e ritrailo medialmente con un cappio vascolare per esporre il CCA. Identificare la vena giugulare esterna e proteggerla con un micro tampone bagnato.
- Sezionare attentamente il tessuto connettivo lungo il CCA prossimale fino alla biforcazione del tronco brachiocefalico per esporre l'arteria. In presenza di piccoli rami provenienti dall'arteria, coagularli con il cauterizzatore.
NOTA: Fare attenzione ad evitare danni ai nervi.
- Creazione di aneurisma del moncone e raccolta dei tessuti per l'aneurisma della biforcazione
- Prima di tagliare il CCA destro, misurare il tempo anti-coagulazione (ACT) e somministrare eparina al sodio (80 EI/kg) per via sistemica attraverso la vena dell'orecchio (eseguita dal team di anestesia) per evitare eventi tromboembolici.
- Ora applica 2 clip temporanee: la prima all'origine del CCA e la seconda a 2 cm distali da esso (Figura 1A). Posizionare un tampone di gomma sotto il recipiente e risciacquare con papaverina HCL (40 mg / ml; 1: 1 sciolto in soluzione salina allo 0,9%) per la vasodilatazione.
- Rimuovere accuratamente l'avventizia usando microforbici. Eseguire un'arteriotomia sotto la clip distale con un catetere IV da 22 G e inserire il catetere caudalmente fino alla clip prossimale (Figura 1A,B).
- Lavare il segmento per via intraluminale con NaCl eparinizzato (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%) fino a quando non c'è sangue visibile, e infine fissare il catetere con una legatura (4-0). Ora, attraverso il catetere, iniettare 0,1-0,2 ml di elastasi (100 UI precedentemente disciolte in 5 ml di Tris-Buffer) nel segmento arterioso e incubare per 20 minuti (Figura 1B).
- Iniziare con la dissezione sul lato sinistro per esporre il CCA sinistro (vedere paragrafo 2.3). Dopo 20 minuti di tempo di incubazione con elastasi, eliminare la soluzione di elastasi e cambiare la siringa per sciacquare il segmento dell'arteria circa 10 volte con lo 0,9% di NaCl.
- Applicare 2 legature (6-0): la prima 5 mm distale di clip prossimale e la seconda appena prossimale, sotto l'arteriotomia (Figura 1C). Tagliare il vaso ~ 3 mm sopra la prima legatura e ancora una volta tra la seconda legatura e la clip distale. Conservare questo innesto autologo in una soluzione eparinizzata (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%) fino alla creazione dell'aneurisma della biforcazione (Figura 1D). Infine, aprire con attenzione la prima clip prossimale e misurare l'aneurisma (lunghezza, larghezza e profondità).
- Creazione di aneurisma della biforcazione
- Preparare il lato sinistro sezionando medialmente il muscolo sternocefalo per esporre ~ 2 cm del CCA sinistro. Applicare la lidocaina localmente sul muscolo per evitare il mioclono.
- Sottoporgere l'arteria carotide con una palla di garza e un piccolo tampone con un pezzo di guanto. Applicare un po 'di papaverina. HCl topicamente (40 mg/ml; 1:1 disciolto in soluzione salina allo 0,9%). Continuare a lavorare sotto vista microscopica: preparare la sacca dell'aneurisma e rimuovere l'avventizia. Misurare la sacca dell'aneurisma (lunghezza, larghezza, profondità).
- Lavare la parte aperta del CCA destro con NaCl eparinizzato e, se necessario, sostituire la clip per avere ~ 1 cm per consentire manipolazioni libere per la sutura. Rimuovere accuratamente l'avventizia e praticare un'incisione longitudinale di ~ 2 mm lateralmente nel moncone del CCA destro.
- Ora applica due clip temporanee sul CCA sinistro per delimitare un segmento di ~ 1 cm e rimuovere l'avventizia in mezzo. Eseguire un'arteriotomia con un ago da 23 G. Lavare il segmento con NaCl eparinizzato (500 U/100 mL in soluzione salina allo 0,9%). Ingrandire l'arteriotomia usando microforbici a ~4-5 mm per consentire la sutura del CCA destro e della sacca dell'aneurisma (Figura 1E). Irrare i vasi durante l'intera procedura di sutura e proteggerli con micro swap umidi.
- Eseguire l'anastomosi con sutura 9-0 non riassorbibile.
- Suturare la parete posteriore prossimale della carotide destra smussata con 5 punti, a partire dal bordo prossimale dell'arteriotomia sul CCA sinistro. Quindi, suturare il retro della sacca dell'aneurisma con 4-5 punti, a partire dal bordo distale dell'arteriotomia sul CCA sinistro.
- Continuare con il dorso distale a livello dell'incisione della bocca di pesce per suturare con il dorso verticale dell'innesto di aneurisma con 3 punti. Suturare il lato anteriore dell'incisione della bocca di pesce con 3 punti, iniziando verso l'alto e spostandosi verso il basso.
- Finire con la sutura anteriore tra il CCA sinistro e il lato anteriore dell'innesto di aneurisma e CCA destro con ~ 6 punti. Prima di terminare l'anastomosi, sciacquare i vasi con soluzione salina eparinizzata allo 0,9% per via intraluminale.
- Prima di rimuovere il morsetto, misurare ancora una volta il tempo di anticoagulazione (ACT) e somministrare una dose adattata di eparina per via sistemica (target: 2-3 volte l'ACT basale).
- Rimuovere la clip sul CCA destro mentre si esercita una certa pressione sull'anastomosi con micro tamponi per l'emostasi. Quindi, continua rimuovendo la clip distale dal CCA sinistro. Se non c'è sanguinamento maggiore, continuare con l'estrazione della clip prossimale sul CCA sinistro, per consentire il flusso sanguigno. Se c'è qualche sanguinamento dall'anastomosio, applicare una certa pressione con la palla di garza e il tampone; Attendere un paio di minuti. Se persiste, sostituisci le clip ed esegui le ricuciture.
NOTA: Una perdita di sangue superiore a 20-30 ml può compromettere la fase di recupero.
- Controllo e documentazione della pervietà
- Dopo aver aperto tutti i vasi, documentare fotograficamente i risultati e misurarli (Figura 1F e Figura 2A,B).
- Confermare il ripristino del flusso nel CCA distale attraverso la curva invasiva della pressione arteriosa (misurata all'arteria dell'orecchio, un ramo diretto della carotide esterna), che dovrebbe anche tornare alla normalità.
- Eseguire l'angiografia a fluorescenza somministrando 1 ml di fluoresceina IV, utilizzando 2 filtri passa-banda, una videocamera e un riflettore per biciclette. Cfr. pubblicazioni precedenti per la descrizione dell'intera procedura18,19.
- Chiusura
- Riadattare il cuscinetto adiposo sull'anastomosi e suturarlo con una sutura riassorbibile 4-0. Infine sutura sottocute e pelle con punti singoli utilizzando sutura riassorbibile 4-0.
3. Fase postchirurgica
- Alla fine dell'intervento, interrompere l'isoflurano e l'analgesia sistemica senza reversione al fine di mantenere l'effetto analgesico. Assicurarsi che il controllo del riflesso di deglutizione sia tornato prima di eseguire l'estubazione tracheale.
- Somministrare meloxicam 0,5 mg/kg IV per assicurare l'analgesia, aspirina (ASS) 10 mg/kg IV per prevenire eventi trombotici immediati, vitamina B12 100 μg SC e clamoxyl 20 mg/kg IV come profilassi antibiotica.
- Fornire ossigenazione e riscaldamento supplementari fino a quando il coniglio riacquista spontaneamente la recumenza sternale. Eseguire l'analgesia di salvataggio con metadone se si osserva qualsiasi segno di dolore. Eseguire follow-up postoperatorio e cura 4 volte al giorno per i primi 3 giorni preoperatori, in conformità con le linee guida per la valutazione e la gestione del dolore nei roditori e nei conigli23,24.
- Garantire l'analgesia postoperatoria con cerotto di fentanil (12 μg/h) applicato sull'orecchio esterno, meloxicam 1x/SC per 3 giorni e metadone come terapia di salvataggio, insieme a un foglio di valutazione per la valutazione del dolore (file supplementare).
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Representative Results
La creazione di un moncone e di un aneurisma della biforcazione ha avuto successo in tutti e 5 i conigli bianchi della Nuova Zelanda senza complicazioni intraoperatorie. Non è stata osservata mortalità durante l'intervento chirurgico o durante il periodo di follow-up di 24 ± 2 giorni. Un coniglio ha avuto complicazioni postoperatorie con una sindrome vestibolare e una cecità del lato destro. L'animale si è ripreso completamente e spontaneamente dopo 24 ore. Questa complicanza non ha interferito con le sue normali attività (movimenti liberi, assunzione di acqua e cibo, interazioni con altri animali) e non ha richiesto alcun trattamento specifico. Non c'è stata rottura spontanea dell'aneurisma.
La durata media dell'intervento è stata di 221 minuti (compresa tra 190 e 255 minuti). Tutti gli aneurismi sono stati brevettati immediatamente dopo l'intervento chirurgico, ad eccezione di un aneurisma di biforcazione che ha mostrato una reazione tissutale estrema dovuta all'incubazione dell'elastasi e una trombosi immediata. Al follow-up, la pervietà dell'aneurisma è stata confermata dall'angiografia a risonanza magnetica (Figura 3) e dall'ispezione macroscopica dopo l'estrazione del tessuto (Figura 4). Ad eccezione dell'aneurisma della biforcazione che già si era trombizzato durante l'intervento chirurgico, tutti gli aneurismi erano ancora evidenti all'endpoint di follow-up. Ciò ha comportato un tasso di pervietà del 90% (9 su 10).
L'ispezione macroscopica e la misurazione degli aneurismi dopo il campionamento mostrano una crescita di tutti gli aneurismi con una dimensione media di 5,4 mm x 2,4 mm x 2,3 mm ± 1 mm x 0,6 mm x 0,3 mm alla creazione e 4,5 mm x 3,1 mm x 2,5 mm ± 1,5 mm x 0,9 mm x 0 mm alla raccolta per l'aneurisma del moncone; e 3,4 mm x 2 mm x 2,1 mm ± 0,6 mm x 1 mm x 0,4 mm al momento della creazione e 3,8 mm x 2,8 mm x 2,6 mm ± 1,2 mm x 0,3 mm x 0,6 mm alla raccolta per gli aneurismi di biforcazione. È interessante notare che gli aneurismi di biforcazione sono cresciuti più degli aneurismi del moncone con un volume medio di 14,4 mm 3 ± 3,5 mm 3 alla creazione e 28,6 mm 3 ± 16,4 mm 3 all'estrazione (rapporto 1,9) rispetto a un volume alla creazione di 30,8 mm 3 ± 15 mm 3 e 34,9 mm 3 ± 24,1 mm 3 all'estrazione (rapporto 1,1) per la versione moncone.
Figura 1: Fasi dell'intervento. (A) Applicazione delle 2 clip provvisorie sul CCA destro: la prima all'origine dal tronco brachiocefalico e la seconda ~2 cm distale alla prima. L'asterisco indica la localizzazione dell'arteriotomia con un catetere endovenoso da 22 G (catetere IV). (B) Dopo l'inserimento e la fissazione del catetere IV con una legatura 4-0, lavare il segmento con NaCl eparinizzato (500 U/100 mL di soluzione salina allo 0,9%) e iniettare 0,1-0,2 mL di elastasi (100 U precedentemente disciolti in 5 mL di tampone TRIS). Incubare per 20 min. (C) Applicare 2 legature non riassorbibili (6-0): la prima 5 mm distale alla clip prossimale e la seconda appena prossimale sotto l'arteriotomia. (D) Tagliare il vaso ~ 3 mm sopra le legature per creare l'aneurisma del moncone e l'innesto autologo per l'aneurisma della biforcazione. (E) Anastomosi del CCA destro e dell'innesto autologo sul CCA sinistro per creare l'aneurisma della biforcazione. (F) Risultato finale con un aneurisma del moncone sul lato destro e un aneurisma della biforcazione sul lato sinistro. Abbreviazioni: CCA = arteria carotide comune; IV = endovenosa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Documentazione fotografica intraoperatoria dei risultati. La linea tratteggiata gialla rappresenta la linea mediana con indicazione per le direzioni cranica e caudale. (A) Vista dell'aneurisma del moncone sul lato destro del collo. Lo SCEM è retratto medialmente dalla media di un anello di vaso (in blu). (B) Vista dell'aneurisma della biforcazione sul lato sinistro del collo. Abbreviazioni: SCEM = muscolo sternocefalico; SA = Aneurisma del moncone; JV = vena giugulare; rCCA: arteria carotide comune destra; lCCA= arteria carotide comune sinistra; Tr = Trachea; * = Ramo ricorrente o laringeo; BA = Aneurisma della biforcazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati dell'angiografia a risonanza magnetica al follow-up. Immagini da sequenze TOF tridimensionali acquisite con una risonanza magnetica da 3 Tesla, focalizzata sulle arterie del collo. (A) Aneurisma del moncone (freccia gialla) sull'arteria succlavia destra. (B) Aneurisma della biforcazione (freccia gialla) sulla biforcazione creata anastomosi il CCA destro su quello sinistro. Abbreviazioni: TOF = time-of-Flight; MRI = risonanza magnetica; CCA = arteria carotide comune. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Documentazione fotografica macroscopica dopo l'estrazione del tessuto. Le scanalature maggiori (2 divisioni) sulla clip indicano 1 mm e le scanalature minori in mezzo (una divisione) indicano 0,5 mm. (A) Aneurisma del moncone sul tronco brachiocefalo e sull'arteria succlavia destra. (B) Aneurisma di biforcazione sulla biforcazione creato anastomosi il CCA destro su quello sinistro. Abbreviazioni: SA = Aneurisma del moncone; BCT = tronco brachiocefalico; rSC = arteria succlavia destra; BA = aneurisma della biforcazione; CCA = arteria carotide comune; rCCA = CCA di diritto; lCCA = CCA sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Reperti istologici di aneurismi del moncone e della biforcazione. Campione colorato con ematossilina-eosina (ingrandimento 2 volte). (A) Panoramica microscopica di un aneurisma del moncone (a) con il tronco brachiocefalico (b) e l'arteria succlavia destra (c). (*) indica la direzione del flusso sanguigno. (B) Panoramica microscopica di un aneurisma di biforcazione (a) con il CCA sinistro prossimale (b), il CCA sinistro distale (c) e il CCA destro distale (d). (*) indica la direzione del flusso sanguigno. Negli inserti in (A) e (B), I) rappresenta la tunica intima della parete dell'aneurisma, II) la tunica media e III) la tunica esterna (ingrandimento di 20 volte). Abbreviazioni: CCA = arteria carotide comune. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La tecnica più comune per la creazione di aneurismi prevede la creazione di un aneurisma del moncone all'origine del CCA destro, attraverso un metodo aperto o endovascolare. Il modello è stato validato per essere un aneurisma stabile non in crescita che rimane aperto con il tempo20,21. La seconda tecnica possibile prevede la creazione microchirurgica di un aneurisma della biforcazione arteriosa anastomosi il CCA destro su quello sinistro e suturando una sacca per aneurisma sulla biforcazione 14,22,23. Sebbene entrambi i metodi abbiano dimostrato l'idoneità per la sperimentazione di dispositivi endovascolari e lo studio della fisiopatologia, le morfologie dell'aneurisma e quindi le forze emodinamiche e le caratteristiche di flusso coinvolte sono sostanzialmente diverse. Dato che i modelli esistenti consentono la creazione di un solo tipo di aneurisma per animale, un confronto diretto tra il decorso naturale degli aneurismi dal tipo di biforcazione con quelli del tipo di moncone è attualmente difficile.
Infatti, le differenze fisiologiche tra gli animali (come la pressione sanguigna o l'esatto contenuto di collagene della parete del vaso) non possono sempre essere completamente controllate in un ambiente sperimentale e possono influenzare la biologia dell'aneurisma e il decorso naturale. Questo studio dimostra la fattibilità della creazione di un modello di coniglio con condizioni emodinamiche e di parete degenerata sia del moncone che della biforcazione nello stesso animale (o in un singolo animale). Questa tecnica ha prodotto aneurismi riproducibili con bassa morbilità e mortalità e un alto tasso di pervietà (90%). Lo svantaggio principale di questo metodo rimane lo stesso della creazione del moncone classico o dei modelli di biforcazione stessi: la necessità di sofisticate attrezzature di laboratorio e specifiche competenze microchirurgiche.
In particolare, sono stati identificati due passaggi critici durante questo intervento chirurgico: il primo è la dissezione e l'esposizione del CCA destro fino alla sua origine nel tronco brachiocefalico. Le seguenti strutture vitali possono essere particolarmente a rischio durante questo approccio: la trachea, la vena giugulare e il nervo laringeo. Poiché la manipolazione della trachea può compromettere la respirazione, la precedente intubazione assicura la pervietà delle vie aeree. Inoltre, essendo l'intervento lungo e in prossimità di strutture vitali, il monitoraggio completo è utile per riconoscere tempestivamente eventuali deviazioni fisiologiche. Il chirurgo dovrebbe anche prestare attenzione per evitare la pressione diretta o la trazione estrema sulla trachea stessa. La vena giugulare corre direttamente accanto alla carotide e, in alcuni casi, è aderente ad essa. È necessaria estrema attenzione per evitare qualsiasi lesione. Si consiglia di proteggere la vena e mantenerla bagnata mediante l'applicazione di un tampone bagnato.
Infine, studi precedenti hanno già descritto l'importanza di preservare i nervi laringei. Qualsiasi lesione su questi nervi porterebbe postoperatoriamente alla comparsa di uno stridore con respirazione consecutivamente compromessa e alta probabilità di morte dell'animale. Per prevenire la lesione iatrogena dei nervi, la dissezione CCA dovrebbe evitare la trazione dei tessuti che circondano l'arteria. Si consiglia l'uso di forbici per tagliare i tessuti aderenti invece di distrarli. I nervi devono anche essere identificati il più presto possibile dopo la retrazione della muscolatura per tenerli sotto controllo visivo durante l'intervento chirurgico. Il secondo passo critico è la creazione di una micro-anastomosi senza tensione con l'aneurisma digerito dall'elastasi. Questo aneurisma presenta un'alta degenerazione della sua struttura muraria, ostacolando la manipolazione dei tessuti. Richiede buone capacità microchirurgiche e ci si aspetta una curva di apprendimento.
Inoltre, si consiglia di selezionare conigli di peso minimo 4,0 kg (età media di 25 (±5) settimane) per garantire una corretta dimensione dei vasi del collo. Nel modello classico di aneurisma a singolo moncone, la principale complicanza riportata in letteratura era la necrosi tracheale in seguito all'applicazione di elastasi dovuta alle arterie tracheoesofagee derivanti dal CCA destro. Diverse modifiche delle tecniche sono già state suggerite per evitare il problema 13,24,25,26. Questo approccio consente la facile identificazione di questi rami e la loro coagulazione prima dell'applicazione dell'elastasi per evitare qualsiasi deflusso della soluzione di elastasi e complicazioni simili.
Il regime anticoagulante applicato durante l'intervento consiste nell'applicazione di eparina prima della prima applicazione della clip al CCA destro e prima di rimuovere la clip e ripristinare la circolazione al CCA sinistro. Ciò potrebbe prevenire efficacemente la formazione di trombi a causa dell'interruzione temporanea del flusso e della manipolazione dei vasi. Inoltre, una dose unica di aspirina (10 mg / kg IV) viene somministrata immediatamente dopo la fine dell'intervento chirurgico per prevenire la formazione di trombi a causa dell'effetto trombogenico del materiale di sutura e dell'elastasi. Questo protocollo permette il controllo degli eventi trombogenici e garantisce la pervietà dell'aneurisma senza aumentare le complicanze emorragiche.
Il modello del moncone è il modello di coniglio con aneurisma sacculare più comune ed è già stato utilizzato più volte per studi traslazionali di terapie endovascolari. Il modello di biforcazione è inoltre ben descritto in letteratura e adatto allo studio della fisiopatologia dell'aneurisma e alla sperimentazione di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, entrambi i modelli mostrano morfologie distinte, il che indica caratteristiche emodinamiche distinte. È noto che gli aneurismi compaiono preferenzialmente alla biforcazione e che la crescita dipende dallo sforzo di taglio della parete27,28. Pubblicazioni precedenti hanno anche mostrato una trombosi spontanea più elevata negli aneurismi della parete laterale creati chirurgicamente rispetto a quelli di biforcazione29 e un più alto tasso di occlusione dell'aneurisma del moncone dopo la deviazione del flusso rispetto ad altri modelli più complessi8; Tuttavia, il confronto era sempre tra due animali diversi.
Nel presente studio sono stati creati aneurismi standard di 2-4 mm di diametro, come precedentemente descritto 14,22,29,30,31,32,33,34,35,36. Abbiamo mirato a creare un aneurisma del moncone con dimensioni simili agli aneurismi della biforcazione per il confronto. Pertanto, il volume attuale è leggermente inferiore come è stato riportato 5,8,10,11,13,21. Entrambi gli aneurismi hanno tuttavia mostrato una tendenza a crescere a 1 mese di follow-up. Pertanto, un periodo di follow-up più lungo potrebbe indurre la formazione di aneurismi con volumi maggiori, il che consentirebbe un migliore confronto a lungo termine con gli aneurismi nell'uomo. Inoltre, questi risultati istologici, basati sulla colorazione dell'ematossilina-eosina, mostrano una parete dell'aneurisma cellulare e la presenza di cellule muscolari lisce in un modello lineare o disorganizzato, nonché una disorganizzazione delle fibre elastiche (Figura 5). Questi risultati sono correlati con i risultati attuali che mostrano somiglianze istologiche tra gli aneurismi indotti dall'elastasi del coniglio e gli aneurismi intracranici nell'uomo 11,32,37,38,39,40,41.
I risultati mostrano la fattibilità tecnica della creazione di aneurismi sia del moncone che della biforcazione utilizzando lo stesso approccio chirurgico. Il limite di questo studio è la piccola dimensione del campione, che non consente un'analisi statistica o un reale confronto delle differenze istologiche tra aneurismi del moncone e della biforcazione. Tuttavia, questo modello offre la possibilità di indagare le differenze tra entrambi gli aneurismi in termini di crescita, rottura, occlusione spontanea e cambiamenti istologici in esperimenti futuri con dimensioni del campione aumentate e tempi di follow-up diversi, per determinare con precisione i vantaggi e le caratteristiche di entrambi i tipi di aneurismi. Inoltre, questo nuovo modello chirurgico consente l'applicazione di dispositivi endovascolari in due distinte configurazioni e condizioni di flusso in un animale, nonché durante una procedura unica. Ciò riduce il numero di animali necessari e potenzialmente aumenta l'efficienza degli studi preclinici.
Per concludere, questo studio descrive un metodo riproducibile per creare 2 aneurismi con condizioni di flusso distinte e pareti altamente degenerate all'interno di un singolo animale. Il modello proposto consente un confronto diretto del decorso naturale e degli effetti delle terapie endovascolari degli aneurismi sacculari rispetto al ruolo dell'emodinamica. Infine, fornisce un modello efficiente che contribuisce alla riduzione degli animali utilizzati e dei costi sperimentali complessivi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Prof. Hans Rudolf Widmer, il Dr. Luca Remonda, e il Prof Javier Fandino per il loro supporto scientifico e contributo tecnico a questo lavoro. Un ringraziamento speciale a Olgica Beslac per i suoi consigli durante le procedure e Kay Nettelbeck per la sua assistenza. Si ringraziano inoltre Daniela Casoni DVM, PhD e med. vet. Luisana Garcia, PD Dr Alessandra Bergadano, e Dr Carlotta Detotto per il loro supporto veterinario dedicato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| 6-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Biemer vessel clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Bycilces spotlight | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrocardiogram electrodes | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Heating pad or heating forced-air warming system | |||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamine | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| lid retractor | Approach | ||
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medication |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-forceps curved | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-015-15 | |
| Micro-forceps straight 2x | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-010-15 | |
| Microscissors | Ulrich Swiss , Switzerland | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Needle 23 G | arteriotomy | ||
| Needle holder | |||
| O2-Face mask | |||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | topical application | |
| Povidone iodine | Mundipharma Medical Company | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | General anesthesia | |
| Pulse oxymeter | |||
| Rectal temperature probe (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusion | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Local anesthesia |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Small animal shaver | |||
| Soft tissue forceps | |||
| Soft tissue spreader | |||
| Stainless steel sponge bowls | |||
| Sterile micro swabs | |||
| Stethoscope | |||
| Surgery drape | |||
| Surgical scissors | |||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Elastase solution |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | |||
| vessel loop | Approach | ||
| video camera or smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T |
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