Summary
Hedefler ve etiketleme altında bölünme (CUT&Tag) etkili bir kromatin epigenomik profilleme stratejisidir. Bu protokol, tesislerdeki histon modifikasyonlarının profillenmesi için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunar.
Abstract
DNA ve histon modifikasyonları, transkripsiyon faktörlerinin davranışları ve işe alınan proteinleriyle kodlamayan RNA'lar dahil olmak üzere kromatik düzeyde epigenomik düzenleme, gen ekspresyonunun zamansal ve mekansal kontrolüne yol açar. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT & Tag), spesifik kromatin proteininin ilk önce spesifik antikoru tarafından tanındığı ve daha sonra antikorun, magnezyum iyonlarının aktivasyonu ile hedeflenen kromatini in situ olarak parçalayan bir protein A-transpozaz (pA-Tn5) füzyon proteinini bağladığı bir enzim-tethering yöntemidir. Burada, daha önce yayınlanmış CUT & Tag protokolümüzü, allortetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş bozulmamış çekirdekleri modifikasyonla kullanarak sunuyoruz. Bu adım adım protokol, bitkilerde epigenomik araştırmalar için kullanılabilir. Ek olarak, bitki çekirdeği izolasyonu için önemli değişiklikler kritik yorumlarla sağlanmaktadır.
Introduction
Transkripsiyon faktörü bağlayıcı DNA bölgeleri ve histon modifikasyon işaretleriyle ilişkili açık kromatin, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik fonksiyonel rollere hizmet eder ve epigenetik araştırmaların ana odak noktalarıdır1. Geleneksel olarak, kromatin immünopresipitasyon testi (ChIP), derin dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, spesifik kromatin histon modifikasyonunun veya spesifik proteinlerle DNA hedeflerinin genom çapında tanımlanması için kullanılmıştır ve epigenetik alanında yaygın olarak benimsenmiştir2. Hedefler altında bölünme ve etiketleme (CUT&Tag) teknolojisi ilk olarak Henikoff Laboratuvarı tarafından genom boyunca proteine bağlı DNA fragmanlarını yakalamak için geliştirilmiştir5. ChIP ile karşılaştırıldığında, CUT&Tagcan basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturur3. Bugüne kadar, hayvan hücrelerinde CUT&Tag kullanılarak spesifik histon modifikasyonları olan kromatin bölgelerinin analizi için yöntemler oluşturulmuştur4,5. Özellikle, tek hücreli CUT&Tag (scCUT&Tag) insan dokuları ve hücreleri için de başarıyla geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, hücre duvarının ve ikincil metabolitlerin karmaşıklığı nedeniyle, CUT & Tag bitki dokuları için teknik olarak hala zordur.
Daha önce, allotetraploid pamuk yapraklarından izole edilmiş sağlam çekirdekler kullanan bir CUT&Tag protokolü bildirmiştik4. Çekirdek izolasyonunun ve bitki dokusunu kullanarak DNA yakalamanın etkinliğini göstermek için, profilleme prosedürü burada sunulmuştur. Başlıca adımlar arasında bozulmamış çekirdek izolasyonu, kromatin modifikasyonu için antikor ile in situ inkübasyon, transpozaz inkübasyonu, adaptör entegrasyonu ve DNA kütüphanesi hazırlığı bulunmaktadır. Sorun giderme, tesis çekirdeği izolasyonu ve kalite kontrolü için CUT&Tag kütüphanesinin hazırlanmasına odaklanır.
Bu çalışmada, bitkiler için rafine bir CUT&Tag stratejisi sunuyoruz. Sadece pamuk yapraklarında H3K4me3 profillemesi için adım adım bir protokol sağlamakla kalmıyoruz, aynı zamanda uygun hücre lizisi için deterjan konsantrasyonunu seçme stratejisi ve çekirdekleri filtreleme stratejisi de dahil olmak üzere bitki çekirdeği izolasyonu için optimize edilmiş bir metodoloji sunuyoruz. Kritik yorumlar içeren ayrıntılı adımlar da bu güncellenmiş protokole dahil edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transpozaz ve stok çözeltileri hazırlayın (1. Gün)
NOT: Bu bölümde, oligonükleotid adaptörleri aktif transpozaz yapmak için Tn5 transpozaz ile kompleksleştirilmiştir.
- Astarları (astar A, astar B ve astar C) tavlama tamponunu (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak 100 μM konsantrasyona kadar seyreltin (astarların sıra bilgileri için Tablo 1'e ve çalışma çözeltileri için tarifler için Tablo 2'ye bakın). Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- PCR tüplerinde aşağıdaki iki reaksiyonu ayarlayın: Reaksiyon 1 (adaptör AB), 100 μM primer A'nın 10 μL'si, 100 μM primer B'nin 10 μL'si; Reaksiyon 2 (adaptör AC), 10 μL 100 μM astar A, 10 μL 100 μM primer C.
- PCR makinesindeki adaptörleri aşağıdaki programı kullanarak tavlayın: ısı kapağı (102 °C), 15 dakika için 75 °C, 10 dakika için 60 °C, 10 dakika için 50 °C, 10 dakika için 40 °C, 30 dakika için 25 °C.
NOT: Adaptörler kısmen çift sarmallı DNA molekülleridir (konsantrasyon = 50 pmol / μL). - 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın: 10 μL pA-Tn5 transpozaz (500 ng/μL veya 7,5 pmol/μL), 0,75 μL adaptör AB (50 pmol/μL), 0,75 μL adaptör AC (50 pmol/μL), 7 μL bağlantı tamponu. Pipetleri 20x hafifçe karıştırın ve 30 °C'de bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin. Transpozazın son konsantrasyonu = 4 pmol / μL. Kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
NOT: AB: adaptör AC: transpozaz = 0.5:0.5:1 adaptörünün molar oranı. - Stok çözeltilerini Tablo 2'de verilen tariflere göre hazırlayın ve sterilize etmek için stok çözeltilerini otoklav veya filtreleyin.
- Makas, filtre kağıdı, paslanmaz çelik elek, harç, havaneli vb. otoklav ve sterilize edin.
2. Çekirdek izolasyonu (2. Gün)
- Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. Başlangıç malzemesinin her 1 gramı (pamuk yaprakları) için 25 mL nükleer izolasyon tamponu A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL nükleer izolasyon tamponu B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL nükleer yıkama tamponu (10 mM Tris pH 8.0) hazırlayın, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1), 1 mL antikor tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, %0.05 w / v digitonin). Tüpleri kullanana kadar buz üzerinde bekletin.
- Taze yaprakları (~1 g) sıvı azotta ince bir toza öğütün ve 25 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu A içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tampon çözeltisini nazikçe karıştırın ve malzemeyi eşit şekilde dağıtmak için tüpü 5 dakika boyunca hafifçe sallayarak buz üzerinde inkübe edin.
- Hücre peletini oluşturmak için 4 °C'de 500 rcf'de 5 dakika santrifüj yapın.
- Süpernatantı boşaltın ve% 0.5 Triton X-100 ile desteklenmiş 20 mL soğutulmuş nükleer izolasyon tamponu B ile peleti yeniden askıya alın. Peletin tamamen askıya alınması için tüpü yavaşça ters çevirin.
NOT: 20 mL nükleer izolasyon tamponu B, 1 g başlangıç malzemesi için geçerlidir ve bu hacim buna göre ölçeklendirilebilir.- Triton X-100'ün seri konsantrasyonunun etkisini test etmek için bir pilot test yapın (örneğin, 100 mg öğütülmüş doku için her biri %0,1, %0,25, %0,5 ve %1 Triton X-100 içeren 2 mL nükleer izolasyon tamponu B). Uygun Triton X-100 konsantrasyonu, altta beyaz/gri çekirdeklerin birikmesi ve düşük hızda lizis ve santrifüjleme sonrası koyu yeşil bir süpernatant ile gösterilir (4 dakika boyunca 500 rcf <).
- Elde edilen hücre lizatını iki eleğin bir kombinasyonu ile filtreleyin: daha büyük doku kalıntılarını çıkarmak için üstte 500 ağlık bir elek ve çekirdekleri toplamak için altta 1000 mesh elek bulunur.
NOT: Bitkilerin çekirdek boyutuna bağlı olarak elekler için uygun bir ağ boyutu seçin. - Lisattaki küçük hücre kalıntılarını emmek için eleğin arka tarafında steril filtre kağıdı kullanın.
- 1000 mesh eleğin üst tarafında lizat içeren kalan çekirdekleri dört taze 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Çekirdekleri toplamak için 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj yapın.
- Bir pipet ucu kullanarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve peleti nükleer yıkama tamponu ile yıkayın.
- 800 μL nükleer yıkama tamponu ekleyin ve peleti yeniden askıya almak için tüpleri yavaşça ters çevirin. Tüpü 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca tekrar döndürün.
- Toplam 3 yıkama yapın.
- (İsteğe bağlı) DAPI boyama için çekirdekleri mikroskop altında görüntüleyin.
- Adım 2.11'den itibaren nükleer yıkama tamponunda 100 μL çekirdek süspansiyonunu aktarın. yeni bir 1,5 mL tüpe dönüştürün. DAPI için 2 μg/mL'lik son çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 900 μL nükleer yıkama tamponu ve 2 μL DAPI stok çözeltisi (1 mg/mL) ekleyin. Tüpü karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Boyama işleminden sonra, çekirdekleri toplamak için 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Pipet ucu kullanarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. 800 μL nükleer yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın.
- Süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve çekirdekleri 100 μL nükleer yıkama tamponu ile yeniden askıya alın.
- DAPI kanalını kullanarak çekirdekleri floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
- Çekirdekleri iki tüpten birleştirin (her 1,5 mL tüpte hacim olarak ~50 μL çekirdek). 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj. Pipet ucu kullanarak kalan tamponun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
3. Antikor inkübasyonu
- Her 50 μL çekirdeği, 1 mL antikor tamponu ile 1.5 mL'lik bir tüpte yeniden askıya alın.
- 1.5 mL tüplerde aşağıdaki reaksiyonları ayarlayın: Her tüpte 150 μL çekirdek (~ 1 μg kromatin) ve 2 μL IgG (1 mg / mL) içeren IgG kontrol gruplarının iki biyolojik replikatı, her tüpte 150 μL çekirdek ve 2 μL anti-H3K4me3 antikoru (1 mg / mL) ile H3K4me3 tahlil gruplarının iki biyolojik replikatı.
- Çözeltiyi nazikçe karıştırın ve tüpleri 4 ° C ve 12 rpm'de gece boyunca hibridizasyon için yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.
- Santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde taze 50 mL immünopresipitasyon (IP) yıkama tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli% 0.1, ,% 0.05 w / v digitonin) hazırlayın. Tüpün buzun üzerine oturmasına izin verin.
- Tüpleri 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın. Antikor tamponunu her tüpten çıkarın.
- Her tüpe 800 μL IP yıkama tamponu ekleyin ve nazikçe karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında ve 12 rpm'de 5 dakika boyunca yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.
- Yıkadıktan sonra, tüpleri 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj edin. Bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın.
NOT: Çekirdek peletinin herhangi bir şekilde bozulmasını önlemek için, tamponun ~ 50-80 μL'sini çekirdeklerle birlikte bırakın. - 3.6.-3.7 arasındaki adımları yineleyin. iki kez daha.
- Üçüncü yıkamadan sonra, 4 ° C'de 300 rcf'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan arabelleği mümkün olduğunca çıkarın.
4. Transpozaz inkübasyonu
- 1 mL IP yıkama tamponunu 30 μL 5 M NaCl ile karıştırarak taze 1 mL transpozaz inkübasyon tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, % 0.05 w / v diggitonin) yapın.
- Tn5 transpozaz karışımını inkübasyona hazırlamak için, transpozaz inkübasyon tamponunun her 150 μL'sine 1 μL transpozaz ekleyin.
NOT: Transpozaz çözeltisi karışımını önce reaksiyon sayısına göre hazırlayın ve ardından her tüpe 150 μL'lik bir aliquot ekleyin. - Çekirdekleri 150 μL transpozaz çözeltisi ile yeniden askıya alın.
- Tüpleri oda sıcaklığında 2-3 saat boyunca 12 rpm'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın ve her 10-15 dakikada bir karıştırın.
- Transpozaz inkübasyonundan sonra, tüpleri 4 ° C'de 300 rcf'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın. Her tüpteki transpozaz inkübasyon tamponunu çıkarın.
- Tüpleri IP yıkama tamponu ile yıkayın. Bunu yapmak için, her tüpe 800 μL IP yıkama tamponu ekleyin, yavaşça karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12 rpm'de yatay bir çalkalayıcı üzerinde bırakın.
- 4 °C'de 300 rcf'de 4 dakika santrifüj. Bir pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın.
- 4.6.-4.7 arasındaki adımları yineleyin. iki kez daha.
- Üçüncü yıkamadan sonra, 4 ° C'de 300 rcf'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan arabelleği mümkün olduğunca çıkarın.
5. Etiketleme
- 2 mL IP yıkama tamponunu 60 μL 5 M NaCl ve 20 μL 1 M MgCl2 ile karıştırarak 2 mL etiketleme tamponunu (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM spermidin, proteaz inhibitörü kokteyli %0.1, 10 mM MgCl2, %0.05 w / v diggitonin) taze olarak yapın.
- Çekirdekleri 300 μL etiketleme tamponu ile yeniden askıya alın.
- Çözeltiyi karıştırın ve etiketleme için 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca inkübe edin.
- Etiketlemeyi 10 μL 0,5 M EDTA (nihai konsantrasyon ~15 mM) ve 30 μL %10 SDS (nihai konsantrasyon %1) ile durdurun.
6. DNA ekstraksiyonu ve NGS kütüphanesi yapımı
- Açıklandığı gibi 300 μL CTAB DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin7. Tüpleri 65 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Her ~ 10 dakikada bir karıştırmak için ters çevirin.
- Her tüpe 600 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. İyice karıştırın.
- Faz kilit jel borularını 4 °C'de 13.000 rcf'de 2 dakika boyunca önceden santrifüj edin. Yukarıdaki çözeltiyi faz kilit jel tüplerine aktarın.
- 4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.
- Süpernatantı (~ 600 μL) yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- Her tüpe 600 μL kloroform ekleyin. İyice karıştırın.
- 4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.
- Süpernatantı (~ 600 μL) yeni bir 1.5 ml'lik tüpe aktarın.
- 12 μL% 100 etanol ve 2 μL GlikoMavi Kopresipitant ekleyin. İyice karıştırın ve 1 saat boyunca -20 ° C'de saklayın.
- 4 °C'de 13.000 rcf'de 10 dakika santrifüj.
- Süper natantı dekant. DNA peletini %75 (v/v) etanol ve santrifüj kullanarak 4 °C'de 13.000 rcf'de 5 dakika boyunca yıkayın.
- Süper natantı dekant. DNA peletini hava ile kurutun ve DNA'yı 25 μL ddH2O içinde yeniden askıya alın.
- PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın. Toplam 50 μL reaksiyon için, 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE tamponu, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) ve 1 μL TruePrep Amplify Enzimi ekleyin. PCR programı: 3 dakika için 72 °C, 30 s için 98 °C; daha sonra 30 s için 98 ° C, 30 s için 60 ° C ve 30 s için 72 ° C'lik 14 döngü, ardından 5 dakika boyunca 72 ° C.
NOT: Uzatma için 3 dakika boyunca ilk 72 °C atlanamaz . Kütüphanenin aşırı amplifikasyonu, NGS'de yüksek düzeyde PCR kopyalarına yol açacaktır. Her reaksiyonda ~1 μg kromatin kullanıldığında H3K4me3 için PCR reaksiyonunda 12-14 PCR döngüsünden başlayın. - PCR ürünlerinin 2 μL'sini elektroforez için% 1.5 agaroz jeli üzerine yükleyin.
- PCR ürünlerini ticari DNA saflaştırma manyetik boncukları kullanarak saflaştırın.
- Kütüphaneyi bir florometre ve agaroz jel elektroforezi ile sayısallaştırın.
NOT: Kütüphanenin etkin konsantrasyonu, iyi kalite sağlamak için qPCR ile >2 nM olmalıdır. - Yeni nesil sıralama (NGS) ve veri analizi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de CUT&Tag iş akışı gösterilmektedir. Şekil 2 , bozulmamış çekirdeklerin DAPI boyamasını göstermektedir. "Çekirdek izolasyonu" adımının amacı, bozulmamış çekirdekleri sonraki CUT & Tag reaksiyonu için yeterli miktarda elde etmekti. Şekil 3'te PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi görülmektedir. IgG negatif kontrolü, denemeyi kurarken paralel olarak gereklidir. IgG kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, H3K4me3 antikor örneği ile çekilen DNA fragmanlarının büyük kısmı ~ 280 ila 500 baz çifti arasında değişmiştir. Şekil 4 , IgG negatif kontrol gruplarına kıyasla anti-H3K4me3 antikoru için ortaya çıkan yeni nesil dizilemeyi göstermektedir.
Şekil 1: CUT&Tag'in iş akışı. Bu rakam Tao ve ark.4'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Pamuk yapraklarından izole edilen sağlam çekirdeklerin DAPI boyaması. Ölçek çubuğu = 20 μM. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: 2 μL PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: H3K4me3 sinyalleri için temsili IGV ekran görüntüsü . (A) Büyük bir genom bölgesindeki CUT&Tag sinyallerine temsili IGV genel bakışı. ~1500 kb genom bölgesi rastgele seçildi. (B) Çeşitli ekspresyon seviyelerine sahip genler için temsili IGV ekran görüntüsü, CUT & Tag sinyallerinin yüksek çözünürlüğünü gösterdi. Tedavi bam dosyası (CUT&Tag anti-H3K4me3 reaksiyonu) ve control bam dosyası (IgG) karşılaştırılarak bamCompare tarafından oluşturulan normalleştirilmiş bigWig dosyaları kullanılmıştır. TPM, eşlenen milyon okuma başına ekzon modelinin kilotabanı başına transkriptler. Bu rakam Tao ve ark.4'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Astar dizileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Tampon ve solüsyon tarifleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kromatin immünopresipitasyonuna (ChIP) kıyasla basitleştirilmiş bir prosedürle az sayıda hücre kullanarak yüksek çözünürlükte ve son derece düşük arka planda DNA kütüphaneleri oluşturmak için bir teknoloji olan CUT & Tag'i tanımladık. Pamuk yapraklarında H3K4me3 profilleme ile elde ettiğimiz başarı, ilk olarak hayvan hücreleri için tasarlanan CUT&Tag'ın bitki hücreleri için de kullanılabileceğini göstermektedir. Hem ChIP testi8 için yaygın olarak kullanılan Tris tampon sistemi hem de hayvan CUT&Tag için kullanılan HEPES tampon sistemi, bitki çekirdeklerini kullanarak CUT&Tag için çalışır4,9. Bozulmamış bitki çekirdeklerinin izolasyonu, CUT&Tag'in bitkilerde başarılı bir şekilde uygulanması için kritik bir adımdır. Çekirdek izolasyonu için daha önce bildirilen metodolojide4, öğütülmüş dokuların çözeltisi, hücre lizisinden önce iki Miracloth tabakasından süzüldü. Miracloth öğütülmüş dokuların çoğunu koruduğu için nispeten yaşlı yapraklar (örneğin, 2 aylık pamuk bitkilerinden elde edilen yapraklar) ve pamuk lifleri (örneğin, 20-DPA lifi) kullanıldığında yeterli çekirdek elde etme verimliliğinin azaldığını gördük. Bu video protokolünde, bitki çekirdeği izolasyonu, hücre lizatını 500 mesh (20 μM gözenek boyutunda) paslanmaz çelik elek ile filtreleyerek optimize edildi. Bu değiştirilmiş operasyon, daha büyük doku kalıntılarını çıkarma ve sonraki reaksiyon için yeterli çekirdek elde etme verimliliğini önemli ölçüde artırdı.
Kütüphane yapımı için PCR'den sonra (Adım 6.13.), DNA fragmanları saflaştırılabilir ve daha sonra NGS tarafından profillendirilebilir. Bununla birlikte, eğer IgG kontrol grubu küçük parçalarda bir zenginleştirme gösteriyorsa, transpozaz tarafından rastgele DNA kesiminin güçlü bir arka planını gösterir; bu, hasarlı çekirdeklerden veya bağlanmamış antikor veya transpozazın çıkarılması için yetersiz yıkamadan kaynaklanabilir. Bu durumda, spesifik antikorlar için paralel örnekler daha fazla NGS için önerilmemiştir.
Son zamanlarda, damlacık tabanlı 10x Genomics tek hücreli ATAC-seq platformunu uyarlayarak tek hücreli CUT & Tag, H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac ve H3K36me3 histon modifikasyonlarının profillenmesinde geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Transkripsiyon faktörü OLIG2'nin kromatin doluluğu üzerine yapılan bir çalışmada, fare beynindeki kohezin kompleks bileşeni RAD21, merkezi sinir sistemindeki epigenomik manzaralara benzersiz bilgiler sağlamıştır6. Böylece, CUT&Tag, epigenomik manzaraları hem toplu histon modifikasyonu hem de tek hücre seviyesinde bile düşük giriş gereksinimlerine9 sahip spesifik TF'ler için incelemek üzere uygulanabilir6. CUT&Tag'in bu uygulamaları, gelişim dinamikleri ve çevresel tepkiler sırasında gen fonksiyonel ağlarının koordine edilmesinde bitki epigenetik regülasyonunun incelenmesinin zamansal ve mekansal modelde kesin olabileceğini göstermektedir.
CUT&Tag, ele alınması gereken sorunları olan ve hala gelişim süreçleri altında olan bir yöntemdir. Bol miktarda ifade edilmeyen veya kromatin10'a zayıf, geçici veya dolaylı olarak bağlı olan transkripsiyon faktörleri için, CUT & Tag'deki çapraz bağlı ve doğal çekirdekler arasındaki farkların karşılaştırılması gerekir. Düşük bollukta transkripsiyon faktörleri ile profil oluşturma için CUT & Tag stratejisi teknik olarak hala zordur. Ek olarak, protein epitopunun sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, çapraz bağlanma koşullarıyla çalışmak üzere doğrulanan çoğu ChIP antikoru, CUT & Tag'deki doğal koşullarla iyi çalışmayabilir; antikorların duyarlılığı ve özgüllüğünün doğrulanması gerekir. Ayrıca, CUT & Tag'de kullanılan Tn5 transpozazı, açık kromatin bölgelerine11 yüksek afiniteye sahiptir, bu nedenle CUT & Tag, gelecekteki çalışmalarda da ele alınması gereken önyargıyı ortaya çıkarabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların, yukarıda belirtilen ürünlerden birini takas eden herhangi bir şirketle çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları, Hainan Yazhou Körfezi Tohum Laboratuvarı (JBGS, B21HJ0403), Çin Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı (320LH002) ve JCIC-MCP projesinden gelen hibelerle finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
