Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توصيف تعديل H3K4me3 في النباتات باستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/62534
Automatic Translation
*1,2, *3, *1, 1,4
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University
* These authors contributed equally

Summary

الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) هو استراتيجية تنميط الكروماتين فوق الجينومية الفعالة. يقدم هذا البروتوكول استراتيجية CUT & Tag محسنة لتحديد ملامح تعديلات الهيستون في النباتات.

Abstract

يؤدي التنظيم اللاجينومي على المستوى اللوني ، بما في ذلك تعديلات الحمض النووي والهيستون ، وسلوكيات عوامل النسخ ، والحمض النووي الريبي غير المشفر مع بروتيناتها المعينة ، إلى التحكم الزماني والمكاني في التعبير الجيني. الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT & Tag) هو طريقة ربط الإنزيم التي يتم فيها التعرف على بروتين الكروماتين المحدد أولا بواسطة جسمه المضاد المحدد ، ثم يربط الجسم المضاد بروتين اندماج بروتين A-transposase (pA-Tn5) ، والذي يشق الكروماتين المستهدف في الموقع عن طريق تنشيط أيونات المغنيسيوم. هنا ، نقدم بروتوكول CUT & Tag المنشور سابقا باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allortetraploid مع التعديل. يمكن استخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة للأبحاث اللاجينومية في النباتات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تعديلات كبيرة لعزل نوى النبات مع تعليقات نقدية.

Introduction

تخدم مواقع الحمض النووي المرتبطة بعامل النسخ والكروماتين المفتوح المرتبط بعلامات تعديل الهيستون أدوارا وظيفية حاسمة في تنظيم التعبير الجيني وهي المحاور الرئيسية للبحوث اللاجينية1. تقليديا، تم استخدام مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) إلى جانب التسلسل العميق (ChIP-seq) لتحديد على نطاق الجينوم لتعديل هيستون كروماتين معين أو أهداف الحمض النووي مع بروتينات محددة، ويتم اعتماده على نطاق واسع في مجال علم الوراثة اللاجينية2. تم تطوير تقنية الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) في الأصل من قبل مختبر Henikoff لالتقاط شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين في جميع أنحاء الجينوم5. عند مقارنتها ب ChIP، يمكن ل CUT & Tagcan إنشاء مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط3. حتى الآن ، تم إنشاء طرق لتحليل مناطق الكروماتين مع تعديلات هيستون محددة باستخدام CUT & Tag في الخلايا الحيوانية4,5. على وجه التحديد ، تم أيضا تطوير CUT & Tag أحادي الخلية (scCUT & Tag) بنجاح للأنسجة والخلايا البشرية 6. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد جدار الخلية والأيضات الثانوية ، لا يزال CUT & Tag يمثل تحديا تقنيا للأنسجة النباتية.

في السابق ، أبلغنا عن بروتوكول CUT & Tag باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allotetraploid 4. لإثبات كفاءة عزل النوى والتقاط الحمض النووي باستخدام الأنسجة النباتية ، يتم عرض إجراء التنميط هنا. وتشمل الخطوات الرئيسية عزل النوى سليمة، والحضانة في الموقع مع الجسم المضاد لتعديل الكروماتين، وحضانة الترانسبوساز، وتكامل المحول، وإعداد مكتبة الحمض النووي. يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على إعداد مكتبة CUT & Tag لعزل نوى النبات ومراقبة الجودة.

في هذه الدراسة ، نقدم استراتيجية CUT & Tag المكررة للنباتات. نحن لا نقدم فقط بروتوكولا خطوة بخطوة لتنميط H3K4me3 في أوراق القطن ، ولكننا نقدم أيضا منهجية محسنة لعزل نوى النبات ، بما في ذلك استراتيجية اختيار تركيز المنظفات لتحلل الخلايا المناسب واستراتيجية تصفية النوى. يتم تضمين خطوات مفصلة مع تعليقات انتقادية أيضا في هذا البروتوكول المحدث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حلول الترانسبوناز والمخزون (اليوم الأول)

ملاحظة: في هذا الجزء ، يتم تعقيد محولات oligonucleotide مع ترانسبوساز Tn5 لصنع transposase نشط.

  1. تمييع الاشعال (التمهيدي A ، التمهيدي B ، والتمهيدي C) إلى تركيز 100 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت التلدين (10 mM Tris pH 8.0 ، 50 mM NaCl ، 1 mM EDTA) (راجع الجدول 1 للحصول على معلومات تسلسل الاشعال والجدول 2 للحصول على وصفات لحلول العمل). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد التفاعلين التاليين في أنابيب PCR: التفاعل 1 (المحول AB) ، 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر التمهيدي A ، 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر التمهيدي B ؛ التفاعل 2 (محول AC) ، 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر التمهيدي A ، 10 من ميكرولتر 100 ميكرومتر التمهيدي C.
  3. صلب المحولات في جهاز PCR باستخدام البرنامج التالي: غطاء الحرارة (102 درجة مئوية) ، 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: المحولات عبارة عن جزيئات حمض نووي مزدوجة جزئيا (التركيز = 50 pmol / μL).
  4. قم بإعداد التفاعل التالي في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر: 10 ميكرولتر من ترانسبوساز pA-Tn5 (500 نانوغرام / ميكرولتر أو 7.5 بمول / ميكرولتر) ، 0.75 ميكرولتر من المحول AB (50 pmol / μL) ، 0.75 ميكرولتر من محول التيار المتردد (50 pmol / μL) ، 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران. ماصة 20x بلطف لتخلط جيدا وتحضن عند 30 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 1 ساعة. التركيز النهائي للترانسبوساز = 4 pmol / μL. يخزن عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: النسبة المولية للمحول AB: محول AC: transposase = 0.5: 0.5: 1.
  5. تحضير محاليل المخزون حسب الوصفات الواردة في الجدول 2 والتعقيم أو تصفية محاليل المخزون للتعقيم.
  6. الأوتوكلاف وتعقيم المقص ، ورق الترشيح ، غربال الفولاذ المقاوم للصدأ ، هاون ، مدقات ، إلخ.

2. عزل النوى (اليوم الثاني)

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية. لكل 1 غرام من المواد الأولية (أوراق القطن)، قم بإعداد 25 مل من العازل النووي العازل A (10 mM Tris pH 8.0، 50 mM NaCl، 1 mM EDTA)، 20 مل من العازل النووي العازل B (10 mM Tris pH 8.0، 50 mM NaCl، 1 mM EDTA)، 50 مل من المخزن المؤقت للغسيل النووي (10 mM Tris pH 8.0، 150 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملليمتر سبيرميدين ، كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 0.1 ٪) ، 1 مل من المخزن المؤقت للأجسام المضادة (50 ملليمتر تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 1 ملليمتر EDTA ، 150 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 0.5 مل سبيرميدين ، 1 ملغ / مل BSA ، كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 0.1 ٪ ، 0.05 ٪ ث / v digitonin). دع الأنابيب تجلس على الثلج حتى الاستخدام.
  2. طحن الأوراق الطازجة (~ 1 جم) في النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم ونقلها إلى أنبوب 50 مل يحتوي على 25 مل من العازل النووي المبرد A.
  3. اخلطي المحلول العازل بلطف واحتضني الأنبوب على الثلج لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف لتفريق المادة بالتساوي.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 RCF عند 4 درجات مئوية لتشكيل بيليه الخلية.
  5. قم بتزيين السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات مع 20 مل من العازلة النووية المبردة B المكملة بنسبة 0.5٪ Triton X-100. اقلب الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الكريات تماما.
    ملاحظة: ينطبق المخزن المؤقت للعزل النووي B سعة 20 مل على 1 غرام من المواد الأولية، ويمكن قياس هذا الحجم وفقا لذلك.
    1. قم بإجراء فحص تجريبي لاختبار تأثير تركيز سلسلة Triton X-100 (على سبيل المثال ، 2 مل عازل نووي عازل B ، يحتوي كل منهما على 0.1٪ و 0.25٪ و 0.5٪ و 1٪ Triton X-100 ل 100 ملغ من الأنسجة المطحونة). يشار إلى التركيز المناسب ل Triton X-100 من خلال تراكم النوى البيضاء / الرمادية في القاع و supernatant الأخضر الداكن بعد التحلل والطرد المركزي بسرعة منخفضة (< 500 rcf لمدة 4 دقائق).
  6. قم بتصفية الخلية الناتجة بمزيج من غربالين: غربال 500 شبكة في الأعلى لإزالة حطام الأنسجة الأكبر وغربال 1000 شبكة في الأسفل لجمع النوى.
    ملاحظة: اختر حجم شبكة مناسب للغربال اعتمادا على حجم نوى النباتات.
  7. استخدم ورق ترشيح معقم على الجانب الخلفي من الغربال لامتصاص حطام الخلايا الصغيرة في المحللات.
  8. انقل النوى المتبقية التي تحتوي على الليزات على الجانب العلوي من غربال 1000 شبكي إلى أربعة أنابيب طرد مركزي جديدة بسعة 1.5 مل.
  9. جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية لجمع النوى.
  10. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الفائقة باستخدام طرف ماصة واغسل الكريات بمخزن مؤقت للغسيل النووي.
  11. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل النووي وقلب الأنابيب بلطف لإعادة تعليق الكرية. قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية.
  12. قم بإجراء ما مجموعه 3 غسلات.
  13. (اختياري) صورة النوى تحت المجهر لتلطيخ DAPI.
    1. نقل 100 ميكرولتر من تعليق النوى في المخزن المؤقت للغسيل النووي من الخطوة 2.11. إلى أنبوب جديد 1.5 مل. أضف 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل النووي و 2 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (1 مجم / مل) لجعل تركيز العمل النهائي 2 ميكروغرام / مل ل DAPI. احتضن الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. بعد التلطيخ ، قم بجهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية لجمع النوى.
    3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوبرناتانت باستخدام طرف ماصة. يغسل 3 مرات مع 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل النووي.
    4. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الفائقة وأعد تعليق النوى باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل النووي.
    5. قم بتصوير النوى تحت المجهر الفلوري باستخدام قناة DAPI.
  14. اجمع النوى من أنبوبين (~ 50 ميكرولتر من النوى في الحجم في كل أنبوب 1.5 مل). جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت المتبقي باستخدام طرف ماصة.

3. حضانة الأجسام المضادة

  1. أعد تعليق كل 50 ميكرولتر من النوى في أنبوب 1.5 مل مع 1 مل من المخزن المؤقت للأجسام المضادة.
  2. قم بإعداد التفاعلات التالية في أنابيب 1.5 مل: نسختان بيولوجيتان متماثلتان من مجموعات التحكم IgG مع 150 ميكرولتر من النوى (~ 1 ميكروغرام من الكروماتين) و 2 ميكرولتر من IgG (1 ملغ / مل) في كل أنبوب ، ونسختان بيولوجيتان من مجموعات فحص H3K4me3 مع 150 ميكرولتر من النوى و 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة H3K4me3 (1 ملغ / مل) في كل أنبوب.
  3. امزج المحلول بلطف واترك الأنابيب على شاكر أفقي للتهجين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية و 12 دورة في الدقيقة.
  4. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية. قم بإعداد 50 مل من المخزن المؤقت للغسيل المناعي (IP) (10 mM Tris pH 8.0 ، 150 mM NaCl ، 0.5 mM spermidine ، كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 0.1٪ ، 0.05٪ w / v digitonin) في أنبوب طرد مركزي 50 مل. دع الأنبوب يجلس على الجليد.
  5. الطرد المركزي للأنابيب لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت للأجسام المضادة من كل أنبوب.
  6. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل IP إلى كل أنبوب واخلطه بلطف. اترك الأنابيب على شاكر أفقي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 12 دورة في الدقيقة.
  7. بعد الغسيل ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت باستخدام طرف ماصة.
    ملاحظة: لتجنب أي اضطراب في حبيبات النوى ، اترك ~ 50-80 ميكرولتر من المخزن المؤقت مع النوى.
  8. كرر الخطوات 3.6.-3.7. مرتين أخريين.
  9. بعد الغسيل الثالث ، جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي قدر الإمكان.

4. حضانة ترانسبوساز

  1. اصنع 1 مل من المخزن المؤقت لحضانة الترانسبوناز الطازج (10 ملليمتر تريس الأس الهيدروجيني 8.0 ، 300 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملليمتر سبيرميدين ، كوكتيل مثبط للبروتياز 0.1٪ ، 0.05٪ ث / v digitonin) عن طريق خلط 1 مل من المخزن المؤقت لغسيل IP مع 30 ميكرولتر من 5 مليون كلوريد الصوديوم.
  2. لتحضير مزيج ترانسبوساز Tn5 للحضانة ، أضف 1 ميكرولتر من الترانسبوساز إلى كل 150 ميكرولتر من مخزن حضانة الترانسبوساز.
    ملاحظة: تحضير مزيج محلول الترانسبوناز أولا وفقا لعدد التفاعلات ، ثم إضافة أليكوت من 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب.
  3. أعد تعليق النوى ب 150 ميكرولتر من محلول الترانسبوساز.
  4. اترك الأنابيب على شاكر أفقي عند 12 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة واخلطها كل 10-15 دقيقة.
  5. بعد حضانة الترانسبوساز ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت لحضانة transposase في كل أنبوب.
  6. اغسل الأنابيب باستخدام مخزن IP العازل. للقيام بذلك ، أضف 800 ميكرولتر من مخزن IP المخزن المؤقت للغسيل إلى كل أنبوب ، واخلطه بلطف ، واترك الأنابيب على شاكر أفقي عند 12 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. جهاز طرد مركزي لمدة 4 دقائق عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة السوبرناتانت باستخدام طرف ماصة.
  8. كرر الخطوات 4.6.-4.7. مرتين أخريين.
  9. بعد الغسيل الثالث ، جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 300 RCF عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي قدر الإمكان.

5. الوسم

  1. اصنع حديثا 2 مل من المخزن المؤقت للوسم (10 ملليمتر تريس الأس الهيدروجيني 8.0 ، 300 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 0.5 ملليمتر سبيرميدين ، كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 0.1 ٪ ، 10 ملليمتر MgCl2 ، 0.05 ٪ ث / v digitonin) عن طريق خلط 2 مل من المخزن المؤقت لغسل IP مع 60 ميكرولتر من 5 M NaCl و 20 ميكرولتر من 1 M MgCl2.
  2. أعد تعليق النوى باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للوسم.
  3. امزج المحلول واحتضنه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للوسم.
  4. أوقف الوسم ب 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (التركيز النهائي ~ 15 mM) و 30 ميكرولتر من 10٪ SDS (التركيز النهائي 1٪).

6. استخراج الحمض النووي وبناء مكتبة NGS

  1. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي CTAB كما هو موضح 7. احتضن الأنابيب في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عكس لخلط كل ~ 10 دقائق.
  2. أضف 600 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24:1) إلى كل أنبوب. اخلطي جيدا.
  3. قبل الطرد المركزي ، يتم قفل أنابيب هلام الطور لمدة 2 دقيقة عند 13000 RCF عند 4 درجات مئوية. انقل المحلول أعلاه إلى أنابيب هلام قفل المرحلة.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 إطار من الحمى القلاعية عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل السوبرناتانت (~ 600 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
  6. أضف 600 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب. اخلطي جيدا.
  7. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 إطار من الحمى القلاعية عند 4 درجات مئوية.
  8. انقل supernatant (~ 600 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  9. أضف 12 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ و 2 ميكرولتر من GlycoBlue Coprecipitant. تخلط جيدا وتخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 إطار من الحمى القلاعية عند 4 درجات مئوية.
  11. ديكان السوبرناتانت. اغسل حبيبات الحمض النووي باستخدام 75٪ (v / v) من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 13000 RCF عند 4 درجات مئوية.
  12. ديكان السوبرناتانت. جفف حبيبات الحمض النووي في الهواء وأعد تعليق الحمض النووي في 25 ميكرولتر من ddH2O.
  13. قم بإعداد تفاعل PCR على النحو التالي. للحصول على ما مجموعه 50 ميكرولتر من التفاعل ، أضف 24 ميكرولتر من الحمض النووي ، و 11 ميكرولتر من ddH2O ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x TAE ، و 2 ميكرولتر من P5 التمهيدي (10 ميكرومتر) ، و 2 ميكرولتر من التمهيدي P7 (10 ميكرومتر) ، و 1 ميكرولتر من إنزيم TruePrep Amplify. برنامج PCR: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ ثم 14 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: لا يمكن تخطي أول 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق للتمديد. سيؤدي الإفراط في تضخيم المكتبة إلى مستوى عال من تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل في NGS. ابدأ من 12-14 دورة PCR في تفاعل PCR ل H3K4me3 عند استخدام ~ 1 ميكروغرام من الكروماتين في كل تفاعل.
  14. تحميل 2 ميكرولتر من منتجات PCR على 1.5٪ هلام الأغاروز للرحلان الكهربائي.
  15. تنقية منتجات PCR باستخدام الخرز المغناطيسي التجاري لتنقية الحمض النووي.
  16. حدد حجم المكتبة باستخدام مقياس الفلورومتر والرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
    ملاحظة: يجب أن يكون التركيز الفعال للمكتبة >2 نانومتر بواسطة qPCR لضمان الجودة الجيدة.
  17. إجراء تسلسل الجيل التالي (NGS) وتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 سير عمل CUT & Tag. يوضح الشكل 2 تلطيخ DAPI للنوى السليمة. كان الهدف من خطوة "عزل النوى" هو الحصول على النوى السليمة بكمية كافية لتفاعل CUT & Tag اللاحق. يوضح الشكل 3 الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لمنتجات PCR. مطلوب عنصر التحكم السلبي IgG بالتوازي عند إعداد التجربة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم IgG ، تراوح الجزء الأكبر من شظايا الحمض النووي التي تم سحبها باستخدام عينة الأجسام المضادة H3K4me3 من ~ 280 إلى 500 زوج قاعدة. يوضح الشكل 4 تسلسل الجيل التالي الناتج للجسم المضاد H3K4me3 مقارنة بمجموعات التحكم السلبية IgG.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل CUT & Tag. وقد عدل هذا الرقم من Tao et al.4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تلطيخ DAPI للنوى السليمة المعزولة من أوراق القطن. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الرحلان الكهربائي لهلام Agarose من 2 ميكرولتر من منتجات PCR . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: لقطة شاشة IGV تمثيلية لإشارات H3K4me3 . (أ) نظرة عامة على IGV التمثيلية لإشارات CUT & Tag عبر منطقة جينوم كبيرة. ~ 1500 كيلو بايت تم اختيار مناطق الجينوم عشوائيا. (ب) أظهرت لقطة شاشة IGV التمثيلية للجينات ذات مستويات التعبير المتنوعة دقة عالية لإشارات CUT & Tag. تم استخدام ملفات bigWig العادية التي تم إنشاؤها من bamCompare عن طريق مقارنة ملف bam للعلاج (تفاعل CUT & Tag anti-H3K4me3) وملف bam للتحكم (IgG). TPM ، نصوص لكل قاعدة كيلوقاعدة من نموذج exon لكل مليون قراءة تم تعيينها. وقد عدل هذا الرقم من Tao et al.4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تسلسلات التمهيدي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: وصفات المخزن المؤقت والمحلول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، وصفنا CUT & Tag ، وهي تقنية لتوليد مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط مقارنة بالترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). نجاحنا مع التنميط H3K4me3 في أوراق القطن يشير إلى أن CUT & Tag ، الذي تم تصميمه لأول مرة للخلايا الحيوانية ، يمكن استخدامه أيضا للخلايا النباتية. يستخدم كل من نظام المخزن المؤقت Tris بشكل شائع لفحص ChIP8 ونظام المخزن المؤقت HEPES المستخدم في عمل CUT & Tag الحيواني ل CUT & Tag باستخدام نوى النبات4,9. عزل نوى النبات السليمة هو الخطوة الحاسمة للتطبيق الناجح ل CUT & Tag في النباتات. في المنهجية التي تم الإبلاغ عنها سابقا لعزل النوى4 ، تم ترشيح محلول الأنسجة المطحونة من خلال طبقتين من Miracloth قبل تحلل الخلايا. وجدنا أن كفاءة الحصول على نوى كافية انخفضت عند استخدام الأوراق القديمة نسبيا (على سبيل المثال ، الأوراق من نباتات القطن التي يبلغ عمرها شهرين) وألياف القطن (على سبيل المثال ، ألياف 20-DPA) لأن Miracloth يحتفظ بمعظم الأنسجة المطحونة. في بروتوكول الفيديو هذا ، تم تحسين عزل نوى النبات عن طريق تصفية محللات الخلية من خلال غربال من الفولاذ المقاوم للصدأ 500 شبكة (حجم مسام 20 ميكرومتر). هذه العملية المعدلة حسنت بشكل كبير من كفاءة إزالة حطام الأنسجة الأكبر والحصول على نوى كافية للتفاعل اللاحق.

بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل لبناء المكتبة (الخطوة 6.13) ، يمكن تنقية شظايا الحمض النووي ثم توصيفها بواسطة NGS. ومع ذلك ، إذا كانت المجموعة الضابطة IgG تصور أيضا تخصيبا في شظايا صغيرة ، فإنها تشير إلى خلفية قوية لقطع الحمض النووي العشوائي بواسطة transposase ، والذي قد يكون ناجما عن النوى التالفة أو الغسيل غير الكافي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة أو transposase. في هذه الحالة ، لم يوصى بالعينات المتوازية لأجسام مضادة محددة لمزيد من NGS.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير وتطبيق CUT & Tag أحادي الخلية القائم على القطيرات من خلال تكييف منصة ATAC-seq أحادية الخلية أحادية الخلية القائمة على القطيرات في تحديد ملامح تعديلات هيستون H3K4me3 و H3K27me3 و H3K27ac و H3K36me3. في دراسة حول شغل الكروماتين لعامل النسخ OLIG2 ، قدم المكون المعقد المتماسكة RAD21 في دماغ الفأر رؤى فريدة في المناظر الطبيعية اللاجينومية في الجهاز العصبي المركزي 6. وبالتالي ، يمكن تطبيق CUT & Tag لفحص المناظر الطبيعية اللاجينومية لكل من تعديل الهستون السائب و TFs المحددة ذات متطلبات المدخلات المنخفضة9 ، حتى على مستوى الخلية الواحدة6. تشير هذه التطبيقات ل CUT & Tag إلى أن دراسة التنظيم اللاجيني للنبات في تنسيق الشبكات الوظيفية الجينية أثناء ديناميكيات التنمية والاستجابات البيئية يمكن أن تكون دقيقة في النمط الزمني والمكاني.

CUT & Tag هي طريقة لا تزال قيد العمليات التنموية مع المشاكل التي تحتاج إلى معالجة. بالنسبة لعوامل النسخ التي لا يتم التعبير عنها بكثرة أو المرتبطة بشكل ضعيف أو عابر أو غير مباشر بالكروماتين10 ، يجب مقارنة الاختلافات بين النوى المتشابكة والأصلية في CUT & Tag. لا تزال استراتيجية CUT & Tag للتنميط مع عوامل النسخ بوفرة منخفضة صعبة من الناحية الفنية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لمحدودية توافر البروتين epitope ، فإن معظم الأجسام المضادة ChIP التي تم التحقق من صحتها للعمل مع ظروف الربط المتبادل قد لا تعمل بشكل جيد مع الظروف الأصلية في CUT & Tag ؛ يجب التحقق من حساسية وخصوصية الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، فإن ترانسبوساز Tn5 المستخدم في CUT & Tag لديه تقارب كبير مع مناطق الكروماتين المفتوحة 11 ، وبالتالي قد يؤدي CUT & Tag إلى التحيز ، والذي يحتاج أيضا إلى معالجته في الدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح مع أي شركة تتداول أحد المنتجات المذكورة أعلاه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل ماليا جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، 31900395 ، 31971985 ، 31901430) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية ، ومختبر هاينان ياتشو باي للبذور (JBGS ، B21HJ0403) ، ومؤسسة هاينان الإقليمية للعلوم الطبيعية في الصين (320LH002) ، ومشروع JCIC-MCP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Anti-H3K4me3 Millipore 07-473
Normal rabbit IgG Millipore 12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA) Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C
digitonin (~50% (TLC) Sigma-Aldrich D141 Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C
dimethyl sulfoxide (DMSO)
chloroform
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH
ethanol
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) Invitrogen AM9516
magnesium chloride (MgCl2) Make 1 M MgCl2 stock solution
protease inhibitor cocktail Calbiochem 539133-1SET
potassium chloride (KCl) Make 1 M KCl stock solution
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)
sodium chloride (NaCl) Make 5 M NaCl stock solution
spermidine Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C.
sodium dodecyl sulfate (SDS) Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter
Tris base Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution
Triton X-100 Make 20% Triton X-100 stock solution
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag Vazyme S602/S603 Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.
TruePrep Amplify Enzyme Vazyme TD601
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R
PCR machine Applied Biosystems ABI9700
Orbital shaker MIULAB HS-25
NanoDrop One  spectrophotometer Thermo Scientific ND-ONE-W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

Tags

علم الأحياء ، العدد 182 ،
توصيف تعديل H3K4me3 في النباتات باستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tao, X., Gao, M., Wang, S., Guan, X. … More

Tao, X., Gao, M., Wang, S., Guan, X. Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation. J. Vis. Exp. (182), e62534, doi:10.3791/62534 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter