Profilering av H3K4me3 Modifiering i växter som använder klyvning under mål och tagning
Summary
Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Detta protokoll presenterar en förfinad CUT&Tag-strategi för profilering av histonmodifieringar i växter.
Abstract
Epigenomisk reglering på kromatisk nivå, inklusive DNA och histon modifieringar, beteenden av transkriptionsfaktorer och icke-kodande RNAs med sina rekryterade proteiner, leder till temporal och rumslig kontroll av genuttryck. Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en enzym-tethering metod där det specifika kromatinproteinet först känns igen av sin specifika antikropp, och sedan antikroppen binder ett protein A-transponas (pA-Tn5) fusionsprotein, som klyver det riktade kromatinet in situ genom aktivering av magnesiumjoner. Här tillhandahåller vi vårt tidigare publicerade CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allortetraploid bomullsblad med modifiering. Detta steg-för-steg-protokoll kan användas för epigenomisk forskning i växter. Dessutom är betydande ändringar för isolering av växtkärnor kritiska kommentarer.
Introduction
Transkriptionsfaktorbindande DNA-platser och öppet kromatin i samband med histonmodifieringsmärken fyller kritiska funktionella roller för att reglera genuttryck och är de viktigaste fokusen för epigenetisk forskning1. Konventionellt har kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) i kombination med djup sekvensering (ChIP-seq) använts för genomomfattande identifiering av specifika kromatin histon modifiering eller DNA-mål med specifika proteiner, och är allmänt antagen inom området epigenetik2. Klyvning under mål och tagningsteknik (CUT&Tag) utvecklades ursprungligen av Henikoff Lab för att fånga de proteinanslutna DNA-fragmenten i hela genomet5. Jämfört med ChIP genererar CUT&Tagcan DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande3. Hittills har metoder för analys av kromatinregioner med specifika histonmodifieringar med CUT&Tag fastställts i djurceller4,5. Specifikt har encelliga CUT&Tag (scCUT&Tag) också framgångsrikt utvecklats för mänskliga vävnader och celler6. Men på grund av cellväggens och sekundära metaboliters komplexitet är CUT&Tag fortfarande tekniskt utmanande för växtvävnader.
Tidigare rapporterade vi ett CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allotetraploid bomullsblad4. För att demonstrera effektiviteten av atomisolering och DNA-fångst med hjälp av växtvävnad presenteras profileringsförfarandet här. De viktigaste stegen inkluderar intakt atomkärnor isolering, in situ inkubation med antikroppen för kromatin modifiering, transposase inkubation, adapter integration, och DNA bibliotek förberedelse. Felsökningen fokuserar på CUT&Tag-bibliotekets förberedelse för isolering av växtkärnor och kvalitetskontroll.
I denna studie presenterar vi en förfinad CUT&Tag-strategi för växter. Vi tillhandahåller inte bara ett steg-för-steg-protokoll för H3K4me3-profilering i bomullsblad, utan vi tillhandahåller också en optimerad metodik för isolering av växtkärnor, inklusive strategin för att välja koncentrationen av tvättmedel för korrekt celllys och strategin att filtrera kärnorna. Detaljerade steg med kritiska kommentarer ingår också i det här uppdaterade protokollet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit CUT&Tag, en teknik för att generera DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande jämfört med kromatinimprecipitering (ChIP). Vår framgång med H3K4me3-profilering i bomullsblad tyder på att CUT&Tag, som först designades för djurceller, också kan användas för växtceller. Både Tris buffertsystem som vanligen används för ChIP-analys8 och HEPES-buffertsystemet som används för animal CUT&Tag-arbete f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis ekonomiskt av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) och fundamentala forskningsfonder för de centrala universiteten, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) och JCIC-MCP-projektet.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
