Summary
Vi beskriver en protokol til mærkning makrofag-afledte små ekstracellulære vesikler med PKH farvestoffer og observere deres optagelse in vitro og i rygmarven efter intrathecal levering.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (SEVs) er 50-150 nm vesikler udskilles af alle celler og til stede i kropsvæsker. sEVs overføre biomolekyler såsom RNA, proteiner og lipider fra donor til acceptor celler, hvilket gør dem centrale signalering mæglere mellem celler. I centralnervesystemet (CNS), sEVs kan mægle intercellulære signalering, herunder neuroimmune interaktioner. sEV-funktioner kan studeres ved at spore optagelsen af mærkede SEVs i modtagerceller både in vitro og in vivo. Dette papir beskriver mærkning af sEVs fra de betingede medier af RAW 264.7 makrofag celler ved hjælp af en PKH membran farvestof. Det viser udbredelsen af forskellige koncentrationer af mærket sEVs på flere tidspunkter af Neuro-2a celler og primære astrocytter in vitro. Også vist er optagelse af SEVs leveret intrathecally i musen rygmarvs neuroner, astrocytter, og mikroglia visualiseret af konfokal mikroskopi. De repræsentative resultater viser tidsafhængig variation i optagelsen af sEVs af forskellige celler, som kan hjælpe med at bekræfte vellykket SEVs levering i rygmarven.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (SEVs) er nanosized, membran-afledte vesikler med en størrelse på 50-150 nm. De stammer fra multi-vesikulære organer (MVB) og frigives fra celler ved fusion af MVB'erne med plasmamembranen. sEVs indeholder miRNA'er, mRNAs, proteiner og bioaktive lipider, og disse molekyler overføres mellem celler i form af celle-til-celle kommunikation. sEVs kan internaliseres af modtagerceller ved hjælp af en række endoytiske veje, og denne fangst af sEVs af modtagerceller medieres ved genkendelse af overflademolekyler på både elbiler og målcellerne1.
SEVs har fået interesse på grund af deres evne til at udløse molekylære og fænotypiske ændringer i acceptorceller, deres nytte som terapeutisk middel, og deres potentiale som bærere for last molekyler eller farmakologiske agenser. På grund af deres lille størrelse kan billeddannelse og sporing af SEVs være udfordrende, især for in vivo-undersøgelser og kliniske indstillinger. Derfor er der udviklet mange metoder til at mærke og image sEVs til at hjælpe deres biodistribution og sporing in vitro og in vivo2.
Den mest almindelige teknik til at studere sEV biodistribution og målcelleinteraktioner indebærer mærkning af dem med fluorescerende farvemolekyler3,4,5,6,7. Elbiler blev oprindeligt mærket med cellemembranfarvestoffer, der almindeligvis blev brugt til billedceller. Disse fluorescerende farvestoffer generelt plette lipid bilayer eller proteiner af interesse på SEVs. Flere lipofile farvestoffer viser et stærkt fluorescerende signal, når de indgår i cytosolen, herunder DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3',3′-tetramethylindotricarbocyanine jod), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorat), og DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-chlorobenzenesulfonat salt)8,9,10,11.
Andre lipofile farvestoffer, såsom PKH67 og PKH26, har en meget fluorescerende polar hovedgruppe og en lang alifatisk kulbrintehale, der let interkalker i enhver lipidstruktur og fører til langsigtet farvefastholdelse og stabil fluorescens12. PKH farvestoffer kan også mærke elbiler, som gør det muligt at studere EV egenskaber in vivo13. Mange andre farvestoffer er blevet brugt til at observere exosomer ved hjælp af fluorescensmikroskopi og flowcytometri, herunder lipidmærkningsfarvestoffer14 og cellepermeable farvestoffer som carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)15,16 og calcein acetoxymethyl (AM) ester17.
Undersøgelser af sEV-medieret krydstale mellem forskellige celler i CNS har givet vigtig indsigt i patogenesen af neuroinflammatoriske og neurodegenerative sygdomme18. For eksempel kan SEVs fra neuroner sprede beta-amyloid peptider og fosforylerede tau proteiner og støtte i patogenese af Alzheimers sygdom19. Derudover indeholder elbiler afledt af erythrocytter store mængder alfa-synuclein og kan krydse blod - hjerne barrieren og bidrage til Parkinsons patologi20. SEVs evne til at krydse fysiologiske barrierer21 og overføre deres biomolekyler til at målrette celler gør dem praktiske værktøjer til at levere terapeutiske lægemidler til CNS22.
Visualisering af SEV optagelse af utallige CNS celler i rygmarven vil muliggøre både mekanistiske undersøgelser og evaluering af de terapeutiske fordele ved eksogent administrerede sEVs fra forskellige cellulære kilder. Dette papir beskriver metoden til at mærke sEVs stammer fra makrofager og billede deres optagelse in vitro og in vivo i lændemarven af neuroner, mikroglia, og astrocytter til kvalitativt bekræfte sEV levering ved visualisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NIH Guide for care and use of Laboratory Animals og godkendt af Institutional Animal Care &Use Committee of Drexel University College of Medicine. Tidsindige CD-1 mus blev brugt til astrocytisk kultur, og alle dæmninger blev modtaget 15 dage efter imprægnering. Ti-tolv uger gamle C57BL/6 mus blev brugt til in vivo optagelsesforsøg.
1. Isolering af SEVs fra RAW 264.7 makrofagceller
- Kultur RAW 264,7 celler i 75 cm2 kolber i DMEM exosome-udtømt medium, der indeholder 10% exosome-udtømt fosterkvæg serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (pen-strep) for 24-48 h.
- 300 mL konditioneret medium og centrifuge opsamles ved 300 × g i 10 min ved 4 °C.
- Supernatanten og centrifugen opsamles ved 2.000 × g i 20 min ved 4 °C.
- Supernatanten overføres til centrifugerør, centrifuge i 35 min ved 12.000 × g ved 4 °C.
- Supernatanten opsamles, og filteret filtreres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Overførsel til ultracentrifugerør og centrifuge i 80 min ved 110.000 × g ved 4 °C.
- Opbevar supernatanten (exosome-udtømt medium), genbruge pellet i 2 mL af 1x fosfat-buffered saltvand (PBS), og centrifuge i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C.
- Brug pellet i 100 μL PBS til yderligere karakterisering ved hjælp af nanopartikler tracking analyse (NTA) og transmission elektronmikroskopi (TEM) eller i radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer til vestlige blotting.
2. Karakterisering af SEVs
- Nanopartikler tracking analyse (NTA)
BEMÆRK: Størrelsesfordelingen og partikelnummeret/koncentrationen af de rensede SEVs fra RAW 264,7-celler blev målt ved NTA.- Fortynd SEVs i filtreret PBS for at opnå 20-60 vesikler pr. synsfelt for optimal sporing.
- Indfør den fortyndede prøve i en flowcelle ved hjælp af en sprøjtepumpe med en konstant strømningshastighed.
- Tag 3-5 videoer af 30 s hver. Indstil lukkertiden og gevinsten, og fokuser manuelt kameraindstillingerne, så det maksimale antal vesikler er synlige og i stand til at blive sporet og analyseret.
- Fremrykke prøverne mellem hver optagelse for at udføre replikerede målinger. Optimer indstillingerne for NTA efter anskaffelsen, og hold indstillingerne konstante mellem prøverne.
- Analysere hver video ved hjælp af NTA software for at opnå den gennemsnitlige størrelse og koncentration af vesikler.
- Udfør alle NTA-målinger med identiske systemindstillinger for konsistens.
- Western blot
- Kvantificer de samlede proteinmængder i SEVs, cellelyater og exosome-udtømte medier ved hjælp af et proteinanalysesæt efter producentens anvisninger.
- Til celle lysatforberedelse dyrkes RAW 264,7-cellerne i 75 cm2 kolber indtil 80-90% sammenløb. Fjern cellerne med 0,25% trypsin i 10-15 min, neutralisere trypsin med kulturmedier, og pellet cellerne ved at dreje på 400 × g i 5 min. Resuspend cellerne i frisk vækst medium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og overfør 1 × 106 celler til et andet rør. Vask cellerne med PBS to gange ved hjælp af de samme centrifugeringsforhold som ovenfor, og tilsæt 50 μL lysisbuffer (RIPA buffer med proteasehæmmercocktail tilsat) til cellepillen fra det sidste spin.
- Hvirvle cellerne og holde dem på is i 20 min. Lad blandingen centrifugere ved 10.000 × g i 30 min ved 4 °C, opsamle supernatanten (dvs. lysatet) i friske mikrocentrifugerør og holde ved -80 °C, indtil det anvendes.
- Koncentrer 2 mL exosome-udtømte medier til 100 μL ved hjælp af 3 kDa-cutoff centrifugalfiltre, før du kvantificerer mængden af protein. Bland sEVs med lysis buffer i en 1:1 forhold, vortex i 30 s, og inkubere på is i 15 minutter for at kvantificere mængden af protein.
- Bland lige store mængder protein (2 μg) af sEV'erne, RAW 264,7 cellelysatet og exosome-udtømte medier med reduktion af prøvebuffer.
- Denatur prøverne ved 95 °C i 5 min, opbevar dem på is i 5 min og spinder i 2 min ved 10.000 × g. Læg prøverne på en 12% Tris-glycin proteingel og kør gelen ved 125 V i 45 min.
- Proteinet overføres til en polyvinyliden difluorid (PVDF) membran ved 25 V i 2 timer.
- Efter overførslen blokeres PVDF-membranerne med blokerende buffer (se materialetabellen) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuberes blotten med primære antistoffer på en shaker natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Primære antistoffer var anti-CD81 (1:1.000), anti-alpha-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-interagerende protein X (Alix) (1:1.000), anti-Calnexin (1:1,000) og anti-glyceraldehyd 3-fosfat deogenhydrase (GAPDH) (1:1,000). - Vask blotterne 3 x 15 min med 1x Tris-buffered saltvand, 0,1% Tween 20 (TBST), og inkuber ved stuetemperatur med ged anti-mus IgG-peberrod peroxidase (HRP) - eller æsel anti-kanin IgG-HRP-konjugerede sekundære antistoffer (1:10.000) i 1 time på shakeren.
- Vask pletterne 3 x 15 min med 1x TBST, og detekter proteinerne ved hjælp af et HRP-substrat.
- Analysere blots ved forbedret chemiluminescens ved hjælp af en vestlig blot imager.
- Transmission elektronmikroskopi (TEM)
- Fix sEVs ved at genoplive dem i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfat buffer (PB); vortex for 2 x 15 s.
- Anbring en dråbe på 10 μL sEV-affjedring på ren parafilm. Flyd det kulbelagte formvargitter på dråben med deres coatede side mod affjedringen. Lad membranerne absorbere i 20 min i et tørt miljø.
- Placer gitrene (membransiden nedad) på en dråbe PB for at vaske i 3 x 2 min.
- Overfør gitrene til 50 μL på 1% glutaraldehyd i 5 min.
- Rist gitrene med 100 μL destilleret vand i 8 x 2 min.
- Kontrast prøven ved at placere gitre på et fald på 1% uranylacetat i 2 min.
- Prøven integreres med 50 μL på 0,2% uranylacetat med 2% methylcelluloseopløsning i 10 min på en parafilmdækket isskål.
- Brug sløjfer i rustfrit stål til at holde gitrene og fjern overskydende væske med filterpapir.
- Lufttørrer gitteret i 10 minutter, mens du stadig er på løkken.
- Overhold under et transmissionselektronmikroskop ved 80 kV.
3. Mærkning af SEVs
- Fortynd 20 μg sEVs i 1 mL fortyndingsbuffer eller samme mængde PBS i 1 mL fortyndingsbuffer til farvestyring.
- Fortynd 3 μL PKH67- eller PKH26-farvestof i 1 mL fortyndingsbuffer og blandes ved pipettering.
- Tilsæt fortyndet PKH farvestof til de fortyndede SUV'er og bland ved pipettering. Inkuber i 5 minutter i mørket ved stuetemperatur. For en farvestofkontrol blandes det fortyndede farvestof med fortyndet PBS fra trin 3.1.
- Tilsæt 2 mL af 1% kvæg serum albumin (BSA) i PBS til røret med farvestof og sEV mix og til farvestof kontrol rør til at absorbere overskydende farvestof.
- Centrifuge i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C. Supernatanten kasseres, genbruges pellet i 2 mL PBS, og centrifuge i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C. Gentag vasken med PBS, og genbrug de mærkede sEVs eller farvestofkontrollen i et tilsvarende volumen PBS.
- Kvantificer mængden af samlet protein ved Bradford-metoden.
4. Neuro-2a-cellers optagelse af SEVs
- Placer 18 mm coverslips i en 12-brønds plade og plade 10 × 104 Neuro-2a celler i hver brønd i alt 1 mL komplet DMEM medium, der indeholder 10% FBS og 1% pen-strep.
- Skift mediet til DMEM exosome-udtømt medium, når cellekonfluensen er 80-90%. Der tilsættes 1, 5 eller 10 μg mærkede sEVs i hver brønd i hver brønd i 1, 4 og 24 timer for dosis- og tidsafhængig optagelse, eller tilsæt en lige stor mængde farvekontrol.
5. Primære astrocytiske kulturer
- Bedøve 4 postnatal hvalpe 4 dage efter fødslen ved at fremkalde hypotermi.
- Saml hjernen i en 60 mm petriskål, der indeholder iskold Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES).
- Dissekere både kortikale lapper og fjerne meninges. Hakke væv med en steriliseret klinge.
- Vævene overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder papain/deoxyribonuklease I dissociationsbuffer og inkuberes i 20 min ved 37 °C. Hvirvle hver 5 minutter.
BEMÆRK: For 4 musekoriker aktiveres 9 mL på 7,5 U/mL papain i HBSS ved 37 °C i mindst 30 min, filtreres gennem et 0,22 μm sprøjtefilter og blandes med deoxyribonuclease I til en endelig koncentration på 0,1 mg/mL. - Aspirer supernatanten og tilsæt 5 mL komplet DMEM for at inaktivere enzymaktiviteten. Triturere forsigtigt for at adskille vævene med en 5 mL glas serologisk pipette og en flammepoleret Pasteur pipette.
- Gennemdel celleaffjedringen gennem en cellesnæt på 40 μm, og centrifuge cellerne ved 250 × g i 5 min ved 4 °C. Aspirere mediet og frø cellerne i 10 mL af komplet DMEM i en 75 cm2 kolbe. Udskift det supernatante medium med 15 mL frisk DMEM medium 4 timer efter plating.
- Efter 14 dage in vitro, overføre kolben til en orbital shaker at løsne mikroglia og oligodendrocytter ved 320 rpm i 6 timer.
- Trypsinisere de resterende astrocytter ved hjælp af 5 mL af celle dissociationsenzymet (Tabel over materialer) i 10 min ved 37 °C. Der tilsættes 5 mL komplet DMEM for at inaktivere den enzymatiske virkning og pille cellerne ved 250 × g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend cellerne i komplet DMEM. Seed 5 × 104 celler på 12 mm # 1,5 coverslips i en 24-brønd plade.
6. Optagelse af sEVs af astrocytter
- Når astrocytter når 80-90% sammenløb, skal du ændre mediet til DMEM exosome-udtømt medium.
- Der tilsættes 1 μg umærkede, mærkede SEVs, en lige stor mængde farvekontrol eller PBS til cellerne. Brug cellerne til farvning 1 time og 24 timer efter sEV-behandling.
7. Immunofluorescence
- Skyl cellerne med PBS 3x og fastgør dem med 4% PFA i PB i 10 min ved stuetemperatur.
- Vask de faste celler 3 x 5 min med PB og permeabilize dem ved hjælp af 0,1% Triton X-100 i PB i 10-15 min og vask med PB 3 x 5 min.
- Bloker cellerne med 5% normalt gedeserum (NGS) i PB i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuberes cellerne med primære antistoffer: mikrotubule-associeret protein 2 (MAP2A, 1:500) til Neuro-2a-celler eller gæbrillært fætelsyreprotein (GFAP, 1:500) til primære astrocytter i friske 5% NGS/PB natten over ved 4 °C med skånsom rysten.
- Vask 3 x 10 min med PB og tilsæt fluorophore-konjugerede sekundære antistoffer (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; eller Goat Anti-Mouse IgG H &L, Alexa Fluor 488) i 5% NGS og inkuber i 2 timer ved stuetemperatur på en rocker.
- Vask 3 x 10 min med PB og inkuber med 1 μg/mL atomplet 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 10 min ved stuetemperatur. Vask cellerne igen 3x med PB.
- Monter coverlips på # 1 dias ved hjælp af en antifade montering medium. Lad dem tørre natten over i mørke, og opbevar de forberedte glasrutschebaner ved 4 °C, indtil de billeddannelser er på et konfokalt mikroskop.
8. In vivo optagelse af SEVs
- Udfør intrathecal injektion af 5 μg umærkede eller mærkede sEVs resuspended i 10 μL PBS, eller lige volumen (10 μL) af farvestof kontrol (som bearbejdet i afsnit 3) i C57BL/6 mus.
- Efter 6 og 18 h efter injektion af sEVs, dybt bedøve mus ved intraperitoneal injektion af 100 mg/ kg kropsvægt af ketamin og 10 mg/kg kropsvægt af xylazin.
- Udfør intrakardital perfusion af mus med 0,9% saltvand for at skylle blod ud, efterfulgt af frisklavet iskold 4% PFA /PB.
- Dissekere rygmarven og fastgør i 4% PFA/PB ved 4 °C i 24 timer. Kryobeskytte vævene i 30 % saccharose i PB ved 4 °C i 24 timer, eller indtil vævene synker. Opbevar vævene ved 4 °C indtil immunohistochemistry.
9. Immunohistochemistry
- Integrer L4-L5 rygmarv i O.C.T sammensatte. Frys på tøris, indtil den er helt størknet.
- Afsnit væv på 30 μm (tværsnit for rygmarven) ved hjælp af en kryostat, og indsamle sektioner i en 24-brønd plade, der indeholder PB. Afsnittene vaskes 3 x 5 min med 0,3% Triton i PB.
- Bloker ikke-specifikke bindingssteder med 5% NGS i 0,3% Triton /PB i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fortyndede primære antistoffer: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 for mikroglia (1:2.000) med 5% NGS i 0,3% Triton /PB, og inkubere sektioner natten over ved 4 °C på en shaker.
- Vask afsnittene 3 x 5 min med 0,3% Triton/PB, og tilføj sekundære antistoffer (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 eller Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) i 5% NGS / PB i 2 timer ved stuetemperatur.
- Vask 3 x 5 min med PB, og inkuber sektionerne i 1 μg/mL DAPI i 10 min ved stuetemperatur. Vask sektionerne 3 x 5 min med PB.
- Monter sektionerne på et rent klæbende dias (Materialetabel) med en fin pensel under et let mikroskop.
- Våd dæksleren med monteringsmedium. Cure natten over i mørke ved stuetemperatur.
- Billede under et konfokalt mikroskop med de respektive lasere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolering af sEVs fra RAW 264.7 konditionerede medier via centrifugering blev NTA brugt til at bestemme koncentrationen og størrelsesfordelingen af de rensede SUV'er. Den gennemsnitlige gennemsnitlige størrelse af RAW 264,7-afledte sEVs var 140 nm, og den maksimale partikelstørrelse var 121,8 nm, hvilket bekræfter, at de fleste påviselige partikler i lysspredningsmålingen faldt inden for størrelsesområdet af exosomer eller sEVs ved 50-150 nm (Figur 1A). Som foreslået i de minimale oplysninger til undersøgelser af ekstracellulære vesikler 2018 (MISEV2018)23analyserede vi et sæt proteiner, der skulle være til stede eller udelukket fra forskellige EV-populationer. Vestlige blotting af sEVs, celle lysat, og exo-udtømte medier viste, at sEV-afledte proteinprøver indeholdt sEV markør proteiner Alix, CD81, og GAPDH. Cellelysfraktionen blev beriget med endoplasmisk reticulum resident protein, calnexin, som var fraværende i sEVs. Calnexin fungerede således som en negativ markør for cellulær forurening (Figur 1B).
Vi udførte derefter dosisrespons- og tidsforløbseksperimenter til sEV-optagelse in vitro. Neuro-2a-celler blev inkuberet med en enkelt 1 μg dosis PKH67-mærket sEVs i 1, 4 og 24 timer, hvorefter optagelsen af forskellige koncentrationer af SEVs (1, 5 og 10 μg) blev undersøgt ved 1 time. Resultaterne af NTA viste, at 1 μg protein i gennemsnit var lig med ~1 x 109 partikler. Parallelt hermed blev PBS, umærkede SEVs og farvestof-alone kontrol også testet. Vi observerede, at optagelse af sEVs forekom ved 1 h (figur 2A) og for 1, 5 og 10 μg sEVs (figur 2B). Fluorescens kunne påvises ved 4 timer for 5 og 10 μg sEVs (Figur 2C) efter inkubation. Dernæst blev det undersøgt, om der blev taget PKH26-mærket sEVs af primære astrocytter (figur 3). Maksimal fluorescens fra sEV-optagelse i primære kortikale astrocytter forekom ved 24 timer. Umærkede sEVs viste ikke fluorescens, hvilket viser, at sEV autofluorescence ikke væsentligt bidrager til falske positiver (Supplerende figur S1A).
Dernæst blev mærkede SEVs intrathecally injiceret i mus for at vurdere levering og optagelse af sEVs af forskellige celler i rygmarven ved hjælp af immunohistochemistry og konfokal mikroskopi. Vi farvede for MAP2 som en neuronal markør, GFAP som en astrocytisk markør og IBA1 som en mikroglial markør. Neuroner (figur 4), astrocytter (figur 5) og mikrogliale celler (Figur 6) tog alle PKH26-mærkede sEVs, og maksimal sEV fluorescens blev observeret ved 6 h efter injektionen. Mens SEVs ikke altid colocalize med cellulære markører, vi ikke observere nogen differentieret optagelse af CNS celler. Intrathecal injektion med 5 μg umærket RAW 264,7 sEVs eller farvestof kontrol viste ikke signifikant fluorescens (supplerende figur S1B). Fluorescerende signaler blev observeret i meninges, både 6 timer og 18 timer efter injektion af sEVs (supplerende figur S1C).
Figur 1: Karakterisering af renset RAW 264,7 sEVs. (A) Størrelse og koncentration af SEVs blev bestemt ved hjælp af NanoSight NS300. Partiklerne blev sporet og dimensioneret baseret på Brownian bevægelse og diffusion koefficient. Størrelsesfordelingen af SEVs er vist i nm. Koncentrationen af SEVs blev udtrykt som partikler/mL. (B) Vestlig plet af proteiner fremstillet af rensede sEVs, cellelys og exosome-udtømte medier ved hjælp af sEV markører ALIX, GAPDH, og CD81. Den endoplasmaiske reticulumproteinmarkør, calnexin, tjener som en kontrol til at overvåge cellulær forurening i sEV-præparater. (C) Transmission elektronmikroskopi demonstrerede størrelsen og morfologien af sEVs. Skalalinje = 100 nm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; ALIX = Alfa-1,3/1,6-Mannosyltransferase (ALG-2)-interagerende protein X; GAPDH = glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase; CD81 = klynge af differentiering 81. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Neuro-2a-cellers anvendelse af mærket RAW 264,7 sEVs. (A) PKH67-mærket sEVs (1 μg) blev tilføjet til de kultiverede Neuro-2a celler for 1, 4 eller 24 timer. sEV optagelse blev observeret på alle tidspunkter med konfokal mikroskopi. (B) PKH67-mærkede sEVs (1, 5 eller 10 μg) blev tilsat neuro-2a celler i 1 h. (C) PKH67-mærket sEVs (5 eller 10 μg) blev tilføjet til Neuro-2a celler i 4 timer. sEV optagelse blev observeret i alle doseringsgrupper med konfokal mikroskopi. Negative kontrolgrupper behandlet med PKH farvestof alene viste ikke sEV farvning (Supplerende figur S1). Neuro-2a celler var immun farves med MAP2A (undersøgt med Alexa Fluor 594, vist med rødt), mens cellekerner var plettet med DAPI (vist med blåt) og sEVs med PKH67 (vist med grønt). Skalalinje = 50 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; MAP2A = mikrotubule-associeret protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Anvendelse af PKH26-mærket RAW 264,7 sEVs af primære muse kortikale astrocytter. En μg af SEVs blev mærket med PKH26 farvestof og føjet til den primære astrocyt kultur medium. Optagelse af SEVs blev observeret ved 1 og 24 timer efter tilsætning ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop. Astrocytter blev plettet med GFAP (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt), mens cellekerner blev modfarvet med DAPI (vist med blåt), og sEVs var tidligere farves med PKH26 (vist med grønt). Skalastang = 20 μm. PKH26 farvestof alene tjente som en negativ kontrol for sEV farvning. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; GFAP = gialflimmersyresyreholdigt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Optagelse af RAW 264,7 sEVsin neuroner. PKH26-mærkede SEVs blev injiceret intrathecally i mus; 6 og 18 timer senere blev musene gennemsyret af 4% PFA, og rygmarven blev isoleret og sektionsopdelt ved 30 μm. Rygmarvssektioner var immunplettede med en cellemarkør (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt) og DAPI nukleare counterstain (vist med blåt), mens SEVs tidligere var mærket med PKH26 (vist med grønt). Rygmarvssektioner var immunplettede for MAP2A at visualisere neuronerne (rød). Konfokal mikroskopi viser sEVs i MAP2A-positive neuroner på forskellige tidspunkter. Den negative kontrol, PKH26 dye-alone gruppe, viste ikke sEV farvning. Skalalinje = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; PFA = paraformaldehyd; MAP2A = mikrotubule-associeret protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Optagelse af RAW 264,7 sEVs i astrocytter. PKH26-mærkede SEVs blev injiceret intrathecally i mus; 6 og 18 timer senere blev musene gennemsyret af 4% PFA, og rygmarven blev isoleret og sektionsopdelt ved 30 μm. Rygmarvssektioner var immunplettede med en cellemarkør (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt) og DAPI nukleare counterstain (vist med blåt), mens SEVs tidligere var mærket med PKH26 (vist med grønt). Rygmarvssektioner var immunplettede for GFAP at visualisere astrocytter (rød). Konfokal mikroskopi viser sEVs i GFAP-positive astrocytter på forskellige tidspunkter. Den negative kontrol, PKH26 dye-alone gruppe, viste ikke sEV farvning. Skalalinje = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; PFA = paraformaldehyd; GFAP = gialflimmersyresyreholdigt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Anvendelse af RAW 264,7 sEVs i mikroglia. PKH26-mærkede SEVs blev injiceret intrathecally i mus; 6 og 18 timer senere blev musene gennemsyret af 4% PFA, og rygmarven blev isoleret og sektionsopdelt ved 30 μm. Rygmarvssektioner var immunplettede med en cellemarkør (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt) og DAPI nukleare counterstain (vist med blåt), mens SEVs tidligere var mærket med PKH26 (vist med grønt). Rygmarvssektioner var immunplettede for IBA1 for at visualisere mikroglia (rød). Konfokal mikroskopi viser SEVs i IBA1-positive mikroglia på forskellige tidspunkter. Den negative kontrol, PKH26 dye-alone gruppe, viste ikke sEV farvning. Skalalinje = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; PFA = paraformaldehyd; IBA1 = ioniseret calciumbindende adaptermolekyle 1; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur S1: Optagelse af mærket RAW 264,7 sEVs af primære mus kortikale astrocytter og i rygmarven. (A) Kontrol med optagelse af PKH26-mærket RAW 264,7 sEVs af primære mus kortikale astrocytter. En μg af umærkede sEVs re suspenderet i PBS eller en lige stor mængde PBS blev tilføjet parallelt med kulturmediet af astrocytter. Der blev ikke observeret fluorescens ved 1 time for PBS og den umærkede kontrol ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop. Astrocytter blev plettet med GFAP (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt), mens kernerne var kontraplettede med DAPI (blå), og umærkede sEVs blev visualiseret under den samme Alexa Fluor 546 kanal som PKH26-mærket sEVs. Skalastang = 50 μm. (B) Kontrol med optagelse af PKH26-mærket RAW 264,7 sEVs med musemarvsmarv in vivo. Fem μg umærkede SEVs eller farvestofkontrol blev injiceret intrathecally hos mus. Igen, fluorescerende signaler blev ikke observeret for umærkede SEVs eller farvestof-alone kontrol ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop. Astrocytter blev plettet med GFAP (undersøgt med Alexa Fluor 488, vist med rødt), mens kerner blev counterstained med DAPI (blå), og umærkede sEVs blev visualiseret under den samme Alexa Fluor 546 kanal som PKH26-mærket sEVs. Skalabar = 50 μm. (C)Repræsentative billeder afslører tilstedeværelsen af RAW 264,7 sEVs i musemarvsudser 6 timer og 18 timer efter intrathecal levering. Fem μg sEVs var mærket med PKH26 farvestof (vist med grønt), og kernerne var counterstained med DAPI (vist med blåt). Stjerner angiver den forreste rygmarvspulsåre. Skalalinje = 50 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesikler; PBS = fosfatbufferet saltvand; GFAP = gialflimmersyresyreholdigt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol viste vi mærkning af SEVs med PKH farvestoffer og visualisering af deres optagelse i rygmarven. PKH lipofile fluorescerende farvestoffer anvendes i vid udstrækning til mærkning af celler efter flowcytometri og fluorescerende mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grund af deres relativt lange halveringstid og lave cytotoksicitet kan PKH-farvestoffer bruges til en lang række in vivo- og in vitro-cellesporingsundersøgelser26,27. Selvom fremragende membranfastholdelse og biokemisk stabilitet er fordelagtige, kan intercalationen af fluorescerende sonder med lipoproteinforurenninger renset med sEVs kompromittere fortolkningen af sEV internalisering og funktionelle undersøgelser. Således er rensning og mærkning af sEVs kritiske trin i protokollen, fordi persistensen af farvestoffer med forurenende stoffer kan føre til fejlfortolkning af in vivo distribution28. Inddragelsen af kontroller er afgørende for at undgå falsk-positive fluorescenssignaler på grund af ikke-specifik mærkning af partikler og den lange halveringstid af disse farvestoffer.
Sammenlægning og micelle dannelse af lipophilic farvestoffer kan også give falske signaler. Vi løste problemet med gratis eller ubundet farvestof ved at inkludere en farvestof-alone kontrol og visualisere EV optagelse på tidligere tidspunkter. En vigtig begrænsning rapporteret for PKH mærkning er, at mange PKH26 nanopartikler dannes under PKH26 farvestof mærkning af sEVs. Selvom det ikke er inkluderet i denne protokol, rapporteres det, at PKH26 nanopartikler kan fjernes med en saccharosegradient29. En anden undersøgelse evaluerede effekten af PKH-mærkning på størrelsen af SEVs af NTA og rapporterede en stigning i størrelse efter PKH mærkning30. Ikke desto mindre tjener PKH-farvestoffer som en pragmatisk og værdifuld sporstof for at vise, hvor SEVs har krydset. En anden begrænsning af denne undersøgelse er, at vi ikke kvantificere SEVs som denne protokol fokuserer på bekræftelse af cellulære optagelse efter intrathecal levering. Nye cyanin-baserede membran sonder er blevet udviklet for nylig for meget følsomme fluorescens billeddannelse af sEVs uden at ændre størrelsen eller generere artefakter, såsom dannelsen af PKH nanopartikler31, og vil uden tvivl forbedre fremtidige mærkning undersøgelser.
Selvom makrofager spiller vigtige roller i neuroinflammation, udøver de også neuroprotektive funktioner ved at levere deres last via exosomer32. Vores undersøgelser viser, at mærket makrofag-afledte sEVs er taget op af Neuro-2a celler, primære astrocytter, og i lændemarven efter intrathecal administration. Resultaterne tyder på, at en længere inkubationstid kan føre til lavere sEV-signalintensitet, som kan tilskrives nedbrydningen af sEVs eller celledeling af Neuro-2a-celler i kultur33,34. Selvom lav-throughput, denne protokol til visualisering mærket SEVs i rygmarven kan bruges til indledende validering undersøgelser, der bekræfter sEV optagelse før undersøgelse af den funktionelle virkning af SEVs leveret intrathecally. Som vi observerede generelt lignende sEV optagelse i flere CNS celletyper, optagelsesprocessen synes at være ikke-selektiv. Hvis autofluorescence er et problem i billeddannelse, umærkede SEVs kan bruges som en ekstra kontrol til at ophæve SEV autofluorescence under billeddannelse af væv og kulturer. Selv om dosis og rute for administration af SEVs kan påvirke mønsteret af biodistribution11, denne protokol er ikke optimeret til kvantitativ analyse af sEV optagelse. Flere forskellige tilgange og forskellige billedbehandlingsstrategier anvendes til at undersøge SEVs, og disse bliver løbende raffineret og optimeret til in vivo tracking af SEVs2.
Denne protokol er beregnet til at være blot én tilgang til at bekræfte SEV optagelse. Som med alle protokoller kan krydsvalidering ved hjælp af multimodale tilgange være gavnlig. Specifikt kan optagelsen af SEVs bekræftes ved at undersøge biomolekylær lastoverførsel til modtagerceller og væv. Hvis investigator kender miRNA-sammensætningen af leverede sEVs, ville en alternativ tilgang til bekræftelse af sEV-overførsel være at kontrollere for miRNA-ændringer i modtagercellerne eller bestemme ændringerne i udtryksniveauerne af målgener for de overførte miRNA'er. PBS-behandlede prøver kan bruges som en kontrol for denne tilgang. Samlet set understøtter disse resultater konceptet om, at makrofag-afledte sEVs optages af CNS-celler in vitro og in vivo. Denne protokol kan bruges til at undersøge den rolle, SEVs i spinal lidelser, smerte, og betændelse og til at afgøre, om SEVs kan udvikles som cellulære køretøjer til levering af terapeutiske små molekyler, RNA, og proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra NIH NINDS R01NS102836 og Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) tildelt Seena K. Ajit. Vi takker Dr. Bradley Nash for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
