Summary
Este protocolo describe los pasos para la creación de un modelo de conejo con dos aneurismas digeridos por elastasa con diferente hemodinámica (muñón y constelación de bifurcación). Esto permite probar nuevos dispositivos endovasculares en aneurismas con diferentes condiciones angioarquitectónicas y hemodinámicas dentro de un solo animal.
Abstract
Los modelos animales preclínicos con características hemodinámicas, morfológicas e histológicas cercanas a los aneurismas intracraneales humanos desempeñan un papel clave en la comprensión de los procesos fisiopatológicos y en el desarrollo y prueba de nuevas estrategias terapéuticas. Este estudio tiene como objetivo describir un nuevo modelo de aneurisma de conejo que permite la creación de dos aneurismas saculares digeridos por elastasa con diferentes condiciones hemodinámicas dentro del mismo animal.
Cinco conejos blancos hembras de Nueva Zelanda con un peso medio de 4,0 (± 0,3) kg y una edad media de 25 (±5) semanas se sometieron a la creación de un muñón microquirúrgico y un aneurisma de bifurcación. Un aneurisma (muñón) fue creado por la exposición a la arteria carótida común derecha (CCA) en su origen en el tronco braquiocefálico. Se aplicó un clip temporal en el origen CCA y otro, 2 cm por encima. Este segmento fue tratado con una inyección local de 100 U de elastasa durante 20 min. Se creó un segundo aneurisma (bifurcación) mediante la sutura de una bolsa arterial tratada con elastasa en la anastomosis de extremo a lado del CCA derecho al CCA izquierdo. La permeabilidad se controló mediante angiografía de fluorescencia inmediatamente después de la creación.
La duración promedio de la cirugía fue de 221 min. La creación de dos aneurismas en el mismo animal fue exitosa en todos los conejos sin complicaciones. Todos los aneurismas fueron patentes inmediatamente después de la cirugía, excepto un aneurisma de bifurcación, que mostró una reacción tisular extrema debido a la incubación de elastasa y una trombosis intraluminal inmediata. No se observó mortalidad durante la cirugía y hasta un mes de seguimiento. La morbilidad se limitó a un síndrome vestibular transitorio (un conejo), que se recuperó espontáneamente en un día.
Aquí se demuestra por primera vez la viabilidad de crear un modelo de conejo de dos aneurismas con características hemodinámicas de muñón y bifurcación y condiciones de pared altamente degeneradas. Este modelo permite el estudio del curso natural y las posibles estrategias de tratamiento sobre la base de la biología del aneurisma en diferentes condiciones de flujo.
Introduction
El aneurisma intracraneal es una afección grave con una tasa de mortalidad después de la rotura que alcanza el 50% y discapacidad a largo plazo en el 10-20% de los pacientes1. La última década ha visto un rápido desarrollo de las opciones de tratamiento endovascular pero, al mismo tiempo, también una tasa creciente de recurrencia con hasta un 33% de recanalización del aneurisma después de enrollar 2,3. Para comprender mejor la fisiopatología subyacente a la oclusión y recanalización del aneurisma, así como para el desarrollo y prueba de nuevos dispositivos endovasculares, actualmente existe la necesidad de modelos preclínicos confiables cuyas características hemodinámicas, morfológicas e histológicas imiten las de los aneurismas intracraneales humanos 4,5,6 . A partir de hoy, no existe un modelo definido como estándar para el ensayo preclínico, y una amplia gama de especies y técnicas están disponibles para los investigadores 7,8.
Sin embargo, el conejo es una especie de particular interés debido al tamaño y las similitudes hemodinámicas entre sus arterias del cuello y los vasos cerebrales humanos, así como sus perfiles similares de coagulación y trombólisis. Varios modelos con aneurismas saculares digeridos por elastasa en las arterias carótidas comunes (CCA) han mostrado similitudes cualitativas y cuantitativas con los aneurismas intracraneales humanos en términos de condiciones de flujo, características geométricas y características de la pared 9,10,11,12. Este estudio tiene como objetivo describir una técnica para crear un nuevo modelo de aneurisma de conejo con aneurismas digeridos por elastasa de muñón y bifurcación en el mismo animal. Las técnicas quirúrgicas están inspiradas en las de Hoh et al.13 y Wanderer et al.14 con ligeras modificaciones para proporcionar una buena estandarización y reproducibilidad y asegurar una baja mortalidad y morbilidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: El experimento fue aprobado por el Comité Local para el Cuidado de los Animales del Cantón de Berna, Suiza (Número de solicitud BE108/16), y todos los cuidados y procedimientos de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y los principios 3R15,16. Los datos se informan de acuerdo con las directrices ARRIVE. El manejo perioperatorio fue realizado por un anestesiólogo veterinario certificado por la junta. Para el estudio, las hembras de conejos blancos de Nueva Zelanda, con un peso medio de 4,0 (± 0,3) kg y una edad media de 25 (±5) semanas, se alojaron a una temperatura ambiente de 22-24 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a agua, pellets y heno.
1. Fase prequirúrgica y anestesia
- Realizar un examen clínico según lo recomendado por la Asociación de Anestesistas veterinarios y el Colegio Europeo y Americano de Anestesia Veterinaria y analgesia para confirmar que los conejos están sanos pesando cada animal, evaluando la membrana mucosa, documentando el tiempo de llenado capilar y la calidad del pulso, y realizando una auscultación pulmonar y cardíaca, así como una palpación abdominal.
- Con base en el hallazgo clínico, atribuir una clasificación de la Sociedad Americana de Anestesiólogos (ASA) a cada conejo17. Realizar la cirugía solo en animales con una puntuación ASA I.
- Afeite ambos oídos externos y aplique crema de prilocaína-lidocaína en las arterias y venas auriculares. Logre una sedación profunda con una combinación de ketamina 20 mg/kg, dexmedetomidina 0,1 mg/kg y metadona 0,3 mg/kg inyectada por vía subcutánea (SC). Deje a los animales tranquilos durante 15 minutos. Administre oxigenación suplementaria (3 L/min) a través de una mascarilla aflojada y monitoree con un oxímetro de pulso.
- Coloque una cánula de 22 G en la arteria central auricular izquierda, así como en una vena auricular. Inducir anestesia general con propofol 1-2 mg/kg intravenoso (IV) hasta el efecto (pérdida del reflejo de deglución). Proceder a la intubación endotraqueal mediante un tubo de silicona (3 mm de diámetro interno).
- Afeite la frente para colocar los sensores electroencefalográficos (EEG) pediátricos. Afeitar el campo quirúrgico e inyectar clorhidrato de ropivacaína al 0,75 % por vía intradérmica.
- Coloque el conejo en la mesa de operaciones en decúbito dorsal, instale un monitoreo completo y conecte el tubo endotraqueal a un sistema de círculo pediátrico de baja resistencia. Mantener la anestesia con la administración de isoflurano en oxígeno, apuntando a una concentración marea final máxima (Et) del 1,3 %.
- Proporcionar una infusión continua de lactato de timbre 5 mL/kg/h a través del acceso venoso. Asegurar el seguimiento clínico e instrumental hasta la extubación mediante oximetría de pulso, doppler y presión arterial invasiva, electrocardiograma de 3 derivaciones, EEG, temperatura rectal y gases inhalados y exhalados.
- Desinfecte el campo quirúrgico con povidona yodada desde el manubrio esterni hasta los ángulos de la mandíbula y aplique el drapeado estéril. Durante la cirugía, proporcionar analgesia con lidocaína (infusión de velocidad constante [CRI] de 50 μg/kg/min) y fentanilo (CRI de 3-10 μg/kg/h). Realizar ventilación espontánea o asistida. Permitir la hipercapnia permisiva.
- Realizar al menos un análisis de gases en sangre arterial durante la cirugía. En caso de hipotensión (presión arterial media por debajo de 60 mmHg), trátela con noradrenalina, ajustada hasta que surta efecto. Utilice una almohadilla térmica o un sistema de calentamiento de aire forzado para evitar la hipotermia (objetivo: temperatura rectal 37.5-38.5 ° C).
NOTA: Como la presión arterial invasiva se mide en la arteria del oído izquierdo, el recorte del CCA izquierdo detendrá el flujo sanguíneo y suprimirá la curva. La presión arterial debe medirse con la técnica Doppler hasta la reapertura del vaso.
2. Cirugía
- Acercarse
- Haga una incisión mediana en la piel desde el hueso hioides hasta un punto caudal de 1,5 cm hasta el manubrio esterni con un bisturí. Prepare el tejido subcutáneo y graso de la incisión medial mientras realiza una hemostasia meticulosa.
- Libere el músculo esternocéfalo del tejido conectivo adherente y aplique lidocaína tópicamente (2-4 mg / kg, prefiera lidocaína 1%) para evitar el mioclono. Exponga el CCA derecho medialmente del músculo esternocéfalo y manténgalo húmedo con hisopos húmedos.
- Ahora prepare las partes lateral y proximal del músculo esternocéfalo y retírelo medialmente con un bucle de vaso para exponer el CCA. Identifique la vena yugular externa y protéjala con un microhisopo húmedo.
- Diseccionar el tejido conectivo cuidadosamente a lo largo del CCA proximal hasta la bifurcación del tronco braquiocefálico para exponer la arteria. En presencia de pequeñas ramas provenientes de la arteria, coagularlas con el cauterizador.
NOTA: Tenga cuidado de evitar cualquier daño a los nervios.
- Creación de aneurisma de muñón y recolección de tejido para el aneurisma de bifurcación
- Antes de recortar el CCA derecho, mida el tiempo anticoagulante (ACT) y administre heparina natrial (80 EI / kg) sistémicamente a través de la vena del oído (realizada por el equipo de anestesia) para evitar eventos tromboembólicos.
- Ahora aplique 2 clips temporales: el primero en el origen del CCA y el segundo a 2 cm distal de él (Figura 1A). Coloque una almohadilla de goma debajo del recipiente y enjuague con papaverina HCL (40 mg / ml; 1: 1 disuelto en solución salina al 0.9%) para la vasodilatación.
- Retire la adventicia con cuidado usando microtijeras. Realizar una arteriotomía por debajo del clip distal con un catéter IV de 22 G e insertar el catéter caudalmente hasta el clip proximal (Figura 1A, B).
- Enjuague el segmento por vía intraluminal con NaCl heparinizado (500 U/100 ml en solución salina al 0,9%) hasta que no haya sangre visible, y finalmente fije el catéter con una ligadura (4-0). Ahora, a través del catéter, inyecte 0.1-0.2 mL de elastasa (100 UI previamente disueltas en 5 mL de Tris-Buffer) en el segmento arterial e incube durante 20 min (Figura 1B).
- Comience con la disección en el lado izquierdo para exponer el CCA izquierdo (ver sección 2.3). Después de 20 minutos de tiempo de incubación con elastasa, limpie la solución de elastasa y cambie la jeringa para enjuagar el segmento de la arteria aproximadamente 10 veces con NaCl al 0,9%.
- Aplicar 2 ligaduras (6-0): la primera 5 mm distal de clip proximal y la segunda apenas proximalmente, bajo la arteriotomía (Figura 1C). Corte el vaso ~3 mm por encima de la primera ligadura y una vez más entre la segunda ligadura y el clip distal. Mantener este injerto autólogo en una solución heparinizada (500 U/100 mL en solución salina al 0,9%) hasta la creación del aneurisma de bifurcación (Figura 1D). Finalmente, abra cuidadosamente el primer clip proximal y mida el aneurisma (longitud, anchura y profundidad).
- Creación de aneurismas por bifurcación
- Prepare el lado izquierdo diseccionando el músculo esternocéfalo medialmente para exponer ~2 cm del CCA izquierdo. Aplique lidocaína tópicamente sobre el músculo para evitar el mioclono.
- Debajo de la arteria carótida con una bola de gasa y un pequeño hisopo con un trozo de guante. Aplicar un poco de papaverina. HCl tópicamente (40 mg/ml; 1:1 disuelto en solución salina al 0,9%). Continúe trabajando bajo vista microscópica: prepare la bolsa del aneurisma y retire la adventicia. Medir la bolsa del aneurisma (longitud, anchura, profundidad).
- Enjuague la parte abierta del CCA derecho con NaCl heparinizado y, si es necesario, reemplace el clip para que tenga ~ 1 cm para permitir manipulaciones libres para la sutura. Retire la adventicia con cuidado y haga una incisión longitudinal de ~ 2 mm lateralmente en el muñón del CCA derecho.
- Ahora aplique dos clips temporales en el CCA izquierdo para delimitar un segmento de ~ 1 cm y eliminar la adventicia en el medio. Realizar una arteriotomía con una aguja de 23 G. Enjuague el segmento con NaCl heparinizado (500 U/100 ml en solución salina al 0,9%). Agrandar la arteriotomía usando microtijeras a ~4-5 mm para permitir la sutura del CCA derecho y la bolsa del aneurisma (Figura 1E). Irrigar los recipientes durante todo el procedimiento de sutura y protegerlos con micro intercambios húmedos.
- Realizar la anastomosis con sutura 9-0 no reabsorbible.
- Suturar la pared posterior proximal del romo carotídeo derecho con 5 puntos de sutura, comenzando en el borde proximal de la arteriotomía en el CCA izquierdo. Luego, suture la parte posterior de la bolsa del aneurisma con 4-5 puntos de sutura, comenzando en el borde distal de la arteriotomía en el CCA izquierdo.
- Continuar con la parte posterior distal a nivel de la incisión de la boca de pez para suturar con la parte posterior vertical del injerto de aneurisma con 3 puntos de sutura. Suture la parte frontal de la incisión de la boca del pez con 3 puntos de sutura, comenzando hacia arriba y moviéndose hacia abajo.
- Termine con la sutura frontal entre el CCA izquierdo y el lado frontal del injerto de aneurisma y el CCA derecho con ~6 puntos de sutura. Antes de terminar la anastomosis, enjuague los vasos con solución salina heparinizada al 0,9% por vía intraluminal.
- Antes de retirar la pinza, medir el tiempo anticoagulante (TCA) una vez más y administrar una dosis adaptada de heparina sistémicamente (objetivo: 2-3 veces la TCA basal).
- Retire el clip en el CCA derecho mientras ejerce algo de presión sobre la anastomosis con micro hisopos para la hemostasia. Luego, continúe retirando el clip distal del CCA izquierdo. Si no hay sangrado importante, continúe sacando el clip proximal en el CCA izquierdo, para permitir el flujo sanguíneo. Si hay algo de sangrado de la anastomosis, aplique algo de presión con la bola de gasa y el hisopo; Espere un par de minutos. Si persiste, reemplace los clips y realice nuevas suturas.
NOTA: Una pérdida de sangre de más de 20-30 ml puede poner en peligro la fase de recuperación.
- Control de permeabilidad y documentación
- Después de abrir todos los recipientes, documente los resultados fotográficamente y mídalos (Figura 1F y Figura 2A, B).
- Confirmar la restauración del flujo en el CCA distal a través de la curva invasiva de presión arterial (medida en la arteria del oído, una rama directa de la carótida externa), que también debe volver a la normalidad.
- Realice una angiografía de fluorescencia administrando 1 ml de fluoresceína IV, utilizando 2 filtros de paso de banda, una cámara de video y un foco de bicicleta. Ver publicaciones anteriores para la descripción de todo el procedimiento18,19.
- Clausura
- Readapte la almohadilla de grasa en la anastomosis y suture con una sutura reabsorbible 4-0. Finalmente sutura subcutis y piel con puntos individuales utilizando sutura reabsorbible 4-0.
3. Fase postquirúrgica
- Al final de la cirugía, suspender el isoflurano y la analgesia sistémica sin reversión para mantener el efecto analgésico. Asegúrese de que el control del reflejo de deglución ha regresado antes de realizar la extubación traqueal.
- Administrar meloxicam 0,5 mg/kg IV para asegurar analgesia, aspirina (ASS) 10 mg/kg IV para prevenir eventos trombóticos inmediatos, vitamina B12 100 μg SC y clamoxilo 20 mg/kg IV como profilaxis antibiótica.
- Proporcionar oxigenación suplementaria y calentamiento hasta que el conejo recupere espontáneamente la decúbito esternal. Realizar analgesia de rescate con metadona si se observa algún signo de dolor. Realizar seguimiento y cuidados postoperatorios 4 veces al día durante los primeros 3 días preoperatorios, de acuerdo con las directrices para la evaluación y manejo del dolor en roedores y conejos23,24.
- Asegurar analgesia postoperatoria con parche de fentanilo (12 μg/h) aplicado en el oído externo, meloxicam 1x/SC durante 3 días y metadona como terapia de rescate, junto con una hoja de puntuación para la evaluación del dolor (Archivo complementario).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La creación de un muñón y un aneurisma de bifurcación fue exitosa en los 5 conejos blancos de Nueva Zelanda sin complicaciones intraoperatorias. No se observó mortalidad durante la cirugía o durante el período de seguimiento de 24 ± 2 días. Un conejo experimentó complicaciones postoperatorias con un síndrome vestibular y ceguera del lado derecho. El animal se recuperó completa y espontáneamente después de 24 h. Esta complicación no interfirió con sus actividades normales (movimientos libres, ingesta de agua y alimentos, interacciones con otros animales) y no requirió ningún tratamiento específico. No hubo rotura espontánea de aneurisma.
La duración promedio de la cirugía fue de 221 min (variando entre 190 y 255 min). Todos los aneurismas fueron patentes inmediatamente después de la cirugía, excepto un aneurisma de bifurcación que mostró una reacción tisular extrema debido a la incubación de elastasa y una trombosis inmediata. En el seguimiento, la permeabilidad del aneurisma se confirmó mediante angiografía por resonancia magnética (Figura 3) e inspección macroscópica después de la extracción de tejido (Figura 4). A excepción del aneurisma de bifurcación que ya se trombosó durante la cirugía, todos los aneurismas seguían siendo patentes en el criterio de valoración de seguimiento. Esto resultó en una tasa de permeabilidad del 90% (9 de 10).
La inspección macroscópica y la medición de los aneurismas después del muestreo muestran un crecimiento de todos los aneurismas con un tamaño promedio de 5,4 mm x 2,4 mm x 2,3 mm ± 1 mm x 0,6 mm x 0,3 mm en el momento de la creación y 4,5 mm x 3,1 mm x 2,5 mm ± 1,5 mm x 0,9 mm x 0 mm en la recolección del aneurisma del muñón; y 3,4 mm x 2 mm x 2,1 mm ± 0,6 mm x 1 mm x 0,4 mm en la creación y 3,8 mm x 2,8 mm x 2,6 mm ± 1,2 mm x 0,3 mm x 0,6 mm en la recolección de los aneurismas de bifurcación. Curiosamente, los aneurismas de bifurcación crecieron más que los aneurismas de muñón con un volumen medio de 14,4 mm 3 ± 3,5 mm 3 en la creación y 28,6 mm 3 ± 16,4 mm 3 en la extracción (relación 1,9) frente a un volumen en la creación de 30,8 mm 3 ± 15 mm 3 y 34,9 mm 3 ± 24,1 mm 3 en la extracción (relación 1,1) para la versión de muñón.
Figura 1: Pasos de la cirugía. (A) Aplicación de los 2 clips temporales en el CCA derecho: el primero en su origen desde el tronco braquiocefálico y el segundo ~2 cm distal al primero. El asterisco indica la localización de la arteriotomía con un catéter intravenoso de 22 G (catéter IV). (B) Después de la inserción y fijación del catéter IV con una ligadura 4-0, enjuague el segmento con NaCl heparinizado (500 U/100 ml de solución salina al 0,9%) e inyecte 0,1-0,2 ml de elastasa (100 U previamente disuelto en 5 ml de tampón RIS). Incubar durante 20 min. (C) Aplicar 2 ligaduras no reabsorbibles (6-0): la primera 5 mm distal al clip proximal y la segunda justo proximalmente debajo de la arteriotomía. (D) Cortar el vaso ~ 3 mm por encima de las ligaduras para crear el aneurisma del muñón y el injerto autólogo para el aneurisma de bifurcación. (E) Anastomosis del CCA derecho y el injerto autólogo en el CCA izquierdo para crear el aneurisma de bifurcación. (F) Resultado final con un aneurisma de muñón en el lado derecho y un aneurisma de bifurcación en el lado izquierdo. Abreviaturas: CCA = arteria carótida común; IV = intravenosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fotodocumentación intraoperatoria de los resultados. La línea punteada amarilla representa la línea media con indicación de las direcciones craneal y caudal. (A) Vista del aneurisma del muñón en el lado derecho del cuello. El SCEM se retrae medialmente por medio de un bucle de vaso (en azul). (B) Vista del aneurisma de bifurcación en el lado izquierdo del cuello. Abreviaturas: SCEM = músculo esternocéfalo; SA = aneurisma del muñón; JV = vena yugular; rCCA: arteria carótida común derecha; lCCA= arteria carótida común izquierda; Tr = Tráquea; * = Rama recurrente o laríngea; BA = Aneurisma de bifurcación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de la angiografía por resonancia magnética en el seguimiento. Imágenes de secuencias TOF tridimensionales adquiridas con una resonancia magnética de 3 Tesla, enfocadas en las arterias del cuello. (A) Aneurisma del muñón (flecha amarilla) en la arteria subclavia derecha. (B) Aneurisma de bifurcación (flecha amarilla) en la bifurcación creada al anastomosar el CCA derecho en el izquierdo. Abreviaturas: TOF = tiempo de vuelo; RM = resonancia magnética; CCA = arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fotodocumentación macroscópica después de la extracción de tejido. Los surcos mayores (2 divisiones) en el clip indican 1 mm y los surcos menores en el medio (una división) indican 0.5 mm. (A) Aneurisma del muñón en el tronco braquiocefálico y la arteria subclavia derecha. (B) Aneurisma de bifurcación en la bifurcación creada por la anastomosación del CCA derecho en el izquierdo. Abreviaturas: SA = Aneurisma del muñón; BCT = tronco braquiocefálico; rSC = arteria subclavia derecha; BA = aneurisma de bifurcación; CCA = arteria carótida común; rCCA = CCA derecho; lCCA = CCA izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Hallazgos histológicos de aneurismas de muñón y bifurcación. Muestra teñida con hematoxilina-eosina (aumento de 2 veces). (A) Descripción microscópica de un aneurisma de muñón (a) con el tronco braquiocefálico (b) y la arteria subclavia derecha (c). (*) indica la dirección del flujo sanguíneo. (B) Visión microscópica de un aneurisma de bifurcación (a) con el CCA proximal izquierdo (b), el CCA izquierdo distal (c) y el CCA derecho distal (d). (*) indica la dirección del flujo sanguíneo. En los recuadros en (A) y (B), I) representa la túnica íntima de la pared del aneurisma, II) la túnica media, y III) la túnica externa (aumento de 20 veces). Abreviaturas: CCA = arteria carótida común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La técnica más común para la creación de aneurismas implica la creación de un aneurisma de muñón en el origen del CCA derecho, ya sea a través de un método abierto o endovascular. El modelo ha sido validado para ser un aneurisma estable no creciente que permanece abierto con el tiempo20,21. La segunda técnica posible consiste en la creación microquirúrgica de un aneurisma de bifurcación arterial mediante la anastomosación del CCA derecho en el izquierdo y la sutura de una bolsa de aneurisma en la bifurcación 14,22,23. Aunque ambos métodos han demostrado ser adecuados para la prueba de dispositivos endovasculares y el estudio de la fisiopatología, las morfologías del aneurisma y, por lo tanto, las fuerzas hemodinámicas y las características de flujo involucradas son sustancialmente diferentes. Dado que los modelos existentes permiten la creación de un solo tipo de aneurisma por animal, actualmente es difícil una comparación directa entre el curso natural de los aneurismas del tipo bifurcación con los del tipo muñón.
De hecho, las diferencias fisiológicas entre los animales (como la presión arterial o el contenido exacto de colágeno de la pared del vaso) no siempre se pueden controlar completamente en un entorno experimental y pueden influir en la biología del aneurisma y el curso natural. Este estudio demuestra la viabilidad de crear un modelo de conejo con condiciones hemodinámicas y de pared degenerada tanto de tocón como de bifurcación en el mismo animal (o en un solo animal). Esta técnica produjo aneurismas reproducibles con baja morbilidad y mortalidad y una alta tasa de permeabilidad (90%). El principal inconveniente de este método sigue siendo el mismo que para la creación del muñón clásico o los modelos de bifurcación en sí: la necesidad de equipos de laboratorio sofisticados y habilidades microquirúrgicas específicas.
Especialmente se identificaron dos pasos críticos durante esta cirugía: el primero es la disección y exposición del CCA derecho hasta su origen en el tronco braquiocefálico. Las siguientes estructuras vitales pueden estar particularmente en riesgo durante este enfoque: la tráquea, la vena yugular y el nervio laríngeo. Como la manipulación de la tráquea puede afectar la respiración, la intubación previa asegura la permeabilidad de las vías respiratorias. Además, al ser la cirugía larga y estar cerca de estructuras vitales, el monitoreo completo es útil para reconocer rápidamente cualquier desviación fisiológica. El cirujano también debe prestar atención para evitar la presión directa o la tracción extrema en la tráquea. La vena yugular corre directamente al lado de la carótida y, en ciertos casos, es adherente a ella. Se necesita un cuidado extremo para evitar cualquier lesión. Recomendamos proteger la vena y mantenerla húmeda mediante la aplicación de un hisopo húmedo.
Por último, estudios previos ya han descrito la importancia de preservar los nervios laríngeos. Cualquier lesión en estos nervios conduciría postoperatoriamente a la aparición de un estridor con problemas respiratorios consecutivos y alta probabilidad de muerte del animal. Para prevenir la lesión iatrogénica de los nervios, la disección de CCA debe evitar la tracción de los tejidos que rodean la arteria. Recomendamos el uso de tijeras para cortar los tejidos adheridos en lugar de distraerlos. Los nervios también deben identificarse tan pronto como sea posible después de la retracción de la musculatura para mantenerlos bajo control visual durante la cirugía. El segundo paso crítico es la creación de una microanastomosis sin tensión con el aneurisma digerido por elastasa. Este aneurisma presenta una alta degeneración de su estructura mural, dificultando la manipulación de los tejidos. Requiere buenas habilidades microquirúrgicas, y se espera una curva de aprendizaje.
Además, recomendamos seleccionar conejos que pesen al menos 4,0 kg (edad media de 25 (±5) semanas) para garantizar un tamaño correcto de los vasos del cuello. En el modelo clásico de aneurisma de muñón único, la principal complicación reportada en la literatura fue la necrosis traqueal después de la aplicación de elastasa debido a arterias traqueoesofágicas que surgen del CCA derecho. Ya se han sugerido varias modificaciones de las técnicas para evitar el problema 13,24,25,26. Este enfoque permite la fácil identificación de estas ramas y su coagulación antes de la aplicación de elastasa para evitar cualquier salida de la solución de elastasa y complicaciones similares.
El régimen de anticoagulación aplicado durante la cirugía consiste en la aplicación de heparina antes de la primera aplicación del clip en el CCA derecho y antes de retirar el clip, así como la restauración de la circulación en el CCA izquierdo. Esto podría prevenir eficazmente la formación de trombos debido a la interrupción temporal del flujo y la manipulación de los vasos. Además, se administra una dosis única de aspirina (10 mg/kg IV) inmediatamente después del final de la cirugía para prevenir la formación de trombos debido al efecto trombogénico del material de sutura y la elastasa. Este protocolo permite el control de eventos trombogénicos y asegurar la permeabilidad del aneurisma sin aumentar las complicaciones hemorrágicas.
El modelo de muñón es el modelo de conejo de aneurisma sacular más común y ya se ha utilizado varias veces para estudios traslacionales de terapias endovasculares. El modelo de bifurcación también está bien descrito en la literatura y es adecuado para el estudio de la fisiopatología del aneurisma y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, ambos modelos muestran morfologías distintas, lo que indica características hemodinámicas distintas. Se sabe que los aneurismas aparecen preferentemente en la bifurcación y que el crecimiento depende del esfuerzo cortante de la pared27,28. Publicaciones anteriores también mostraron mayor trombosis espontánea en aneurismas de pared lateral creados quirúrgicamente en comparación con los de bifurcación29 y una mayor tasa de oclusión del aneurisma del muñón después de la desviación del flujo en comparación con otros modelos más complejos8; Sin embargo, la comparación siempre fue entre dos animales diferentes.
En el presente estudio, se crearon aneurismas estándar de 2-4 mm de diámetro, como se describió previamente 14,22,29,30,31,32,33,34,35,36. Se intentó crear un aneurisma de muñón con un tamaño similar al de los aneurismas de bifurcación para la comparación. Por lo tanto, el volumen actual es algo menor como se ha reportado 5,8,10,11,13,21. Sin embargo, ambos aneurismas mostraron una tendencia a crecer a 1 mes de seguimiento. Por lo tanto, un período de seguimiento más largo podría inducir la formación de aneurismas con mayores volúmenes, lo que permitiría una mejor comparación a largo plazo con los aneurismas en humanos. Además, estos hallazgos histológicos, basados en la tinción hematoxilina-eosina, muestran una pared de aneurisma celular y la presencia de células musculares lisas en un patrón lineal o desorganizado, así como una desorganización de las fibras elásticas (Figura 5). Estos resultados se correlacionan con los hallazgos actuales que muestran similitudes histológicas entre los aneurismas inducidos por elastasa de conejo y los aneurismas intracraneales en humanos 11,32,37,38,39,40,41.
Los resultados muestran la viabilidad técnica de crear aneurismas de muñón y bifurcación utilizando el mismo enfoque quirúrgico. La limitación de este estudio es el pequeño tamaño de la muestra, que no permite el análisis estadístico o una comparación real de las diferencias histológicas entre los aneurismas de muñón y bifurcación. Sin embargo, este modelo ofrece la posibilidad de investigar las diferencias entre ambos aneurismas en términos de crecimiento, rotura, oclusión espontánea y cambios histológicos en futuros experimentos con tamaños de muestra aumentados y diferentes tiempos de seguimiento, para determinar con precisión las ventajas y las características de ambos tipos de aneurismas. Además, este nuevo modelo quirúrgico permite la aplicación de dispositivos endovasculares en dos configuraciones y condiciones de flujo distintas en un animal, así como durante un procedimiento único. Esto reduce el número de animales necesarios y potencialmente aumenta la eficiencia de los ensayos preclínicos.
Para concluir, este estudio describe un método reproducible para crear 2 aneurismas con distintas condiciones de flujo y paredes altamente degeneradas dentro de un solo animal. El modelo propuesto permite una comparación directa del curso natural y los efectos de las terapias endovasculares de los aneurismas sacculares con respecto al papel de la hemodinámica. Por último, proporciona un modelo eficiente que contribuye a la reducción de los animales utilizados y los costos experimentales generales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Hans Rudolf Widmer, al Dr. Luca Remonda y al profesor Javier Fandino por su apoyo científico y contribución técnica a este trabajo. Un agradecimiento especial a Olgica Beslac por sus consejos durante los procedimientos y a Kay Nettelbeck por su ayuda. Además, agradecemos a Daniela Casoni DVM, PhD y med. vet. Luisana García, PD Dra. Alessandra Bergadano y Dra. Carlotta Detotto por su dedicado apoyo veterinario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| 6-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Biemer vessel clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Bycilces spotlight | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrocardiogram electrodes | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Heating pad or heating forced-air warming system | |||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamine | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| lid retractor | Approach | ||
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medication |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-forceps curved | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-015-15 | |
| Micro-forceps straight 2x | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-010-15 | |
| Microscissors | Ulrich Swiss , Switzerland | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Needle 23 G | arteriotomy | ||
| Needle holder | |||
| O2-Face mask | |||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | topical application | |
| Povidone iodine | Mundipharma Medical Company | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | General anesthesia | |
| Pulse oxymeter | |||
| Rectal temperature probe (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusion | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Local anesthesia |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Small animal shaver | |||
| Soft tissue forceps | |||
| Soft tissue spreader | |||
| Stainless steel sponge bowls | |||
| Sterile micro swabs | |||
| Stethoscope | |||
| Surgery drape | |||
| Surgical scissors | |||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Elastase solution |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | |||
| vessel loop | Approach | ||
| video camera or smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T |
References
- Grasso, G., Alafaci, C., Macdonald, R. L. Management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: State of the art and future perspectives. Surgical Neurology International. 8, 11 (2017).
- Raymond, J., et al. Long-term angiographic recurrences after selective endovascular treatment of aneurysms with detachable coils. Stroke. 34 (6), 1398-1403 (2003).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 20 (2019).
- Bouzeghrane, F., et al. In vivo experimental intracranial aneurysm models: a systematic review. American Journal of Neuroradiology. 31 (3), 418-423 (2010).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: a systematic review. Brain Sciences. 10 (3), 134 (2020).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Fahed, R., et al. Testing flow diversion in animal models: a systematic review. Neuroradiology. 58 (4), 375-382 (2016).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 32 (3), 595-601 (2011).
- Ding, Y. H., et al. Long-term patency of elastase-induced aneurysm model in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 27 (1), 139-141 (2006).
- Short, J. G., et al. Elastase-induced saccular aneurysms in rabbits: comparison of geometric features with those of human aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 22 (10), 1833-1837 (2001).
- Andereggen, L., et al. Three-dimensional visualization of aneurysm wall calcification by cerebral angiography: Technical case report. Journal of Clinical Neuroscience. 73, 290-293 (2020).
- Hoh, B. L., Rabinov, J. D., Pryor, J. C., Ogilvy, C. S. A modified technique for using elastase to create saccular aneurysms in animals that histologically and hemodynamically resemble aneurysms in human. Acta Neurochirurgica. 146 (7), 705-711 (2004).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
- Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Portier, K., Ida, K. K. The ASA Physical Status Classification: What is the evidence for recommending its use in veterinary anesthesia?-A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 5, 204 (2018).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Strange, F., et al. Fluorescence angiography for evaluation of aneurysm perfusion and parent artery patency in rat and rabbit aneurysm models. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59782 (2019).
- Altes, T. A., et al. 1999 ARRS Executive Council Award. Creation of saccular aneurysms in the rabbit: a model suitable for testing endovascular devices. American Journal of Roentgenology. 174 (2), 349-354 (2000).
- Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. Journal of NeuroInterventional Surgery. 8 (5), 521-525 (2016).
- Sherif, C., Marbacher, S., Erhardt, S., Fandino, J. Improved microsurgical creation of venous pouch arterial bifurcation aneurysms in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 32 (1), 165-169 (2011).
- Bavinzski, G., et al. Experimental bifurcation aneurysm: a model for in vivo evaluation of endovascular techniques. Minimally Invasive Neurosurgery. 41 (3), 129-132 (1998).
- Lewis, D. A., et al. Morbidity and mortality associated with creation of elastase-induced saccular aneurysms in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 30 (1), 91-94 (2009).
- Wang, K., et al. Neck injury is critical to elastase-induced aneurysm model. American Journal of Neuroradiology. 30 (9), 1685-1687 (2009).
- Cesar, L., et al. Neurological deficits associated with the elastase-induced aneurysm model in rabbits. Neurological Research. 31 (4), 414-419 (2009).
- Aoki, T., Nishimura, M. The development and the use of experimental animal models to study the underlying mechanisms of CA formation. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 535921 (2011).
- Frosen, J., Cebral, J., Robertson, A. M., Aoki, T. Flow-induced, inflammation-mediated arterial wall remodeling in the formation and progression of intracranial aneurysms. Neurosurgical Focus. 47 (1), 21 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Comparison of aneurysm patency and mural inflammation in an arterial rabbit sidewall and bifurcation aneurysm model under consideration of different wall conditions. Brain Sciences. 10 (4), 197 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32 (4), 772-777 (2011).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rat model - Introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of NeuroInterventional Surgery. , (2021).
- Lyu, Y., et al. An effective and simple way to establish eastase-induced middle carotid artery fusiform aneurysms in rabbits. Biomed Research International. 2020 (10), 1-12 (2020).
- Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (4), 411-415 (2018).
- Kang, W., et al. A modified technique improved histology similarity to human intracranial aneurysm in rabbit aneurysm model. Neuroradiology Journal. 23 (5), 616-621 (2010).
- Frosen, J., et al. Remodeling of saccular cerebral artery aneurysm wall is associated with rupture: histological analysis of 24 unruptured and 42 ruptured cases. Stroke. 35 (10), 2287-2293 (2004).
- Frosen, J., et al. Growth factor receptor expression and remodeling of saccular cerebral artery aneurysm walls: implications for biological therapy preventing rupture. Neurosurgery. 58 (3), 534-541 (2006).
