Summary
Detta protokoll beskriver stegen för skapandet av en kaninmodell med två elastassmälta aneurysmer med olika hemodynamik (stubb- och bifurkationskonstellation). Detta möjliggör testning av nya endovaskulära enheter i aneurysmer med olika angioarkitektur och hemodynamiska förhållanden inom ett enda djur.
Abstract
Prekliniska djurmodeller med hemodynamiska, morfologiska och histologiska egenskaper nära humana intrakraniella aneurysmer spelar en nyckelroll i förståelsen av de patofysiologiska processerna och utvecklingen och testningen av nya terapeutiska strategier. Denna studie syftar till att beskriva en ny kaninaneurysmmodell som möjliggör skapandet av två elastassmälta sackulära aneurysmer med olika hemodynamiska förhållanden inom samma djur.
Fem kvinnliga Nya Zeeland vita kaniner med en medelvikt på 4,0 (± 0,3) kg och medelålder på 25 (±5) veckor genomgick mikrokirurgisk stubbe och bifurcation aneurysm skapande. En aneurysm (stubbe) skapades av höger vanlig halspulsåder (CCA) exponering vid sitt ursprung vid brachiocephalic stammen. Ett tillfälligt klipp applicerades vid CCA-ursprunget och ett annat, 2 cm ovanför. Detta segment behandlades med en lokal injektion av 100 U elastas i 20 minuter. En andra aneurysm (bifurcation) skapades genom suturering av en elastasbehandlad artärpåse i end-to-side-anastomosen av höger CCA till vänster CCA. Patency kontrollerades av fluorescensangiografi omedelbart efter skapandet.
Den genomsnittliga operationstiden var 221 min. Skapandet av två aneurysmer i samma djur var framgångsrikt hos alla kaniner utan komplikationer. Alla aneurysmer patenterades omedelbart efter operationen förutom en bifurkationsaneurysm, som visade en extrem vävnadsreaktion på grund av elastasinukubation och en omedelbar intraluminal trombos. Ingen dödlighet observerades under operation och upp till en månads uppföljning. Sjukligheten var begränsad till ett övergående vestibulärt syndrom (en kanin), som återhämtade sig spontant inom en dag.
Demonstreras här för första gången är möjligheten att skapa en två-aneurysm kaninmodell med stubbe och bifurcation hemodynamiska egenskaper och mycket degenererade väggförhållanden. Denna modell möjliggör studier av den naturliga kursen och potentiella behandlingsstrategier på grundval av aneurysmbiologi under olika flödesförhållanden.
Introduction
Intrakraniell aneurysm är ett allvarligt tillstånd med en dödlighet efter bristning som når 50% och långvarig funktionshinder hos 10-20% av patienterna1. Det senaste decenniet har sett en snabb utveckling av endovaskulära behandlingsalternativ men samtidigt också en ökande återfallsfrekvens med upp till 33% av aneurysmrecanalisering efter spolning 2,3. För att bättre förstå patofysiologin bakom aneurysmocklusion och recanalisering, liksom för utveckling och testning av nya endovaskulära enheter, finns det för närvarande ett behov av tillförlitliga prekliniska modeller vars hemodynamiska, morfologiska och histologiska egenskaper efterliknar de hos humana intrakraniella aneurysmer 4,5,6 . Från och med idag finns det ingen definierad modell som standard för preklinisk prövning, och ett stort antal arter och tekniker är tillgängliga för forskare 7,8.
Kaninen är emellertid en art av särskilt intresse på grund av storleken och hemodynamiska likheter mellan dess nackartärer och de mänskliga cerebrala kärlen, liksom dess liknande koagulations- och trombolysprofiler. Flera modeller med elastassmälta sackulära aneurysmer på de vanliga halspulsådrorna (CCA) har visat kvalitativa och kvantitativa likheter med humana intrakraniella aneurysmer när det gäller flödesförhållanden, geometriska egenskaper och väggegenskaper 9,10,11,12. Denna studie syftar till att beskriva en teknik för att skapa en ny kaninaneurysmmodell med både stubb- och bifurkationselastassmälta aneurysmer i samma djur. De kirurgiska teknikerna är inspirerade av Hoh et al.13 och Wanderer et al.14 med små modifieringar för att ge en god standardisering och reproducerbarhet och för att säkerställa låg dödlighet och sjuklighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Experimentet godkändes av den lokala kommittén för djurvård i kantonen Bern, Schweiz (ansökningsnummer BE108/16), och all djurvård och procedurer utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och 3R-principerna15,16. Data rapporteras enligt ARRIVE-riktlinjerna. Perioperativ hantering utfördes av en styrelsecertifierad veterinäranestesiolog. För studien inhystes kvinnliga nya zeeländska vita kaniner, med en medelvikt på 4,0 (± 0,3) kg och medelålder på 25 (±5) veckor, vid en rumstemperatur på 22-24 ° C med en 12-timmars ljus / mörk cykel med fri tillgång till vatten, pellets och hö.
1. Pre-kirurgisk fas och anestesi
- Utför en klinisk undersökning som rekommenderas av Association of veterinary Anesthetists och European and American College of Veterinary Anesthesia and analgesia för att bekräfta att kaninerna är friska genom att väga varje djur, utvärdera slemhinnan, dokumentera kapillärpåfyllningstiden och pulskvaliteten och utföra en lung- och hjärtauskultation samt en bukpalpation.
- Baserat på det kliniska fyndet, tillskriv en American Society of Anesthesiologists (ASA) klassificering till varje kanin17. Utför kirurgi endast på djur med en ASA I-poäng.
- Raka båda yttre öronen och applicera prilokain-lidokainkräm på aurikulära artärer och vener. Uppnå djup sedering med en kombination av ketamin 20 mg/kg, dexmedetomidin 0,1 mg/kg och metadon 0,3 mg/kg injicerat subkutant (SC). Lämna djuren ostörda i 15 min. Ge kompletterande syresättning (3 L/min) genom en lossad ansiktsmask och övervaka med en pulsoximeter.
- Placera en 22 G kanyl i den vänstra aurikulära centrala artären såväl som i en aurikulär ven. Inducera narkos med propofol 1-2 mg/kg intravenöst (IV) tills effekt (förlust av sväljreflex). Fortsätt med endo-trakeal intubation via ett silikonrör (3 mm innerdiameter).
- Raka pannan för att placera de pediatriska elektroencefalografiska (EEG) sensorerna. Raka det kirurgiska fältet och injicera ropivakainhydroklorid 0,75 % intradermalt.
- Placera kaninen på operationsbordet i dorsal recumbency, installera full övervakning och anslut endo-trakealröret till ett pediatriskt cirkelsystem med låg resistans. Bibehålla anestesi vid administrering av isofluran i syre, med inriktning på en maximal sluttidvattenkoncentration (Et) på 1,3 %.
- Ge en kontinuerlig infusion av ringerlaktat 5 ml/kg/h genom venös åtkomst. Säkerställa klinisk och instrumentell övervakning tills extubation med hjälp av pulsoximetri, doppler och invasivt blodtryck, 3-bly elektrokardiogram, EEG, rektal temperatur och inhalerade och utandade gaser.
- Desinficera det kirurgiska fältet med povidonjod från manubrium sterni till käkvinklar och applicera den sterila draperingen. Under operationen, ge analgesi med lidokain (infusion med konstant hastighet (CRI) på 50 μg/kg/min) och fentanyl (CRI på 3-10 μg/kg/h). Utför spontan eller assisterad ventilation. Tillåt tillåtande hyperkapni.
- Utför minst en arteriell blodgasanalys under operationen. Vid hypotoni (genomsnittligt arteriellt tryck under 60 mmHg), behandla det med noradrenalin, titrerat tills effekt. Använd en värmedyna eller ett uppvärmningssystem för varmluftsvärme för att förhindra hypotermi (mål: rektal temperatur 37,5-38,5 °C).
OBS: Eftersom det invasiva arteriella blodtrycket mäts vid vänster öronartär, kommer klippningen av vänster CCA att stoppa blodflödet och undertrycka kurvan. Blodtrycket måste sedan mätas med dopplerteknik tills kärlet öppnas igen.
2. Kirurgi
- Närma sig
- Gör ett median hudsnitt från hyoidbenet tills en punkt 1,5 cm caudal till manubrium sterni med en skalpell. Förbered subkutan och fettvävnad från det mediala snittet medan du utför noggrann hemostas.
- Frigör sternocephalicusmuskeln från den vidhäftande bindväven och applicera lidokain lokalt (2-4 mg/kg, föredra lidokain 1%) för att undvika myoklonus. Exponera rätt CCA medialt av sternocephalicusmuskeln och håll den våt med våta svabbar.
- Förbered nu de laterala och proximala delarna av sternocephalicusmuskeln och dra tillbaka den medialt med en kärlslinga för att exponera CCA. Identifiera den yttre halsvenen och skydda den med en våt mikropinne.
- Dissekera bindväven försiktigt längs den proximala CCA tills bifurkationen av brachiocephalic stammen för att exponera artären. I närvaro av små grenar som kommer från artären, koagulera dem med cauterizern.
OBS: Var noga med att undvika nervskador.
- Skapande av stubbaneurysm och vävnadsskörd för bifurcationen aneurysm
- Innan du klipper rätt CCA, mät antikoagulationstiden (ACT) och ge natriumheparin (80 EI / kg) systemiskt via öronvenen (utförd av anestesiteamet) för att undvika tromboemboliska händelser.
- Applicera nu 2 tillfälliga klipp: den första vid CCA: s ursprung och den andra 2 cm distal från den (Figur 1A). Placera en gummikudde under kärlet och skölj med papaverin HCL (40 mg / ml; 1:1 upplöst i 0,9% saltlösning) för vasodilatation.
- Ta bort adventitia försiktigt med hjälp av mikroscissorer. Utför en arteriotomi under det distala klämman med en 22 G IV-kateter och sätt in katetern kaudalt upp till det proximala klämman (figur 1A,B).
- Spola segmentet intraluminalt med hepariniserad NaCl (500 U/100 ml i 0,9% saltlösning) tills det inte finns något blod synligt och fixera slutligen katetern med en ligatur (4-0). Injicera nu 0,1-0,2 ml elastas (100 IE tidigare upplöst i 5 ml Tris-Buffer) genom katetern och inkubera i 20 minuter (figur 1B).
- Börja med dissektion på vänster sida för att exponera vänster CCA (se avsnitt 2.3). Efter 20 minuters inkubationstid med elastas, rensa elastaslösningen och byt sprutan för att skölja artärsegmentet cirka 10 gånger med 0,9% NaCl.
- Applicera 2 ligaturer (6-0): den första 5 mm distal av proximal klämma och den andra bara proximalt, under arteriotomin (figur 1C). Skär kärlet ~ 3 mm ovanför den första ligaturen och en gång till mellan den andra ligaturen och det distala klämmandet. Förvara detta autologa transplantat i en hepariniserad lösning (500 U/100 ml i 0,9% saltlösning) tills bifurcationsaneurysmen skapas (figur 1D). Slutligen öppna försiktigt det första proximala klippet och mät aneurysmen (längd, bredd och djup).
- Bifurcation aneurysm skapande
- Förbered vänster sida genom att dissekera sternocephalicusmuskeln medialt för att exponera ~ 2 cm av vänster CCA. Applicera lidokain lokalt på muskeln för att undvika myoklonus.
- Underlägg halspulsådern med en gasbindboll och en liten vattpinne med en bit handske. Applicera lite papaverin. HCl lokalt (40 mg/ml; 1:1 upplöst i 0,9% saltlösning). Fortsätt att arbeta under mikroskopisk vy: förbered aneurysmpåsen och ta bort adventitia. Mät aneurysmpåsen (längd, bredd, djup).
- Spola den öppna delen av höger CCA med hepariniserad NaCl och byt vid behov ut klämman så att den har ~ 1 cm för att möjliggöra fria manipuleringar för suturen. Ta bort adventitia försiktigt och gör ett ~ 2 mm längsgående snitt i sidled i stubben på höger CCA.
- Applicera nu två tillfälliga klipp på vänster CCA för att avgränsa ett segment på ~ 1 cm och ta bort adventitia däremellan. Utför en arteriotomi med en 23 G nål. Spola segmentet med hepariniserad NaCl (500 U/100 ml i 0,9% saltlösning). Förstora arteriotomin med hjälp av mikroskoporer till ~ 4-5 mm för att möjliggöra suturering av höger CCA och aneurysmpåsen (figur 1E). Bevattna kärlen under hela sutureringsproceduren och skydda dem med våta mikrobyten.
- Utför anastomosen med 9-0 icke resorberbar sutur.
- Suturera den proximala bakväggen i höger halspulsåder trubbig med 5 stygn, med början vid den proximala kanten av arteriotomin på vänster CCA. Suturera sedan baksidan av aneurysmpåsen med 4-5 stygn, med början vid den distala kanten av arteriotomin på vänster CCA.
- Fortsätt med den distala baksidan vid nivån av fiskmunnens snitt för att suturera med den vertikala baksidan av aneurysmtransplantatet med 3 stygn. Suturera framsidan av fiskmunnen snitt med 3 stygn, börja uppåt och rör sig nedåt.
- Avsluta med den främre suturen mellan vänster CCA och framsidan av aneurysmtransplantatet och höger CCA med ~ 6 stygn. Innan du avslutar anastomosen, skölj kärlen med hepariniserad 0,9% saltlösning intraluminalt.
- Innan du tar bort klämman, mät anti-koagulationstiden (ACT) en gång till och administrera en anpassad dos heparin systemiskt (mål: 2-3 gånger baslinjen ACT).
- Ta bort klämman på höger CCA medan du sätter lite tryck på anastomosen med mikropinnar för hemostas. Fortsätt sedan genom att ta bort det distala klippet från vänster CCA. Om det inte finns någon större blödning, fortsätt med att ta ut det proximala klämman på vänster CCA för att tillåta blodflöde. Om det finns någon blödning från anastomosen, applicera lite tryck med gasbindbollen och vattpinnen; vänta ett par minuter. Om det kvarstår, byt ut klippen och utför omstygn.
OBS: En blodförlust på mer än 20-30 ml kan äventyra återhämtningsfasen.
- Patency kontroll och dokumentation
- När du har öppnat alla kärl, dokumentera resultaten fotografiskt och mät dem (figur 1F och figur 2A,B).
- Bekräfta återställandet av flödet i den distala CCA genom den invasiva arteriella blodtryckskurvan (mätt vid öronartären, en direkt gren av den yttre halshinnan), som också bör återgå till det normala.
- Utför fluorescensangiografi genom att administrera 1 ml fluorescein IV, med 2 bandpassfilter, en videokamera och en cykelstrålkastare. Se tidigare publikationer för beskrivning av hela förfarandet18,19.
- Nedläggning
- Anpassa fettkudden på anastomosen och suturera den med en 4-0 resorberbar sutur. Slutligen sutur subcutis och hud med enstaka stygn med 4-0 resorberbar sutur.
3. Posturgisk fas
- I slutet av operationen, avbryt isofluran och systemisk analgesi utan reversion för att bibehålla den analgetiska effekten. Se till att kontrollen av sväljningsreflexen har återvänt innan du utför trakeal extubation.
- Administrera meloxikam 0,5 mg/kg IV för att säkerställa analgesi, acetylsalicylsyra (ASS) 10 mg/kg IV för att förhindra omedelbara trombotiska händelser, vitamin B12 100 μg SC och klaxyl 20 mg/kg IV som antibiotikaprofylax.
- Ge kompletterande syresättning och uppvärmning tills kaninen spontant återfår sternal recumbency. Utför räddningsanalgesi med metadon om något tecken på smärta observeras. Utför postoperativ uppföljning och vård 4 gånger om dagen under de första 3 preoperativa dagarna, i enlighet med riktlinjerna för bedömning och hantering av smärta hos gnagare och kaniner23,24.
- Se till att postoperativ analgesi med fentanylplåster (12 μg/h) appliceras på ytterörat, meloxikam 1x/ SC i 3 dagar och metadon som räddningsbehandling, tillsammans med ett poängblad för smärtbedömning (Tilläggsfil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skapandet av en stubbe och en bifurcation aneurysm var framgångsrik i alla 5 Nya Zeeland vita kaniner utan intraoperativa komplikationer. Ingen mortalitet observerades under operationen eller under uppföljningsperioden på 24 ± 2 dagar. En kanin upplevde postoperativa komplikationer med ett vestibulärt syndrom och en blindhet på höger sida. Djuren återhämtade sig helt och spontant efter 24 timmar. Denna komplikation störde inte dess normala aktiviteter (fria rörelser, vatten- och matintag, interaktioner med andra djur) och krävde ingen specifik behandling. Det fanns ingen spontan aneurysmbrott.
Den genomsnittliga operationstiden var 221 min (mellan 190 och 255 min). Alla aneurysmer patenterades omedelbart efter operationen, förutom en bifurkationsaneurysm som visade en extrem vävnadsreaktion på grund av elastasinkubation och en omedelbar trombos. Vid uppföljningen bekräftades aneurysmpatency genom magnetresonansangiografi (figur 3) och makroskopisk inspektion efter vävnadsextraktion (figur 4). Med undantag för bifurcationsaneurysmen som redan tromboserades under operationen var alla aneurysmer fortfarande patent vid uppföljningsslutpunkten. Detta resulterade i en patency på 90% (9 av 10).
Makroskopisk inspektion och mätning av aneurysm efter provtagning visar en tillväxt av alla aneurysmer med en medelstorlek på 5,4 mm x 2,4 mm x 2,3 mm ± 1 mm x 0,6 mm x 0,3 mm vid skapandet och 4,5 mm x 3,1 mm x 2,5 mm ± 1,5 mm x 0,9 mm x 0 mm vid skörd för stubbaneurysmen; och 3,4 mm x 2 mm x 2,1 mm ± 0,6 mm x 1 mm x 0,4 mm vid skapande och 3,8 mm x 2,8 mm x 2,6 mm ± 1,2 mm x 0,3 mm x 0,6 mm vid skörd för bifurkationsaneurysmerna. Intressant nog växte bifurcationseeurysmer mer än stubbaneurysmer med en medelvolym på 14,4 mm 3 ± 3,5 mm 3 vid skapandet och 28,6 mm 3 ± 16,4 mm 3 vid extraktion (förhållande 1,9) jämfört med en volym vid skapandet av 30,8 mm 3 ± 15 mm 3 och 34,9 mm 3 ± 24,1 mm 3 vid extraktion (förhållande 1,1) för stubbversionen.
Figur 1: Steg i operationen. (A) Applicering av de 2 tillfälliga klämmorna på höger CCA: den första vid dess ursprung från den brachiocephalic stammen och den andra ~ 2 cm distal till den första. Asterisken indikerar lokaliseringen av arteriotomi med en 22 G intravenös kateter (IV-kateter). (B) Efter insättning och fixering av IV-katetern med en 4-0-ligatur, spola segmentet med hepariniserad NaCl (500 U/100 ml 0,9% saltlösning) och injicera 0,1-0,2 ml elastas (100 U tidigare upplöst i 5 ml TRIS-buffert). Inkubera i 20 min. (C) Applicera 2 icke-resorberbara ligaturer (6-0): den första 5 mm distal på den proximala klämman och den andra bara proximalt under arteriotomin. (D) Skär kärlet ~ 3 mm ovanför ligaturerna för att skapa stubbaneurysmen och det autologa transplantatet för bifurkationsaneurysmen. (E) Anastomos av höger CCA och det autologa transplantatet på vänster CCA för att skapa bifurcation aneurysm. (F) Slutresultat med ett stubbaneurysm på höger sida och ett bifurcationneurysm på vänster sida. Förkortningar: CCA = vanlig halspulsåder; IV = intravenös. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intraoperativ fotodokumentation av resultaten. Den gula prickade linjen representerar mittlinjen med indikation för kraniala och kaudala riktningar. (A) Vy över stubbens aneurysm på höger sida av nacken. SCEM dras in medialt med hjälp av en kärlslinga (i blått). (B) Vy över bifurcationneurysmen på vänster sida av halsen. Förkortningar: SCEM = Sternocephalicus muskel; SA = Stubbaneurysm; JV = halsven; rCCA: höger vanlig halspulsåder; lCCA= vänster vanlig halspulsåder; Tr = Luftstrupen; * = Återkommande eller larynxgren; BA = Bifurcation aneurysm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Magnetresonansangiografiresultat vid uppföljning. Bilder från tredimensionella TOF-sekvenser förvärvade med en 3 Tesla MR, fokuserad på nackartärerna. (A) Stubbaneurysm (gul pil) på den högra subklaviska artären. (B) Bifurcation aneurysm (gul pil) på bifurkationen skapad genom anastomosering av höger CCA till vänster. Förkortningar: TOF = time-of-flight; MRI = magnetisk resonanstomografi; CCA = vanlig halspulsåder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Makroskopisk fotodokumentation efter vävnadsextraktion. Större spår (2 divisioner) på klämman indikerar 1 mm och mindre spår däremellan (en division) indikerar 0,5 mm. (A) Stubbaneurysm på brachiocephalic stammen och höger subklavisk artär. (B) Bifurcation aneurysm på bifurkationen skapad genom anastomosering av höger CCA på den vänstra. Förkortningar: SA = Stubbaneurysm; BCT = brachiocephalic stam; rSC = höger subklavisk artär; BA = bifurcation aneurysm; CCA = vanlig halspulsåder; rCCA = höger CCA; lCCA = vänster CCA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Histologiska fynd av stubb- och bifurkationsaneurysmer. Prov färgat med hematoxylin-eosin (2-faldig förstoring). (A) Mikroskopisk översikt över en stubbaneurysm (a) med brachiocephalic trunk (b) och den högra subklaviska artären (c). (*) anger blodflödets riktning. (B) Mikroskopisk översikt över ett bifurcationneurysm (a) med proximal vänster CCA (b), distal vänster CCA (c) och distal höger CCA (d). (*) anger blodflödets riktning. I infällningarna i (A) och (B) representerar I) aneurysmväggens tunica intima, II) tunica-mediet och III) tunica externa (20-faldig förstoring). Förkortningar: CCA = vanlig halspulsåder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vanligaste tekniken för att skapa aneurysm innebär skapandet av en stubbaneurysm vid ursprunget till rätt CCA, antingen genom en öppen eller en endovaskulär metod. Modellen har validerats för att vara ett stabilt icke-växande aneurysm som förblir öppet med tiden20,21. Den andra möjliga tekniken involverar mikrokirurgisk skapande av en arteriell bifurkationsaneurysm genom att anastomosera den högra CCA till vänster och suturera en aneurysmpåse på bifurkationen 14,22,23. Även om båda metoderna har visat lämplighet för testning av endovaskulära anordningar och studier av patofysiologi, är aneurysmmorfologierna och därmed de hemodynamiska krafterna och flödesegenskaperna som är inblandade väsentligt olika. Med tanke på att befintliga modeller tillåter skapandet av endast en aneurysmtyp per djur, är det för närvarande svårt att direkt jämföra den naturliga kursen av aneurysmer från bifurkationstypen med de från stubbtypen.
Faktum är att fysiologiska skillnader mellan djur (såsom blodtryck eller exakt kollageninnehåll i kärlväggen) inte alltid kan kontrolleras fullständigt i en experimentell miljö och kan påverka aneurysmbiologin och det naturliga förloppet. Denna studie visar möjligheten att skapa en kaninmodell med både stubbe och bifurcation hemodynamiska och degenererade väggförhållanden i samma djur (eller i ett enda djur). Denna teknik gav reproducerbara aneurysmer med låg sjuklighet och dödlighet och en hög patencyfrekvens (90%). Den största nackdelen med denna metod förblir densamma som för skapandet av den klassiska stubben eller bifurkationsmodellerna själva - behovet av sofistikerad laboratorieutrustning och specifika mikrokirurgiska färdigheter.
Speciellt två steg identifierades för att vara kritiska under denna operation: den första är dissektion och exponering av rätt CCA tills dess ursprung vid brachiocephalic stammen. Följande vitala strukturer kan vara särskilt utsatta under detta tillvägagångssätt: luftstrupen, halsvenen och larynxnerven. Eftersom luftrörsmanipulation kan försämra andningen, säkerställer den tidigare intubationen luftvägarnas patency. Dessutom, operationen är lång och i närheten av vitala strukturer, är full övervakning till hjälp för att snabbt känna igen eventuella fysiologiska avvikelser. Kirurgen bör också vara uppmärksam på att undvika direkt tryck eller extrem dragkraft på själva luftstrupen. Jugulärvenen löper direkt bredvid halspulsådern och är i vissa fall vidhäftande med den. Extrem försiktighet behövs för att undvika skador. Vi rekommenderar att du skyddar venen och håller den våt genom applicering av en våt vattpinne.
Slutligen har tidigare studier redan beskrivit vikten av att bevara larynxnerven. Varje lesion på dessa nerver skulle postoperativt leda till utseendet av en stridor med följd nedsatt andning och hög sannolikhet för djurets död. För att förhindra iatrogen lesion av nerverna bör CCA-dissektion undvika dragkraft av vävnaderna som rundar artären. Vi rekommenderar att du använder sax för att klippa de vidhäftande vävnaderna istället för att distrahera dem. Nerverna måste också identifieras så snart som möjligt efter indragning av muskulaturen för att hålla dem under visuell kontroll under operationen. Det andra kritiska steget är skapandet av en spänningslös mikroanastomos med den elastassmälta aneurysmen. Denna aneurysm presenterar en hög degenerering av sin väggstruktur, vilket hindrar manipuleringen av vävnaderna. Det kräver goda mikrokirurgiska färdigheter, och en inlärningskurva kan förväntas.
Dessutom rekommenderar vi att du väljer kaniner som väger minst 4,0 kg (medelålder på 25 (±5) veckor) för att garantera en korrekt storlek på halskärlen. I den klassiska aneurysmmodellen med en stubbe var den huvudsakliga rapporterade komplikationen i litteraturen trakealnekros efter applicering av elastas på grund av trakeoesofageala artärer som härrör från rätt CCA. Flera modifieringar av teknikerna har redan föreslagits för att undvika problemet 13,24,25,26. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel identifiering av dessa grenar och deras koagulering före elastasapplikation för att undvika utflöde av elastaslösningen och liknande komplikationer.
Antikoagulationsregimen som appliceras under operationen består av heparinapplikation före den första klippapplikationen vid höger CCA och innan du tar bort klämman samt återställer cirkulationen till vänster CCA. Detta kan effektivt förhindra trombbildning på grund av tillfälligt flödesavbrott och kärlmanipulation. Dessutom ges en unik dos aspirin (10 mg/kg IV) omedelbart efter avslutad operation för att förhindra trombbildning på grund av den trombogena effekten av suturmaterial och elastas. Detta protokoll möjliggör kontroll av trombogena händelser och säkerställer aneurysm patency utan att öka blödningskomplikationer.
Stubbmodellen är den vanligaste modellen för aneurysmkanin och har redan använts flera gånger för translationella studier av endovaskulära terapier. Bifurkationsmodellen är också väl beskriven i litteraturen och lämplig för studier av aneurysm patofysiologi och testning av nya terapeutiska strategier. Båda modellerna visar emellertid distinkta morfologier, vilket indikerar distinkta hemodynamiska egenskaper. Det är känt att aneurysmer företrädesvis uppträder vid bifurkation och att tillväxten är beroende av väggskjuvspänning27,28. Tidigare publikationer visade också högre spontan trombos i kirurgiskt skapade sidoväggsaneurysmer jämfört med bifurkation29 och en högre ocklusionshastighet av stubbaneurysm efter flödesavledning i jämförelse med andra mer komplexa modeller8; jämförelsen var dock alltid mellan två olika djur.
I den aktuella studien skapades standardaneurysmer med en diameter på 2-4 mm, som tidigare beskrivits 14,22,29,30,31,32,33,34,35,36. Vi siktade på att skapa en stubbaneurysm med liknande storlek som bifurcationneurysmerna för jämförelse. Således är den nuvarande volymen något mindre som har rapporterats 5,8,10,11,13,21. Båda aneurysmerna visade dock en tendens att växa vid 1 månads uppföljning. Således kan en längre uppföljningsperiod inducera aneurysmbildning med större volymer, vilket skulle möjliggöra bättre långsiktig jämförelse med aneurysmer hos människor. Dessutom visar dessa histologiska fynd, baserade på hematoxylin-eosinfärgning, en cellulär aneurysmvägg och närvaron av glattmuskelceller i ett linjärt eller ett oorganiserat mönster, liksom en desorganisation av de elastiska fibrerna (Figur 5). Dessa resultat korrelerar med aktuella fynd som visar histologiska likheter mellan kaninelastasinducerade aneurysmer och intrakraniella aneurysmer hos människor 11,32,37,38,39,40,41.
Resultaten visar den tekniska genomförbarheten av att skapa både stubb- och bifurcationneurysmer med samma kirurgiska tillvägagångssätt. Begränsningen av denna studie är den lilla provstorleken, som inte möjliggör statistisk analys eller en verklig jämförelse av de histologiska skillnaderna mellan stubb- och bifurcationneurysmer. Ändå erbjuder denna modell möjligheten att undersöka skillnaderna mellan båda aneurysmerna när det gäller tillväxt, bristning, spontan ocklusion och histologiska förändringar i framtida experiment med ökade provstorlekar och olika uppföljningstid, för att exakt bestämma fördelarna och egenskaperna hos båda typerna av aneurysmer. Dessutom tillåter denna nya kirurgiska modell applicering av endovaskulära enheter i två distinkta konfigurationer och flödesförhållanden i ett djur, liksom under ett unikt förfarande. Detta minskar antalet djur som behövs och ökar potentiellt effektiviteten i prekliniska prövningar.
Sammanfattningsvis beskriver denna studie en reproducerbar metod för att skapa 2 aneurysmer med distinkta flödesförhållanden och mycket degenererade väggar inom ett enda djur. Den föreslagna modellen möjliggör en direkt jämförelse av den naturliga kursen och effekterna av endovaskulära terapier av sackulära aneurysmer med avseende på hemodynamikens roll . Slutligen tillhandahåller den en effektiv modell som bidrar till att minska antalet djur som används och de totala försökskostnaderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Hans Rudolf Widmer, Dr Luca Remonda och Prof Javier Fandino för deras vetenskapliga stöd och tekniska bidrag till detta arbete. Ett särskilt tack till Olgica Beslac för hennes råd under procedurerna och Kay Nettelbeck för hans hjälp. Dessutom tackar vi Daniela Casoni DVM, PhD och med. veterinär. Luisana Garcia, PD Dr Alessandra Bergadano och Dr Carlotta Detotto för deras dedikerade veterinärstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| 6-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Biemer vessel clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Bycilces spotlight | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrocardiogram electrodes | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Heating pad or heating forced-air warming system | |||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamine | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| lid retractor | Approach | ||
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medication |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-forceps curved | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-015-15 | |
| Micro-forceps straight 2x | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-010-15 | |
| Microscissors | Ulrich Swiss , Switzerland | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Needle 23 G | arteriotomy | ||
| Needle holder | |||
| O2-Face mask | |||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | topical application | |
| Povidone iodine | Mundipharma Medical Company | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | General anesthesia | |
| Pulse oxymeter | |||
| Rectal temperature probe (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusion | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Local anesthesia |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Small animal shaver | |||
| Soft tissue forceps | |||
| Soft tissue spreader | |||
| Stainless steel sponge bowls | |||
| Sterile micro swabs | |||
| Stethoscope | |||
| Surgery drape | |||
| Surgical scissors | |||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Elastase solution |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | |||
| vessel loop | Approach | ||
| video camera or smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T |
References
- Grasso, G., Alafaci, C., Macdonald, R. L. Management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: State of the art and future perspectives. Surgical Neurology International. 8, 11 (2017).
- Raymond, J., et al. Long-term angiographic recurrences after selective endovascular treatment of aneurysms with detachable coils. Stroke. 34 (6), 1398-1403 (2003).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 20 (2019).
- Bouzeghrane, F., et al. In vivo experimental intracranial aneurysm models: a systematic review. American Journal of Neuroradiology. 31 (3), 418-423 (2010).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: a systematic review. Brain Sciences. 10 (3), 134 (2020).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Fahed, R., et al. Testing flow diversion in animal models: a systematic review. Neuroradiology. 58 (4), 375-382 (2016).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 32 (3), 595-601 (2011).
- Ding, Y. H., et al. Long-term patency of elastase-induced aneurysm model in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 27 (1), 139-141 (2006).
- Short, J. G., et al. Elastase-induced saccular aneurysms in rabbits: comparison of geometric features with those of human aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 22 (10), 1833-1837 (2001).
- Andereggen, L., et al. Three-dimensional visualization of aneurysm wall calcification by cerebral angiography: Technical case report. Journal of Clinical Neuroscience. 73, 290-293 (2020).
- Hoh, B. L., Rabinov, J. D., Pryor, J. C., Ogilvy, C. S. A modified technique for using elastase to create saccular aneurysms in animals that histologically and hemodynamically resemble aneurysms in human. Acta Neurochirurgica. 146 (7), 705-711 (2004).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
- Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Portier, K., Ida, K. K. The ASA Physical Status Classification: What is the evidence for recommending its use in veterinary anesthesia?-A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 5, 204 (2018).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Strange, F., et al. Fluorescence angiography for evaluation of aneurysm perfusion and parent artery patency in rat and rabbit aneurysm models. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59782 (2019).
- Altes, T. A., et al. 1999 ARRS Executive Council Award. Creation of saccular aneurysms in the rabbit: a model suitable for testing endovascular devices. American Journal of Roentgenology. 174 (2), 349-354 (2000).
- Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. Journal of NeuroInterventional Surgery. 8 (5), 521-525 (2016).
- Sherif, C., Marbacher, S., Erhardt, S., Fandino, J. Improved microsurgical creation of venous pouch arterial bifurcation aneurysms in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 32 (1), 165-169 (2011).
- Bavinzski, G., et al. Experimental bifurcation aneurysm: a model for in vivo evaluation of endovascular techniques. Minimally Invasive Neurosurgery. 41 (3), 129-132 (1998).
- Lewis, D. A., et al. Morbidity and mortality associated with creation of elastase-induced saccular aneurysms in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 30 (1), 91-94 (2009).
- Wang, K., et al. Neck injury is critical to elastase-induced aneurysm model. American Journal of Neuroradiology. 30 (9), 1685-1687 (2009).
- Cesar, L., et al. Neurological deficits associated with the elastase-induced aneurysm model in rabbits. Neurological Research. 31 (4), 414-419 (2009).
- Aoki, T., Nishimura, M. The development and the use of experimental animal models to study the underlying mechanisms of CA formation. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 535921 (2011).
- Frosen, J., Cebral, J., Robertson, A. M., Aoki, T. Flow-induced, inflammation-mediated arterial wall remodeling in the formation and progression of intracranial aneurysms. Neurosurgical Focus. 47 (1), 21 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Comparison of aneurysm patency and mural inflammation in an arterial rabbit sidewall and bifurcation aneurysm model under consideration of different wall conditions. Brain Sciences. 10 (4), 197 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32 (4), 772-777 (2011).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rat model - Introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of NeuroInterventional Surgery. , (2021).
- Lyu, Y., et al. An effective and simple way to establish eastase-induced middle carotid artery fusiform aneurysms in rabbits. Biomed Research International. 2020 (10), 1-12 (2020).
- Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (4), 411-415 (2018).
- Kang, W., et al. A modified technique improved histology similarity to human intracranial aneurysm in rabbit aneurysm model. Neuroradiology Journal. 23 (5), 616-621 (2010).
- Frosen, J., et al. Remodeling of saccular cerebral artery aneurysm wall is associated with rupture: histological analysis of 24 unruptured and 42 ruptured cases. Stroke. 35 (10), 2287-2293 (2004).
- Frosen, J., et al. Growth factor receptor expression and remodeling of saccular cerebral artery aneurysm walls: implications for biological therapy preventing rupture. Neurosurgery. 58 (3), 534-541 (2006).
