Summary
Her præsenterer vi raffinerede kirurgiske procedurer for vellykket udførelse af intraportal ø-transplantation, en klinisk relevant, men teknisk udfordrende kirurgisk procedure, hos mus.
Abstract
Selvom leveren i øjeblikket accepteres som det primære transplantationssted for humane øer i kliniske omgivelser, transplanteres holme under nyrekapslen i de fleste prækliniske ø-transplantationsundersøgelser af gnavere. Denne model er almindeligt anvendt, fordi murine intrahepatisk ø-transplantation er teknisk udfordrende, og en høj procentdel af mus kan dø af kirurgiske komplikationer, især blødning fra injektionsstedet efter transplantation. I denne undersøgelse demonstreres to procedurer, der kan minimere forekomsten af veneblødning efter infusionsportalen. Den første metode anvender en absorberbar hæmostatisk gelatinesvamp på injektionsstedet, og den anden metode indebærer at trænge ind i ø-injektionsnålen gennem fedtvævet først og derefter ind i portalvenen ved at bruge fedtvævet som en fysisk barriere for at stoppe blødning. Begge metoder kunne effektivt forhindre blødningsinduceret musedød. Hele leversektionen, der viser ø-fordeling og tegn på ø-trombose efter transplantation, et typisk træk ved intrahepatisk ø-transplantation, blev præsenteret. Disse forbedrede protokoller forfiner de intrahepatiske ø-transplantationsprocedurer og kan hjælpe laboratorier med at etablere proceduren for at studere ø-overlevelse og -funktion i prækliniske omgivelser.
Introduction
Intraportal ø-transplantation (IIT) via portalvenen er den mest anvendte metode til transplantation af humane øer i kliniske omgivelser. Musens IIT-model giver en fantastisk mulighed for at studere ø-transplantation og teste lovende interventionsmetoder, der kan øge effektiviteten af ø-transplantation1. IIT blev først beskrevet i 1970'erne og brugt af flere grupper1,2,3,4,5. Det genvandt popularitet efter gennembruddet i menneskelig ø-transplantation i år 20006,7. Imidlertid brugte de fleste ø-transplantationsundersøgelser nyrekapslen som et foretrukket sted for eksperimentel ø-transplantation på grund af dens lette succes. Tværtimod er IIT mere teknisk udfordrende og mindre hyppigt anvendt til holmtransplantationsundersøgelser8,9. I modsætning til IIT lider øer, der transplanteres under nyrekapslen, imidlertid ikke af den umiddelbare blodmedierede inflammatoriske reaktion, der er karakteriseret ved trombose, betændelse og levervævsiskæmi, og har således bedre funktion end øer, der transplanteres i leveren. Nyrekapselmodellen kan derfor ikke fuldt ud efterligne de belastninger, som holme støder på ved transplantation af menneskelige øer10,11,12.
En af de største komplikationer ved IIT hos mus er blødning fra injektionsstedet efter transplantation, hvilket kan forårsage 10-30 % af dødeligheden blandt forskellige musestammer12. I dette papir er der udviklet to raffinerede tilgange til at stoppe blødning hurtigere og mere sikkert og for at reducere musens dødelighed efter en IIT. Visuel demonstration af disse raffinerede detaljer vil hjælpe forskere med at identificere de vigtigste trin i denne teknisk udfordrende procedure. Desuden blev placeringen af ø-transplantaterne i modtagerens lever bestemt ved histologisk undersøgelse af hematoxylin og Eosin (H&E) farvet levervæv (hele sektionen), der bærer transplanterede øer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committees ved Medical University of South Carolina og Ralph H Johnson Medical Center i Charleston.
1. Diabetes induktion ved hjælp af streptozotocin (STZ)
- Forberedelse af modtagermus:
- Vej alle mus individuelt.
- Kontroller blodsukkerniveauet fra en haleveneblodprøve ved hjælp af et glucometer.
- Bestemmelse af STZ-dosis for tre forskellige scenarier:
- For mus med fedtleversygdom injiceres en dosis STZ [40 mg/kg/dag, intraperitoneal (i.p.) injektion] i 5 på hinanden følgende dage.
- For NOD-SCID-mus injiceres 125 mg/kg STZ, enkeltinjektion, i.p. efter faste natten over.
- For C57BL/6-mus injiceres 225 mg/kg STZ, enkeltinjektion, i.p.
- Beregninger for STZ (13,5 mg/ml):
BEMÆRK: Denne beregning er for fem C57BL/6 mus med en kropsvægt på 30 g:- Samlet kropsvægt: 5 mus x 30 g/mus = 150 g
- STZ nødvendig: 150 g x 225 mg/1000 g STZ = 33,75 mg
- STZ forberedelse:
- STZ'en vejes efter den forudberegnede dosis.
- Overfør det vejede STZ-pulver til et 10 ml bægerglas på is.
- Der tilsættes 3 ml natriumcitratopløsning til bægerglasset for at opløse STZ.
- Bland godt, filtrer steriliser gennem en 0,22 μm pore, og brug STZ-opløsningen inden for 10 minutter efter tilberedningen.
- STZ-injektion:
- Læg den ønskede mængde STZ-opløsning (nok til en mus) i 1 ml sprøjte.
- Udfør intraperitoneal injektion ved den nederste højre kvadrant af musens mave.
- Overhold mus i 5 minutter efter injektion og kontroller for tegn på ubehag i denne periode, før du sætter dem tilbage i burene.
- Overvåg blodsukkerniveauet fra en haleveneblodprøve ved hjælp af et glucometer dagligt efter STZ-injektionen.
BEMÆRK: I dette forsøg betragtes mus som diabetiker, når ikke-fastende blodsukker er > 350 mg / dL i to på hinanden følgende dage.
2. Forberedelse af øen
BEMÆRK: Humane øer blev dyrket i CMRL-1066-medier suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S) med en densitet på 10.000 ø-ækvivalent antal (IEQ) pr. 100 mm cellekulturskål9. Museøer blev dyrket i DMEM med 10 % FBS og 1 % P/S med samme densitet13. Han-NOD-SCID og C57BL/7 mus mellem 6-10 uger blev opnået fra kommercielle kilder.
- Fjern dyrkede øer fra cellekulturskålen ved blid ridser.
- Håndplukke det ønskede antal holme (f.eks. 300-350 øer) ved hjælp af en 1cc sprøjte og læg dem i sterile 1,5 ml mikrocentrifugerør på is.
- Drej røret i 10 sekunder ved hjælp af mikrocentrifugen.
- Fjern supernatanten, og efterlad noget væske for at undgå at miste pelleten.
- Resuspend pelleten i 200 μL HBSS med 0,5% bovin serum albumin (BSA).
- Aspirer de resuspenderede øer i en 0,5 ml insulinsprøjte.
- Placer sprøjten i opretstående stilling. Lad holmene synke ned i 1 min.
- Skub sprøjten for at fjerne alle boblerne, og efterlad ca. 100-150 μL væske indeholdende øer.
- Læg sprøjtehovedet nedad, og tryk forsigtigt på siden af sprøjten for at lade holmene fordele sig ligeligt i hele væsken. Holme er nu klar til injektion.
3. Ø-transplantation
- Inducer og oprethold musen under generel anæstesi med 2% isofluran. Kontroller for manglen på pedalreflekser for at sikre korrekt anæstesi af dyret.
- Barber og fjern pelsen i musens maveområde.
- Administrere en enkelt præoperativ dosis Buprenorphin (0,1 mg/kg i.p.).
- Desinficere det kirurgiske område med tre skiftevis klude af 2% jod og 75% alkohol.
- Udfør en laparotomi med mikrosaks for at generere et snit på 1-1,5 cm.
- Åbn bughulen med en retraktor. Følg med enten metode A eller metode B som beskrevet nedenfor.
4. Metode A: (stop blødning med gelskum, figur 1A)14,15,16
- Mus forberedelse
- Placer en steril gasbind omkring snittet.
- Træk forsigtigt tarmen ud ved hjælp af en tang og hold den på gasbindet.
- Identificer portalvenen ved dens placering og udsæt den godt.
- Dæk tarmen med en varm saltvand-våd gasbind under hele operationen.
- Indsæt den forudindlæste insulinsprøjtenål gennem portalvenen nær tolvfingertarmen (figur 1B). For at gøre dette skal du holde nålen med hullet (skråningen) nedad og placere åbningsoverfladens vinkel parallelt med portalvenevæggen, før du trænger gennem væggen.
- Træk stemplet for at trække noget blod (20-50 μL) ind i sprøjten for at blande øerne først.
- Tilsæt holmene langsomt i portalvenen, mens du gentagne gange trækker og skubber springet.
- Anbring et stykke gelskum (ca. 0,5 cm x 0,5 cm i størrelse) for at dække injektionsstedet.
- Tryk gelskummet ned med en bomuldsspids, mens du trækker nålen ud af portalvenen.
- Fortsæt med at trykke på gelen i ca. 2 minutter for at bekræfte, at der ikke er nogen aktiv blødning.
- Rul bomuldsspidsen over og væk fra gelskummet for at sikre, at gelskummet dækker portalvenen godt.
5. Metode B: (stop blødning med fedtpude, figur 1C)17
- Udsæt portalvenen grundigt.
- Brug to bomuldsspidser til at holde den udsatte portalåre fra både venstre og højre side.
- Identificer fedtvævspuden mellem tolvfingertarmen og portalvenen.
- Penetrer gennem fedtpuden, før nålen indsættes i portalvenen (figur 1D).
- Holmene tilføres efter den tilsvarende fremgangsmåde, der er beskrevet ovenfor i metode A, del 4.2.1 og 4.2.2.
- Træk nålen ud, mens du trykker ned på fedtet med en bomuldsspids.
- Fortsæt med at trykke på fedtpuden i 1 minut efter fjernelse af nålen.
- Efter at have bekræftet, at der ikke er blødning fra portalvenen, skal du forsigtigt returnere tarmen til bughulen i sin oprindelige position.
- Efterlad 0,5 ml varmt saltvand (36-37 °C) i bughulen inden lukning.
BEMÆRK: Varmt saltvand letter tarmbevægelse og genopretning efter operationen og forhindrer tarmnekrose. - Luk muskellaget med en 5-0 sutur.
- Luk hudlaget med en 4-0 sutur.
- Placer musen i et rent bur på en varmepude, indtil den er helt genoprettet fra anæstesi.
- Fortsæt med at give et smertestillende middel (f.eks. Buprenorphin 0,1 mg/kg i.p.) hver 12. time og supplerende varme i 48 timer efter operationen.
BEMÆRK: Ø-transplantationsproceduren tager cirka 15-20 minutter at gennemføre.
6. H & E-farvning og fotografi af hele leversektionen
- Leverperfusion
- Musen lægges i narkose som beskrevet ovenfor i del 3.1.
- Udsæt forsigtigt portalvenen og skær den ringere vena cava.
- Perfuser leveren manuelt ved hjælp af 20 ml 10% paraformaldehyd via portalvenen i ca. 5 minutter ved hjælp af en 20 ml sprøjte med 25G nål18.
BEMÆRK: Leverperfusion kan fjerne blod fra levervæv og forbedre leverfiksering uden at forstyrre ø-transplantaterne. - Dissekere den perfusionerede hele lever fra andre organer.
- Fastgør det perfusionerede levervæv i 10% paraformaldehyd i 24 timer.
- Integrer vævet i paraffin.
- Skær vævssektioner med en tykkelse på 5 μm hver og læg dem på et glasglas til farvning.
- Udfør H&E-, insulin-, fibrin- og polymorfonukleær neutrofil (PMN)-farvning ved hjælp af standardmetoder15,16.
- Scan hele leversektionen under et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udførte syngeneiske og xenogene ø-transplantationer via portalvenen. Islet graft funktion blev observeret på en dosisafhængig måde i begge ø transplantationsmodeller. I den syngeneiske ø-transplantationsmodel ved hjælp af C57BL/6-mus førte transplantation af 250 øer til forbigående normoglykæmi, før mus vendte tilbage til hyperglykæmi. Mus, der fik 500 øer, nåede og opretholdt normoglykæmi ud over 30 dage efter transplantationen (figur 2A). Mus i begge grupper viste øget kropsvægt (figur 2B).
På samme måde blev ø-graftfunktionen i de humane øer til diabetisk NOD-SCID-museøtransplantationsmodel sammenlignet, når 45, 85 eller 140 IEQ'er /kg legemsvægte blev transplanteret. Normoglykæmi kunne ikke opnås, da 45 IEQ / g (~ 225-275 holme / mus) humane øer blev transplanteret. Da ø-tallet steg til 85 IEQ/g (~ 400-450 holme/mus), opnåede 35,7 % (10/28) af modtagerne normoglykæmi (p = 0,02 vs. 45 IEQ/g-gruppe) på dag 60 efter transplantationen. Desuden nåede 83,3 % (5/6) af modtagerne, der modtog 140 IEQ/g (~ 600-650 øer/mus) af humane øer, normoglykæmi (figur 2C). Derudover døde de fleste mus, der havde blødning, efter operationen, mens mus uden blødning overlevede (figur 2D).
Når nok humane øer er indpodet til NOD-SCID-modtagere, kan deres blodsukkerniveau være velkontrolleret i det tidlige stadium efter transplantationen og godt vedligeholdt indtil afslutningen af undersøgelsen. De podede øer kan let identificeres ved H&E og insulinfarvning. 28 dage efter transplantationen blev transplanterede humane øer fordelt jævnt i hele leveren, for det meste omkring/tæt på et blodkar (figur 3).
Den intrahepatiske model blev brugt til at demonstrere øjeblikkelig blodmedieret inflammatorisk reaktion som set ved human ø-transplantation. I vores vævssektion observerede vi ekspression af insulin og tilstedeværelse af fibrin og polymorfonukleære leukocytter infiltration i transplanterede øer (figur 4A-D).
Figur 1: Illustration af intrahepatiske ø-transplantationsprocedurer. (A, C). Skemaer over de vigtigste trin, der anvendes i metode A og metode B. (B, D). Øer blev injiceret direkte via portalvenen (C) eller indirekte via fedtpat (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af intraportal ø-transplantation. (A, B). Syngeneisk mus ø intraportal transplantation. Bugspytkirteløer (250 eller 500) fra C57BL/6-mus blev transplanteret til C57BL/6-mus af hanmus, der blev gjort diabetiker af STZ. (A) Serielle blodsukkerniveauer blev målt. Normoglykæmi blev defineret som glukoseniveauer < 200 mg / dl i >2 på hinanden følgende dage. (B) Stigning i modtagernes kropsvægt blev observeret efter ø-transplantation. (C) Procentdel af diabetiske NOD-SCID-mus, der når normoglykæmi hos mus, der får et andet antal humane øer ved 45 IEQ/g (n=7), 85 IEQ/g (n=28) og 140 IEQ/g (n=6). (D) Procentdel af overlevelse efter IIT hos blødende og ikke-blødende mus (n = 14 hver). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: H&E-farvning af leversektioner af NOD-SCID-lever, der bærer humant ø-transplantat 28 dage efter transplantationen. Øer er markeret med sorte cirkler. Diameteren af hver cirkel svarer positivt til størrelsen af hver holm. Skalabjælke = 1.000 μm i hele leversektionen og 100 μm i indsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative histologiske billeder af intraportaltransplanterede museøer i leveren 6 timer efter intraportaltransplantation. (A) H&E, (B) insulin (rød) (C) Fibrin og (D) PMN-pletter. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse er der påvist to forbedrede procedurer, der kan forhindre blødning og kan reducere musens dødelighed under musens IIT. Denne undersøgelse gør det muligt for forskere at visualisere ø-transplantationsmodellen, der er unik ved at studere det øjeblikkelige blodmedierede inflammatoriske respons efter transplantation. IIT-modellen er en karakteristisk model til undersøgelse af øcelleoverlevelse og leveriskæmiske skader som reaktion på ø-transplantation19. Her forfinede vi proceduren baseret på tidligere undersøgelser og reducerede tidlig komplikationsinduceret musedødelighed. Både metode A14,15,16 og metode B8,9 blev anvendt i flere undersøgelser. Vi viste, at holme fordelt på hele leveren, og neutrofilinfiltration og trombose, der typisk er forbundet med IIT, var fremtrædende i transplantatet umiddelbart efter transplantationen.
Der er flere vigtige trin i musens leverøtransplantation. Fordi både menneske- og museøer kan være så store som 200 μm i størrelse, skal der anvendes en nålestørrelse på mindst 27G til transplantation for at sikre ø-produkternes glatte flow. Dette ville dog generere et stort hul i portalvenen, der kan forårsage blødning efter fjernelse af nåle. Ved at injicere øer via den korrekte vinkel og bruge en tandsvamp til at blokere injektionsstedet eller injektion gennem fedtvævet kan risikoen for blødning minimeres, og mus har højere overlevelsesrater efter transplantation. Disse trin kan også hjælpe med at undgå levervarme iskæmi-reperfusionsskader forårsaget af blokering af portalvenens blodgennemstrømning, når du udfører denne procedure19. De kan også reducere skaderne på leveren og tarmene, der kan bidrage til musens dødelighed efter operationen.
Der er også flere begrænsninger i musens intrahepatiske ø-transplantationsmodel sammenlignet med indstillingen for transplantation af menneskelige øer. For det første kan vi ikke overvåge museportalens venetryk under ø-infusion, som vi gør i klinikindstillinger. For det andet afspejler det volumen, der kan transplanteres i musene, muligvis ikke den store mængde ø-produkt, der transplanteres til et menneske. Derfor kan omfanget af trombose være anderledes. For det tredje vil museøtransplantater efter transplantation midlertidigt blive udsat for et hyperglykæmisk miljø, da der ikke vil blive givet insulin til mus, mens der hos mennesker20 vil blive givet insulin i peritransplantationsperioden for at reducere stresset fra transplanterede øer20. Ikke desto mindre tilbyder den intrahepatiske ø-model en unik præklinisk model, der kan bruges til at studere transplantation af menneskelige øer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Institut for Veterananliggender (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) og National Institute of Health bevillinger # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, til HW. Vi vil gerne takke dig Mr. Michael Lee og fru Lindsay Swaby for sprogredigering
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
- Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
- Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
- Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
- Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
- Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
- Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
- Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
- Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
- Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
- Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
- Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
- Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993 (2018).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).
