O decote sob metas e tagmentação (CUT&Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.
Regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. O decote sob alvos e tagmentação (CUT&Tag) é um método de enzimática em que a proteína específica da cromatina é primeiro reconhecida por seu anticorpo específico, e então o anticorpo amarra uma proteína de fusão A-transposase (pA-Tn5), que corta a cromatina alvo in situ pela ativação de íons de magnésio. Aqui, fornecemos nosso protocolo CUT&Tag publicado anteriormente usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allortetraploid com modificação. Este protocolo passo a passo pode ser usado para pesquisa epigenômica em plantas. Além disso, modificações substanciais para o isolamento dos núcleos vegetais são fornecidas com comentários críticos.
Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente desenvolvido pelo Laboratório Henikoff para capturar os fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma5. Quando comparado ao ChIP, a CUT&Tagcan gera bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado3. Até o momento, foram estabelecidos métodos para análise de regiões de cromatina com modificações específicas de histona utilizando CUT&Tag em células animais4,5. Especificamente, cut&tag de célula única (scCUT&Tag) também foi desenvolvido com sucesso para tecidos humanos e células6. No entanto, devido à complexidade da parede celular e metabólitos secundários, a CUT&Tag ainda é tecnicamente desafiadora para tecidos vegetais.
Anteriormente, relatamos um protocolo CUT&Tag usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allotetraploid4. Para demonstrar a eficiência do isolamento dos núcleos e da captura de DNA utilizando tecido vegetal, o procedimento de criação de perfil é apresentado aqui. Os principais passos incluem isolamento de núcleos intactos, incubação in situ com o anticorpo para modificação de cromatina, incubação transposase, integração adaptadora e preparação da biblioteca de DNA. A solução de problemas se concentra na preparação da biblioteca CUT&Tag para o isolamento dos núcleos da planta e controle de qualidade.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia refinada da CUT&Tag para plantas. Não só fornecemos um protocolo passo-a-passo para o perfil H3K4me3 em folhas de algodão, mas também fornecemos uma metodologia otimizada para o isolamento dos núcleos vegetais, incluindo a estratégia de seleção da concentração de detergente para a lise celular adequada e a estratégia de filtragem dos núcleos. Passos detalhados com comentários críticos também estão incluídos neste protocolo atualizado.
Aqui, descrevemos a CUT&Tag, uma tecnologia para gerar bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com a imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Nosso sucesso com o perfil H3K4me3 em folhas de algodão sugere que a CUT&Tag, que foi projetada pela primeira vez para células animais, também pode ser usada para células vegetais. Tanto o sistema tampão Tris comumente usado para o ensaio ChIP8…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado financeiramente em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), e fundos de pesquisa fundamental para as Universidades Centrais, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e projeto JCIC-MCP.
Antibody | |||
Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
Chemicals | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
chloroform | |||
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
ethanol | |||
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
Enzyme | |||
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |