Summary
Cleavage under mål og tagmentering (CUT&Tag) er en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Denne protokollen presenterer en raffinert CUT&Tag-strategi for profilering av histone modifikasjoner i planter.
Abstract
Epigenomisk regulering på kromatisk nivå, inkludert DNA- og histone-modifikasjoner, atferd av transkripsjonsfaktorer og ikke-kodende RNAer med sine rekrutterte proteiner, fører til tidsmessig og romlig kontroll av genuttrykk. Cleavage under mål og tagmentering (CUT&Tag) er en enzym-tethering metode der det spesifikke kromatinproteinet først gjenkjennes av sitt spesifikke antistoff, og deretter antistoffet tethers et protein A-transposase (pA-Tn5) fusjonsprotein, som klemmer det målrettede kromatin in situ ved aktivering av magnesiumioner. Her tilbyr vi vår tidligere publiserte CUT&Tag-protokoll ved hjelp av intakte kjerner isolert fra allortetraploid bomullsblader med modifikasjon. Denne trinnvise protokollen kan brukes til epigenomisk forskning i planter. I tillegg er betydelige modifikasjoner for plantekjerneisolasjon gitt kritiske kommentarer.
Introduction
Transkripsjonsfaktorbindende DNA-nettsteder og åpen kromatin assosiert med histone modifikasjonsmerker tjener kritiske funksjonelle roller i regulering av genuttrykk og er hovedfokus for epigenetisk forskning1. Konvensjonelt har kromatinimmunoprecipitation assay (ChIP) kombinert med dyp sekvensering (ChIP-seq) blitt brukt til genom-bred identifisering av spesifikk kromatin histone modifikasjon eller DNA-mål med spesifikke proteiner, og er allment vedtatt innen epigenetikk2. Cleavage under mål og tagmentation (CUT&Tag) teknologi ble opprinnelig utviklet av Henikoff Lab for å fange protein-tilknyttede DNA fragmenter gjennom genomet5. Sammenlignet med ChIP, genererer CUT&Tagcan DNA-biblioteker med høy oppløsning og eksepsjonelt lav bakgrunn ved hjelp av et lite antall celler med en forenklet prosedyre3. Til dags dato er det etablert metoder for analyse av kromatinregioner med spesifikke histone modifikasjoner ved hjelp av CUT&Tag i dyreceller4,5. Spesielt har single-cell CUT&Tag (scCUT&Tag) også blitt vellykket utviklet for humant vev og celler6. Men på grunn av kompleksiteten i celleveggen og sekundære metabolitter, er CUT&Tag fortsatt teknisk utfordrende for plantevev.
Tidligere rapporterte vi en CUT&Tag-protokoll ved hjelp av intakte kjerner isolert fra allotetraploid bomullsblader4. For å demonstrere effektiviteten av kjerneisolasjon og DNA-fangst ved hjelp av plantevev, presenteres profileringsprosedyren her. De viktigste trinnene inkluderer intakt kjerneisolasjon, in situ-inkubasjon med antistoffet for kromatinmodifisering, transposaseinkubasjon, adapterintegrasjon og DNA-bibliotekforberedelse. Feilsøkingen fokuserer på CUT&Tag-bibliotekets forberedelse til plantekjerneisolasjon og kvalitetskontroll.
I denne studien presenterer vi en raffinert CUT&Tag-strategi for planter. Ikke bare tilbyr vi en trinnvis protokoll for H3K4me3-profilering i bomullsblader, men vi tilbyr også en optimalisert metodikk for plantekjerneisolasjon, inkludert strategien for å velge konsentrasjonen av vaskemiddel for riktig cellelys og strategien for å filtrere kjernene. Detaljerte trinn med kritiske kommentarer er også inkludert i denne oppdaterte protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered transposase- og lagerløsninger (dag 1)
MERK: I denne delen er oligonukleotidadapterne komplekse med Tn5 transposase for å lage aktiv transposase.
- Fortynn primere (primer A, primer B og primer C) til 100 μM konsentrasjon ved hjelp av glødebufferen (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (se tabell 1 for sekvensinformasjon om primere og tabell 2 for oppskrifter for arbeidsløsninger). Oppbevars ved -20 °C til bruk.
- Sett opp følgende to reaksjoner i PCR-rør: Reaksjon 1 (adapter AB), 10 μL 100 μM primer A, 10 μL 100 μM primer B; Reaksjon 2 (adapter AC), 10 μL 100 μM primer A, 10 av μL 100 μM primer C.
- Anneal adapterne i PCR-maskinen ved hjelp av følgende program: varmelokk (102 °C), 75 °C i 15 minutter, 60 °C i 10 minutter, 50 °C i 10 minutter, 40 °C i 10 minutter, 25 °C i 30 minutter.
MERK: Adapterne er delvis dobbeltstrengede DNA-molekyler (konsentrasjon = 50 pmol/μL). - Sett opp følgende reaksjon i et 1,5 ml sentrifugerør: 10 μL pA-Tn5 transposase (500 ng/μL eller 7,5 pmol/μL), 0,75 μL adapter AB (50 pmol/μL), 0,75 μL adapter AC (50 pmol/μL), 7 μL koblingsbuffer. Pipette 20x forsiktig for å blande godt og inkubere ved 30 °C i et vannbad i 1 time. Den endelige konsentrasjonen av transposase = 4 pmol/μL. Oppbevares ved -20 °C til bruk.
MERK: Molarforholdet mellom adapter AB: adapter AC: transposase = 0,5:0,5:1. - Klargjør lagerløsningene i henhold til oppskriftene i tabell 2 og autoklaver eller filtrer lagerløsningene for å sterilisere.
- Autoklaver og steriliser saks, filterpapir, en sikt i rustfritt stål, en mørtel, pestles, etc.
2. Nuklei isolasjon (Dag 2)
- Forkjøl sentrifugen til 4 °C. For hver 1 g av startmaterialet (bomullsblader), lag 25 ml kjernefysisk isolasjonsbuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml kjernefysisk isolasjonsbuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml kjernefysisk vaskebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehemmercocktail 0,1%), 1 ml antistoffbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, 1 mg / ml BSA, proteasehemmercocktail 0,1%, 0,05% m / v digitonin). La rørene sitte på is til bruk.
- Grind friske blader (~ 1 g) i flytende nitrogen til et fint pulver og overfør til et 50 ml rør som inneholder 25 ml kjølt kjernefysisk isolasjonsbuffer A.
- Bland bufferløsningen forsiktig og inkuber røret på is i 5 minutter med skånsom risting for å spre materialet jevnt.
- Sentrifuge i 5 min ved 500 rcf ved 4 °C for å danne cellepelleten.
- Dekanter den supernatante og resuspend pellet med 20 ml kjølt kjernefysisk isolasjonsbuffer B supplert med 0,5% Triton X-100. Snu røret forsiktig for å resuspendere pellet helt.
MERK: Den 20 ml kjernefysiske isolasjonsbufferen B gjelder for 1 g startmateriale, og dette volumet kan skaleres tilsvarende.- Utfør en pilotanalyse for å teste effekten av seriekonsentrasjonen av Triton X-100 (f.eks. 2 ml kjernefysisk isolasjonsbuffer B, hver med 0,1%, 0,25%, 0,5% og 1% Triton X-100 for 100 mg slipt vev). Den aktuelle konsentrasjonen av Triton X-100 er indikert ved en opphopning av hvite / grå kjerner i bunnen og en mørkegrønn supernatant etter lysis og sentrifugering ved lav hastighet (< 500 rcf i 4 min).
- Filtrer den resulterende cellen lysat med en kombinasjon av to sikter: en 500-mesh sikt på toppen for å fjerne større vevsrester og en 1000-mesh sikt på bunnen for å samle kjernene.
MERK: Velg en passende maskestørrelse for siktene avhengig av plantenes kjernestørrelse. - Bruk sterilt filterpapir på baksiden av silen for å absorbere små cellerester i lysatet.
- Overfør de resterende kjernene som inneholder lysat på oversiden av 1000-mesh sikten til fire friske 1,5 ml sentrifugerør.
- Sentrifuge i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C for å samle kjernene.
- Fjern så mye av supernatanten som mulig ved hjelp av en pipettespiss og vask pelletsen med atomvaskbuffer.
- Tilsett 800 μL av atomvaskbufferen og snu rørene forsiktig for å gjenopplive pelletsen. Snurr røret igjen i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C.
- Utfør totalt 3 vasker.
- (Valgfritt) Bilde kjernene under et mikroskop for DAPI-farging.
- Overfør 100 μL kjernefjæring i atomvaskbufferen fra trinn 2.11. til et nytt 1,5 ml rør. Tilsett 900 μL kjernevaskbuffer og 2 μL DAPI-lagerløsning (1 mg/ml) for å lage en endelig arbeidskonsentrasjon på 2 μg/ml for DAPI. Inkuber røret i mørket i 30 min ved romtemperatur.
- Etter farging, sentrifuge i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C for å samle kjernene.
- Fjern så mye av supernatanten som mulig ved hjelp av en pipettespiss. Vask 3 ganger med 800 μL av atomvaskbufferen.
- Fjern så mye av supernatanten som mulig og resuspend kjernene med 100 μL kjernevaskbuffer.
- Bilde kjernene under et fluorescensmikroskop ved hjelp av DAPI-kanalen.
- Kombiner kjernene fra to rør (~50 μL kjerne i volum i hvert 1,5 ml rør). Sentrifuge i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern så mye av den gjenværende bufferen som mulig ved hjelp av en pipettespiss.
3. Antistoff inkubasjon
- Resuspend hver 50 μL kjerner i et 1,5 ml rør med 1 ml antistoffbuffer.
- Sett opp følgende reaksjoner i 1,5 ml rør: to biologiske replikeringer av IgG-kontrollgrupper med 150 μL kjerner (~ 1 μg kromatin) og 2 μL IgG (1 mg/ml) i hvert rør, to biologiske replikeringer av H3K4me3-analysegrupper med 150 μL kjerner og 2 μL anti-H3K4me3 antistoff (1 mg/ml) i hvert rør.
- Bland oppløsningen forsiktig og la rørene stå på en horisontal shaker for hybridisering over natten ved 4 °C og 12 o/min.
- Forkjøl sentrifugen til 4 °C. Forbered fersk 50 ml immunrecipitation (IP) vaskebuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehemmercocktail 0,1%, ,0,05% m/ v digitonin) i et 50 ml sentrifugerør. La røret sitte på is.
- Sentrifuger rørene i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern antistoffbufferen fra hvert rør.
- Tilsett 800 μL IP-vaskebuffer til hvert rør og bland forsiktig. La rørene stå på en horisontal shaker i 5 minutter ved romtemperatur og 12 o/min.
- Etter vask, sentrifuger rørene i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjelp av en pipettespiss.
MERK: For å unngå forstyrrelser i nukleipellet, la ~50-80 μL av bufferen med kjernene. - Gjenta trinn 3.6.-3.7. to ganger til.
- Etter den tredje vasken, sentrifuge i 2 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern den gjenværende bufferen så mye som mulig.
4. Transposase inkubasjon
- Lag fersk 1 ml transposase inkubasjonsbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehemmercocktail 0,1%, 0,05% m/ v digitonin) ved å blande 1 ml IP-vaskebuffer med 30 μL 5 M NaCl.
- For å forberede Tn5 transposaseblandingen for inkubasjon, tilsett 1 μL transposase til hver 150 μL transposase inkubasjonsbuffer.
MERK: Forbered transposaseoppløsningen først i henhold til antall reaksjoner, og tilsett deretter en aliquot på 150 μL til hvert rør. - Resuspend kjernene med 150 μL transposaseoppløsning.
- La rørene stå på en horisontal shaker ved 12 o/min i 2-3 timer ved romtemperatur og bland hver 10-15 min.
- Etter transposase inkubasjon, sentrifuger rørene i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern transposase inkubasjonsbufferen i hvert rør.
- Vask rørene med IP-vaskebuffer. For å gjøre dette, tilsett 800 μL IP-vaskebuffer til hvert rør, bland forsiktig og la rørene stå på en horisontal shaker ved 12 rpm i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge i 4 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern supernatanten ved hjelp av en pipettespiss.
- Gjenta trinn 4.6.-4.7. to ganger til.
- Etter den tredje vasken, sentrifuge i 2 min ved 300 rcf ved 4 °C. Fjern den gjenværende bufferen så mye som mulig.
5. Tagmentering
- Lag 2 ml tagmenteringsbuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteasehemmercocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% m/v digitonin) ved å blande 2 ml IP-vaskebuffer med 60 μL 5 M NaCl og 20 μL 1 M MgCl2.
- Bruk kjernene på nytt med 300 μL tagmenteringsbuffer.
- Bland oppløsningen og inkuber i et 37 °C vannbad i 1 time for tagmentering.
- Stopp tagmenteringen med 10 μL 0,5 M EDTA (sluttkonsentrasjon ~15 mM) og 30 μL 10% SDS (sluttkonsentrasjon 1%).
6. DNA-ekstraksjon og NGS-bibliotekkonstruksjon
- Tilsett 300 μL CTAB DNA-ekstraksjonsbuffer som beskrevet7. Inkuber rørene i et 65 °C vannbad i 30 min. Inverter for å blande hvert ~ 10 min.
- Tilsett 600 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1) til hvert rør. Bland grundig.
- Pre-sentrifuger faselås gelrørene i 2 min ved 13.000 rcf ved 4 °C. Overfør ovennevnte løsning til faselåsgelrør.
- Sentrifuge i 10 min ved 13.000 rcf ved 4 °C.
- Overfør supernatanten (~600 μL) til et nytt 1,5 ml rør.
- Tilsett 600 μL kloroform i hvert rør. Bland grundig.
- Sentrifuge i 10 min ved 13.000 rcf ved 4 °C.
- Overfør supernatanten (~600 μL) til et nytt rør på 1,5 ml.
- Tilsett 12 μL 100% etanol og 2 μL GlycoBlue Coprecipitant. Bland grundig og oppbevar ved -20 °C i 1 time.
- Sentrifuge i 10 min ved 13.000 rcf ved 4 °C.
- Dekanter supernatanten. Vask DNA-pelletsen med 75% (v/v) etanol og sentrifuge i 5 min ved 13 000 rcf ved 4 °C.
- Dekanter supernatanten. Lufttørk DNA-pelletsen og resuspend DNA i 25 μL ddH2O.
- Sett opp PCR-reaksjonen på følgende måte. For totalt 50 μL reaksjon, tilsett 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE buffer, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) og 1 μL TruePrep Amplify Enzyme. PCR-program: 72 °C i 3 minutter, 98 °C i 30 s; deretter 14 sykluser på 98 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 72 °C i 30 s, etterfulgt av 72 °C i 5 minutter.
MERK: De første 72 °C i 3 minutter for forlengelse kan ikke hoppes over. Overamplifisering av biblioteket vil føre til et høyt nivå av PCR-duplikater i NGS. Start fra 12-14 PCR sykluser i PCR reaksjon for H3K4me3 når du bruker ~ 1 μg kromatin i hver reaksjon. - Last 2 μL av PCR-produktene på 1,5% agarose gel for elektroforese.
- Rens PCR-produktene ved hjelp av kommersielle DNA-rensende magnetiske perler.
- Kvantifisere biblioteket med et fluorometer og agarose gelelektroforese.
MERK: Effektiv konsentrasjon av biblioteket bør være >2 nM ved qPCR for å sikre god kvalitet. - Utfør neste generasjons sekvensering (NGS) og dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser arbeidsflyten KLIPP.&kode. Figur 2 viser DAPI-fargingen av de intakte kjernene. Målet med trinnet "nuclei isolation" var å oppnå den intakte kjernen på tilstrekkelig mengde for den påfølgende CUT&Tag-reaksjonen. Figur 3 viser agarose gelelektroforese av PCR-produkter. Den negative IgG-kontrollen kreves parallelt når du konfigurerer eksperimentet. Sammenlignet med IgG-kontrollgruppen varierte hoveddelen av DNA-fragmentene som ble trukket med H3K4me3 antistoffprøve fra ~ 280 til 500 basepar. Figur 4 viser neste generasjons sekvensering for anti-H3K4me3-antistoffet sammenlignet med IgG-negative kontrollgrupper.
Figur 1: Arbeidsflyten til CUT&Tag. Denne figuren er fra Tao et al.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: DAPI-farging av intakte kjerner isolert fra bomullsblader. Skalastang = 20 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Agarose gelelektroforese av 2 μL PCR-produkter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: RepresentativT IGV-skjermbilde for H3K4me3-signaler. (A) Representativ IGV-oversikt over CUT&Tag-signaler over en stor genomregion. ~1500 kb genom regioner ble tilfeldig valgt. (B) Representativt IGV-skjermbilde for gener med varierte uttrykksnivåer viste høy oppløsning av CUT&Tag-signaler. De normaliserte bigWig-filene generert fra bamCompare ved å sammenligne behandling bam-filen (CUT&Tag anti-H3K4me3 reaksjon) og kontroll bam-filen (IgG) ble brukt. TPM, transkripsjoner per kilobase av exon modell per million kartlagte leser. Denne figuren er modifisert fra Tao et al.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Primersekvenser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Buffer- og løsningsoppskrifter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet CUT&Tag, en teknologi for å generere DNA-biblioteker med høy oppløsning og eksepsjonelt lav bakgrunn ved hjelp av et lite antall celler med en forenklet prosedyre sammenlignet med kromatinimmunoprecipitation (ChIP). Vår suksess med H3K4me3 profilering i bomullsblader antyder at CUT&Tag, som først ble designet for dyreceller, også kan brukes til planteceller. Både Tris-buffersystemet som vanligvis brukes til ChIP-analyse8 og HEPES-buffersystemet som brukes til dyrs CUT&Tag-arbeid for CUT&Tag ved hjelp av plantekjerner4,9. Isolering av intakte plantekjerner er det kritiske skrittet for vellykket bruk av CUT&Tag i planter. I den tidligere rapporterte metodikken for nukleiisolasjon4 ble løsningen av slipt vev filtrert gjennom to lag Miracloth før cellelys. Vi fant effektiviteten ved å oppnå tilstrekkelige kjerner redusert ved bruk av relativt aldrende blader (f.eks. blader fra 2 måneder gamle bomullsplanter) og bomullsfibre (f.eks. 20-DPA fiber) fordi Miracloth beholder det meste av det malte vevet. I denne videoprotokollen ble plantekjerneisolasjonen optimalisert ved å filtrere cellelyset gjennom en 500-mesh (20 μM pore størrelse) rustfritt stålsikte. Denne endrede operasjonen forbedret effektiviteten ved å fjerne større vevsrester og oppnå tilstrekkelige kjerner for den påfølgende reaksjonen.
Etter PCR for bibliotekkonstruksjon (trinn 6.13.), kan DNA-fragmentene renses og deretter profileres av NGS. Men hvis IgG-kontrollgruppen også skildrer en berikelse i små fragmenter, indikerer det en sterk bakgrunn av tilfeldig DNA-kutting ved transposase, som kan være forårsaket av skadede kjerner eller utilstrekkelig vasking for fjerning av ubundet antistoff eller transposase. I dette tilfellet ble de parallelle prøvene for spesifikke antistoffer ikke anbefalt for ytterligere NGS.
Nylig har single-cell CUT&Tag ved å tilpasse den dråpebaserte 10x Genomics encellede ATAC-seq-plattformen blitt utviklet og brukt i profilering av H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac og H3K36me3 histone modifikasjoner. I en studie om kromatinbelegget til transkripsjonsfaktor OLIG2 ga cohesin-komplekse komponenten RAD21 i musehjernen unik innsikt i epigenomiske landskap i sentralnervesystemet6. Dermed kan CUT&Tag brukes til å undersøke de epigenomiske landskapene for både bulk histone modifikasjon og de spesifikke TFene med lave inngangskrav9, selv på encellet nivå6. Disse anvendelsene av CUT&Tag indikerer at studiet av planteepogentisk regulering i koordinering av genfunksjonelle nettverk under dynamikken i utvikling og miljøresponser kan være presis i det tidsmessige og romlige mønsteret.
CUT&Tag er en metode som fortsatt er under utviklingsprosesser med problemer som må løses. For transkripsjonsfaktorene som ikke er rikelig uttrykt eller er svakt, forbigående eller indirekte bundet til kromatin10, må forskjellene mellom krysskoblede og innfødte kjerner i CUT&Tag sammenlignes. CUT&Tag-strategien for profilering med transkripsjonsfaktorer ved lav overflod er fortsatt teknisk utfordrende. I tillegg, på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av protein epitop, kan de fleste ChIP-antistoffer som er validert for å fungere med krysskoblingsforhold ikke fungere bra med innfødte forhold i CUT&Tag; følsomheten og spesifisiteten til antistoffer må valideres. Videre har Tn5-transposasen som brukes i CUT&Tag høy affinitet til åpne kromatinregioner11, og dermed kan CUT&Tag introdusere skjevheter, som også må tas opp i fremtidige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikter med noe selskap som handler et av produktene nevnt ovenfor.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støttet delvis av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) og Fundamental Research Funds for Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) og JCIC-MCP-prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al.
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
