Summary
我们描述了一个协议，用PKH染料标记大噬细胞衍生的小细胞外囊泡，并在体外和脊髓中观察它们 在体外 和脊髓内分娩后的吸收情况。
Abstract
小细胞外囊泡（SEV）是50-150纳米囊泡分泌的所有细胞，存在于体液中。SEV将RNA、蛋白质和脂质等生物分子从供体转移到接受细胞，使它们成为细胞之间的关键信号介质。在中枢神经系统 （CNS） 中，SEV 可以调解细胞间信号，包括神经免疫相互作用。SEV功能可以通过跟踪在 体外 和体内接受细胞中标记的SEV 的吸收来研究。本文描述了使用PKH膜染料从RAW 264.7巨噬细胞的受条件介质中对SEV进行标记。它显示了不同浓度的标记SEV在多个时间点由神经-2a细胞和原发性星细胞 在体外吸收。同时显示的是小鼠脊髓神经元、星形细胞和通过共聚焦显微镜可视化的微胶质在细胞内提供的SEV的吸收。具有代表性的结果表明，不同细胞吸收SEV时存在时间依赖性变化，这有助于确认SEV成功输送到脊髓中。
Introduction
小细胞外囊泡 （SEV） 是纳米大小的膜衍生囊泡，尺寸范围为 50-150 nm。它们来自多车辆体（MVB），在MVB与等离子膜融合后从细胞中释放出来。SEV 含有 miRNA、mRNA、蛋白质和生物活性脂质，这些分子以细胞间通信的形式在细胞之间转移。SEV可以通过各种内分泌通路由受体细胞内化，而受体细胞对SEV的捕获则通过识别电动汽车和目标细胞1上的表面分子进行介质。
SEV之所以引起人们的兴趣，是因为他们能够触发接受细胞的分子和表型变化，它们作为治疗剂的效用，以及它们作为货物分子或药理剂载体的潜力。由于其体积小，SEV 的成像和跟踪可能具有挑战性，尤其是在活体研究和临床环境中。因此，许多方法已经开发成标签和图像SEV，以帮助其生物分布和跟踪体外和体内2。
研究SEV生物分布和靶向细胞相互作用的最常见技术是用荧光染料分子3、4、5、6、7标记它们。电动汽车最初被标记为细胞膜染料，通常用于成像细胞。这些荧光染料通常会弄脏 SEV 上感兴趣的脂质双层或蛋白质。几种嗜脂染料在加入细胞溶胶时会显示强烈的荧光信号，包括 DiR （1，1+-二恶英-3，3，3+，3+-四甲基三氯氰胺碘化物），DiL （1，1+二恶英-3， 3， 3+， 3+ 四甲基丁二甲基高氯酸酯）， 和 DiD （1， 1 + 二恶英-3， 3， 3+， 3+ 四甲基因多碳氰酸酯 4-氯苯硫酸盐）8，9，10，11.
其他嗜脂染料，如PKH67和PKH26，具有高荧光极性头组和长脂烃尾，容易相互扩展成任何脂质结构，并导致长期染料保留和稳定的荧光12。PKH染料也可以标记EV，这允许在体内13的EV性能的研究。许多其他染料已被用来观察外显微镜和流动细胞学，包括脂质标签染料14和细胞渗透染料，如卡盒氟辛二甲酸酯（CFDA-SE）15，16和钙素乙酰乙酰（AM）酯17。
CNS中不同细胞之间的SEV介质相声研究，为神经炎和神经退行性疾病的发病机制提供了重要的见解。例如，来自神经元的SEV可以传播β-淀粉样肽和磷酸tau蛋白，并有助于阿尔茨海默病的发病机制。此外，从红细胞衍生的EV含有大量的α-核素，可以跨越血脑屏障，并有助于帕金森病理学20。SEV能够跨越生理障碍21，并将他们的生物分子转移到靶向细胞，使他们方便的工具，提供治疗药物到CNS22。
将脊髓中无数CNS细胞的SEV吸收可视化，将使得机械研究和评估来自各种细胞来源的外源性管理SEV的治疗益处。本文描述了从巨噬细胞中提取的SEV标签的方法，并通过神经元、微胶质和星形细胞在腰椎间体 外 和 体内 成像，通过可视化定性地确认SEV交付。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有程序均符合《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》，并经德雷塞尔大学医学院机构动物护理与使用委员会批准。定时怀孕的CD-1小鼠用于星体细胞培养，所有水坝在浸渍15天后收到。十二周大的C57BL/6小鼠用于 活体 吸收实验。
1. 从 RAW 264.7 巨噬细胞中分离 SEV
- 培养 RAW 264.7 细胞在 75 厘米2 烧瓶在 DMEM 外体耗尽介质包含 10% 外体耗尽的胎儿牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素链霉素 （笔链） 为 24-48 小时.
- 在 300 × g 下收集 300 mL 的有条件介质和离心机，在 4 °C 下收集 10 分钟。
- 以 2，000 × g 收集超纳特和离心机，在 4 °C 下收集 20 分钟。
- 将超高离心剂转移到离心机管，离心机在 12，000 × g 在 4 °C 下离心 35 分钟。
- 通过 0.22 μm 注射器过滤器收集超高纳特和过滤器。
- 以 110，000 × 克 在 4 °C 下转移到超中心输液管和离心机 80 分钟。
- 将超高分子（外脏耗尽介质）储存，将颗粒重新储存在 2 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，离心机在 110，000 × g 下以 4°C 为 1 小时。
- 使用纳米粒子跟踪分析 （NTA） 和传输电子显微镜 （TEM） 或用于西式印迹的放射性免疫沉淀检测 （RIPA） 缓冲器，将颗粒重新沉降到 100 μL 的 PBS 中，以进一步进行定性。
2. SEV 的特征
- 纳米粒子跟踪分析 （NTA）
注：NTA测量了原始264.7细胞纯化SEV的大小分布和粒子数/浓度。- 在过滤的 PBS 中稀释 SEV，以获得每个视场 20-60 个囊泡，以便进行最佳跟踪。
- 使用具有恒定流量的注射器泵将稀释的样品引入流细胞。
- 拍摄 3-5 个视频，每个视频 30s。设置快门速度和增益，并手动对焦相机设置，使最大数量的囊泡可见并能够被跟踪和分析。
- 在每个记录之间预录样本以执行复制测量。优化收购后的 NTA 设置，并保持样品之间的设置保持恒定。
- 使用 NTA 软件分析每个视频，以获得囊泡的平均大小和浓度。
- 执行所有具有相同系统设置的 NTA 测量，以实现一致性。
- 西方污点
- 根据制造商的说明，使用蛋白质检测试剂盒，在 SEV、细胞解剖剂和外体耗尽介质中量化总蛋白质量。
- 对于细胞解冻制备，将 RAW 264.7 细胞培养成 75 厘米2 烧瓶，直到 80-90% 的汇合。分离细胞与0.25%的试金素10-15分钟，中和的试丁鱼与培养介质，并通过旋转400× 克 5分钟颗粒细胞。将细胞重新用于新鲜生长介质。
- 使用血细胞计计算细胞，并将 1 × 106 细胞转移到另一个管中。使用与上述相同的离心条件用 PBS 清洗细胞两次，并在细胞颗粒中加入 50 μL 裂解缓冲器（RIPA 缓冲器，加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒）到细胞颗粒中。
- 将细胞旋涡，在冰上保存20分钟。将混合物置于 10，000 × g 的离心下，在 4 °C 下 30 分钟，在新鲜的微中心管中收集超高纳坦（即解剖剂），并保持在 +80 °C，直到使用。
- 在量化蛋白质量之前，使用 3 kDa 切口离心滤清器将 2 mL 的外体耗竭介质浓缩到 100 μL。将SEV与裂解缓冲器混合在1：1的比例，漩涡为30s，并在冰上孵育15分钟，以量化蛋白质的数量。
- 将等量的蛋白质（2微克）与减少样品缓冲混合，RAW 264.7细胞溶酶和外体耗尽介质。
- 将样品在 95 °C 下电 5 分钟，在冰上保存 5 分钟，在 10，000 × 克时旋转 2 分钟。将样品加载到 12% 的 Tris-glycine 蛋白凝胶上，以 125 V 的速度运行凝胶 45 分钟。
- 将蛋白质以 25 V 为 2 小时的二氟化物 （PVDF） 膜传输到聚氯乙烯二氟化物 （PVDF） 膜上。
- 转移后，在室温下用阻塞缓冲器（参见 材料表）阻隔 PVDF 膜 1 小时。
- 在 4 °C 的摇床上用原先抗体在一夜之间孵育污点。
注：使用的主要抗体是抗CD81（1：1，000），抗α-1，3/1，6-曼诺西转移酶（ALG-2）相互作用蛋白X（阿利克斯）（1，3/1），6-曼诺西转移酶（ALG-2）相互作用蛋白X（阿利克斯）（1，3/1）1：1，000）、抗卡内辛（1：1，000）和抗甘油醛3-磷酸盐脱氢酶（GAPDH）（1：1，000）。 - 用 1x Tris 缓冲盐水清洗污点 3 x 15 分钟， 0.1% Tween 20 （TBST），并在室温下用山羊抗鼠伊格-马萝卜过氧化酶 （HRP） - 或驴抗兔IgG-HRP结合二级抗体（1：10，000）在摇床上孵育1小时。
- 用 1x TBST 清洗 3 x 15 分钟的污点，并使用 HRP 基板检测蛋白质。
- 使用西式斑点成像仪通过增强的化学发光来分析污点。
- 传输电子显微镜 （TEM）
- 通过在 0.1 M 磷酸盐缓冲 （PB） 中的 2% 副甲醛 （PFA） 中重新悬浮来修复 SEV;漩涡为 2 x 15 s。
- 将 10 μL 的 SEV 悬架滴放在干净的准胶片上。将碳涂层的 Formvar 格子漂浮在掉落的上，其涂层侧面朝悬浮。让膜在干燥环境中吸收20分钟。
- 将网格（膜侧向下）放在一滴PB上洗3×2分钟。
- 将网格传输至 50 μL 的 1% 谷胱甘肽 5 分钟。
- 用 100 μL 蒸馏水清洗网格 8 x 2 分钟。
- 对比样品，将网格放在1%的醋酸尿素下降2分钟。
- 将样品与 50 微升 0.2% 的醋酸尿素结合 2% 甲基纤维素溶液，在覆盖的冰盘上 10 分钟。
- 使用不锈钢环保持网格，并用滤纸去除多余的液体。
- 在循环中仍对网格进行 10 分钟的空气干燥。
- 在80千伏的传输电子显微镜下观察。
3. SEV 标签
- 在 1 mL 的稀释缓冲器中稀释 20 μg 的 SEV 或在 1 mL 的染料控制稀释缓冲器中稀释相同体积的 PBS。
- 将 PKH67 或 PKH26 染料稀释 3 μL 在 1 mL 的稀释缓冲中，通过管道混合。
- 将稀释的 PKH 染料添加到稀释的 SEV 中，然后通过管道混合。在室温下在黑暗中孵育5分钟。对于染料控制，将稀释的染料与第 3.1 步稀释的 PBS 混合。
- 在 PBS 中加入 2 mL 1% 牛血清白蛋白 （BSA）到管中，用染料和 SEV 混合物以及染料控制管吸收多余的染料。
- 离心机 1 小时，110，000 × g，4 °C。 丢弃超高纳特，在 2 mL 的 PBS 中重新使用颗粒，在 4 °C 下以 110，000 × g 离心机离心机 1 小时。 使用 PBS 重复洗涤，并以等量的 PBS 重新使用标记的 SEV 或染料控制。
- 用布拉德福德方法量化总蛋白质的量。
4. 神经-2a细胞吸收SEV
- 将 18 mm 盖片放在 12 井板和 10 × 104 神经-2a 细胞的每个井中，总共 1 mL 的完整 DMEM 介质中含有 10% FBS 和 1% 笔链。
- 当细胞汇合为 80-90% 时，将介质更改为 DMEM 外耗竭介质。在每个井中加入 1、5 或 10 μg 的标签 SEV，用于 1、4 和 24 小时的剂量和时间依赖性吸收，或添加同等数量的染料控制。
5. 主要星体文化
- 通过诱导体温过低，在出生后4天麻醉4只产后幼崽。
- 收集大脑在一个60毫米的培养皿含有冰冷汉克的平衡盐溶液（HBSS），辅以10mM 4-（2-羟基乙基）-1-管道酸（HEPES）。
- 解剖皮质叶和去除脑膜。用消毒刀片切碎纸巾。
- 将组织转移到一个15mL圆锥管，其中含有帕明/脱氧核素酶I分离缓冲器，并在37°C下孵育20分钟。 每 5 分钟旋转一次。
注：对于 4 个鼠标皮质，HBSS 中 9 mL 的 7.5 U/mL Papain 在 37 °C 下激活至少 30 分钟，通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤，并与脱氧核素酶 I 混合，最终浓度为 0.1 毫克/毫升。 - 吸气超纳坦，并添加5mL的完整DMEM，以灭活酶活性。小心地三重奏，用 5 毫升玻璃血清学移液器和火焰抛光巴斯德移液器分离组织。
- 通过 40 μm 细胞过滤器传递细胞悬浮液，并在 250 × g 下离心 5 分钟，在 4 °C 下离心。 在 75 厘米2 的烧瓶中将介质吸气并播种 10 mL 的完整 DMEM 中的细胞。电镀后，用 15 mL 的新鲜 DMEM 介质 4 h 替换超高介质。
- 在体外14天后，将烧瓶转移到轨道摇床，以320转时以6小时分离微胶质和寡头细胞。
- 在37°C下使用5ml的细胞分离酶（材料表）尝试将剩余的星细胞消毒10分钟。 加入5mL的完整DMEM，以灭活酶作用，并在250×g下在4°C下将细胞颗粒5分钟。
- 将细胞重新悬念在完整的 DMEM 中。种子 5 × 104 细胞在 12 毫米 #1.5 盖片在 24 井板.
6. 星细胞吸收SEV
- 当星细胞达到 80-90% 的汇合时，将介质更改为 DMEM 外耗竭介质。
- 在细胞中加入 1 μg 未标记、标记的 SEV、同等数量的染料控制或 PBS。使用细胞在 SEV 治疗后涂色 1 小时和 24 小时。
7. 免疫荧光
- 用PBS 3x冲洗细胞，在室温下用PB中4%的PFA将其修复10分钟。
- 用 PB 清洗固定单元 3 x 5 分钟，在 PB 中使用 0.1% Triton X-100 将其渗透 10-15 分钟，然后用 PB 3 x 5 分钟清洗。
- 在室温下，用PB中5%的正常山羊血清（NGS）阻断细胞1小时。
- 用原发性抗体孵育细胞：神经-2a细胞的微管相关蛋白质2（MAP2A，1：500），或在4°C的新鲜5%NGS/PB过夜时，在新鲜5%NGS/PB中对原发性纤维酸性蛋白（GFAP，1：500）进行轻度摇晃。
- 用PB洗3 x 10分钟，加入荧光结合的二级抗体（山羊抗鼠格1，亚历克萨荧光594;或山羊抗鼠标IgG H&l，亚历克萨氟488）在5%的NGS和孵育2小时的室温在摇动器上。
- 用PB洗3 x 10分钟，在室温下用1微克/mL的核污渍4'，6-二苯甲酸酯（DAPI）孵育10分钟。用 PB 再次清洗细胞 3 倍。
- 使用防褪料安装介质将盖片安装在 #1 幻灯片上。让它们在黑暗中干燥过夜，并将准备好的玻璃滑梯存储在 4 °C 下，直到在共聚焦显微镜上成像。
8. 在体内 吸收 SEV
- 将 5 μg 未贴标签或标记的 SEV 在 10 μL PBS 中重新使用，或将染料控制等量 （10 μL） 注射到 C57BL/6 小鼠体内（如第 3 节所准备）。
- 注射SEV后6小时和18小时，通过腹内注射100毫克/千克的氯胺酮和10毫克/公斤的锡拉津体重，对小鼠进行深度麻醉。
- 对有0.9%盐水的小鼠进行内敷，以冲出血液，然后是新鲜出泡的冰冷4%PFA/PB。
- 解剖脊髓，在 4 °C 下固定 4% PFA/PB，24 小时。在 4 °C 的 PB 中，在 30% 蔗糖中冷冻保护组织，持续 24 小时，或直到组织下沉。将组织储存在 4 °C 下，直到免疫造血。
9. 免疫化学
- 将L4-L5脊髓嵌入O.C.T化合物中。冻结在干冰上，直到完全凝固。
- 使用低温统计器在 30 μm（脊髓横截面）处分割组织，并在含有 PB 的 24 井板中收集这些部分。用 PB 中的 0.3% Triton 清洗第 3 x 5 分钟。
- 在室温下，在 2 小时的 2 小时中，用 5% NGS 在 0.3% Triton/PB 中阻止非特定的绑定站点。
- 稀释原发抗体：抗MAP2A（1：500）、GFAP（1：1，000）、Iba1（1：2，000），5%NGS在0.3%的Triton/PB，并在摇床上以4°C孵育部分过夜。
- 用 0.3% Triton/PB 清洗第 3 x 5 分钟，并在室温下 5% NGS/PB 中加入二级抗体（驴抗兔 IgG 亚历克萨氟 488、1：500 或山羊抗鼠 Igg Alexa Fluor 488、1：500），2 小时的 NGS/PB。
- 用 PB 清洗 3 x 5 分钟，并在室温下将部分以 1 μg/mL 的 DAPI 中孵育 10 分钟。用 PB 清洗第 3 x 5 分钟。
- 在清洁的胶粘剂幻灯片（材料表）上用细小的画笔在光显微镜下安装部分。
- 用安装介质弄湿盖唇。在室温下在黑暗中过夜。
- 与相关激光器在聚焦显微镜下的图像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过离心将 SEV 与 RAW 264.7 条件介质隔离后，NTA 用于确定纯化 SEV 的浓度和大小分布。RAW 264.7 衍生 SEV 的平均平均尺寸为 140 nm，峰值粒子大小为 121.8 nm，确认光散射测量中大多数可检测到的粒子在 50-150 nm 的外显子或 SEV 大小范围内（图 1A）。正如在细胞外囊泡研究的最小信息2018（MISEV2018）23建议，我们分析了一组蛋白质，应该存在或排除在不同的EV种群。SEV、细胞裂解物和外耗介质的西式印迹表明，SEV衍生的蛋白质样本中含有SEV标记蛋白阿利克斯、CD81和GAPDH。细胞解剖部分富含内质质视网膜常驻蛋白，钙素，这是在SEV中不存在的。因此，卡内辛作为细胞污染的阴性标记（图1B）。
接下来，我们进行剂量反应和时间过程实验的SEV摄取 体外。Neuro-2a 细胞以单个 1 μg 剂量的 PKH67 标记的 SEV 孵育，剂量为 1、4 和 24 小时，随后在 1 小时检查不同浓度的 SEV（1、5 和 10 μg）的吸收情况。NTA的结果表明，平均1微克蛋白质等于+1 x 109 颗粒。同时，还测试了PBS、无标签的SEV和染料单独控制。我们观察到，SEV 的吸收发生在 1 小时 （图 2A）和 1、5 和 10 μg sEV （图 2B）。孵化后，5 和 10 μg 的 SEV （图2C）可在 4 小时检测到荧光。接下来，对PKH26标签的SEV的原发性星形细胞的摄取进行了检查（图3）。原皮质星核细胞中 SEV 吸收的最大荧光发生在 24 小时。未标记的 SEV 未显示荧光，表明 SEV 自动荧光不会显著导致误报（补充图 S1A）。
接下来，用体外注射标记的SEV，利用免疫造影术和共聚焦显微镜评估脊髓中不同细胞的SEV的传递和吸收情况。我们染色为 MAP2 作为神经元标记，GFAP 作为星形标记，IBA1 作为微胶质标记。神经元（图4）、星形细胞（图5）和微胶质细胞（图6）都占据了PKH26标签的SEV，注射后6小时观察到最大SEV荧光。虽然 SEV 并不总是与细胞标记共用，但我们没有观察到 CNS 细胞的任何差分吸收。5微克未贴标签的RAW 264.7 SEV或染料控制剂的机内注射没有显示显著荧光（补充图S1B）。注射SEV（补充图S1C）后，在脑膜中观察到荧光信号，均为6小时和18小时。
图1：纯化RAW 264.7 SEV的表征。（A）SEV的尺寸和浓度是使用NanoSightNS300确定的。粒子根据布朗运动和扩散系数进行跟踪和大小。SEV 的大小分布以 nm 表示。SEV 的浓度表示为颗粒/mL。（B） 使用 SEV 标记 ALIX、GAPDH 和 CD81 从纯化 SEV、细胞裂解剂和外体耗竭介质中提取的蛋白质的西式污点。内质球蛋白标记，卡内辛，作为监测细胞污染在SEV制剂的控制。（C） 传输电子显微镜显示SEV的大小和形态。秤杆 = 100 纳米。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;ALIX = 阿尔法-1，3/1，6-曼诺西转移酶（ALG-2）相互作用蛋白X;GAPDH = 甘油醛 3 磷酸盐脱氢酶;CD81 = 差异化组 81。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：神经-2a细胞对标记的RAW 264.7 SEV的吸收。（A） PKH67 标记的 SEV （1 μg） 被添加到培养的神经-2a 细胞中，用于 1、4 或 24 小时 SEV 吸收，在任何时间点都通过共聚焦显微镜观察到。（B） PKH67 标签的 SEV （1，5 或 10 μg） 被添加到神经 -2a 细胞 1 小时（C）PKH67 标签的 SEV （5 或 10 μg） 添加到神经 -2a 细胞 4h. SEV 吸收观察到所有剂量组与共聚焦显微镜。单独使用 PKH 染料处理的负对照组没有显示 SEV 染色（补充图 S1）。Neuro-2a 细胞被 MAP2A（用 Alexa Fluor 594 探测，以红色显示）进行免疫染色，而细胞核则被 DAPI（以蓝色显示）和使用 PKH67（以绿色显示）的 SEV 所染色。秤杆 = 50μm。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;MAP2A = 微管相关蛋白质 2A;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：主要鼠标皮质星形细胞吸收PKH26标签的RAW 264.7 SEV。 一微克的SEV被标记为PKH26染料，并添加到主要的星细胞培养基。使用共聚焦激光扫描显微镜在 1 小时和 24 小时后观察到 SEV 的吸收。星形细胞被 GFAP 染色（用 Alexa Fluor 488 探测，以红色显示），而细胞核则与 DAPI（以蓝色显示）进行反染，而 SEV 以前被 PKH26 污染（以绿色显示）。单单 PKH26 染料就对 SEV 染色起到了负控制。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;GFAP = 胶质纤维酸性蛋白质;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：RAW 264.7 SEVSin神经元的吸收。 PKH26标签的SEV在小鼠体内注射：6 和 18 小时后，小鼠被灌注了 4% 的 PFA，脊髓被隔离，并在 30 μm 处进行剖腹产。脊髓部分被细胞标记（用Alexa Fluor 488探测，以红色显示）和DAPI核计数器（以蓝色显示）进行免疫，而SEV以前标有PKH26（以绿色显示）。脊髓部分被免疫染色为MAP2A可视化神经元（红色）。聚焦显微镜显示不同时间点 MAP2A 阳性神经元的 SEV。负控制，PKH26染料单独组，没有显示SEV染色。秤杆 = 20μm。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;PFA = 副甲醛;MAP2A = 微管相关蛋白质 2A;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：在星形细胞中吸收RAW 264.7 SEV。 PKH26标签的SEV在小鼠体内注射：6 和 18 小时后，小鼠被灌注了 4% 的 PFA，脊髓被隔离，并在 30 μm 处进行剖腹产。脊髓部分被细胞标记（用Alexa Fluor 488探测，以红色显示）和DAPI核计数器（以蓝色显示）进行免疫，而SEV以前标有PKH26（以绿色显示）。脊髓部分被免疫染色为GFAP可视化星形细胞（红色）。聚焦显微镜显示不同时间点的 GFAP 阳性星形细胞中的 SEV。负控制，PKH26染料单独组，没有显示SEV染色。秤杆 = 20μm。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;PFA = 副甲醛;GFAP = 胶质纤维酸性蛋白质;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在微胶质中吸收RAW 264.7 SEV。 PKH26标签的SEV在小鼠体内注射：6 和 18 小时后，小鼠被灌注了 4% 的 PFA，脊髓被隔离，并在 30 μm 处进行剖腹产。脊髓部分被细胞标记（用Alexa Fluor 488探测，以红色显示）和DAPI核计数器（以蓝色显示）进行免疫，而SEV以前标有PKH26（以绿色显示）。脊髓部分被免疫染色为IBA1可视化微胶质（红色）。聚焦显微镜显示 IBA1 阳性微胶质中的 SEV 在不同时间点。负控制，PKH26染料单独组，没有显示SEV染色。秤杆 = 20μm。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;PFA = 副甲醛;IBA1 = 电电钙结合适配器分子1;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图S1：主要小鼠皮质星形星形细胞和脊髓吸收标记的RAW 264.7 SEV。 （A） 控制主要鼠标皮质星核细胞吸收PKH26标记的RAW 264.7 SEV。在 PBS 中重新使用的一 μg 未标记的 SEV 或等量的 PBS 与星细胞的文化介质同时添加。PBS 和未标记控制使用共聚焦激光扫描显微镜在 1 小时时未观察到荧光。星形细胞被 GFAP 染色（用亚历克萨氟 488 探测，以红色显示），而核被与 DAPI（蓝色）相色，未标记的 SEV 在相同的亚历克萨氟 546 通道下可视化为 PKH26 标记的 SEV。比例栏 = 50μm.（B） 控制吸收PKH26标签的RAW 264.7 SEV通过鼠标脊髓 在体内。在小鼠体内注射了五μg的无标签的SEV或染料控制剂。同样，使用共聚焦激光扫描显微镜，未标记的 SEV 或染料单独控制未观察到荧光信号。星形细胞被 GFAP 染色（用亚历克萨氟 488 探测，以红色显示），而核则与 DAPI（蓝色）相色，未标记的 SEV 在相同的亚历克萨氟 546 通道下可视化为 PKH26 标记的 SEV。比例栏 = 50 μm. （C） 代表图像显示鼠标脊髓膜 6 h 和 18 h 在机内分娩后存在 RAW 264.7 SEV。五微克的 SEV 标有 PKH26 染料（以绿色显示），核被 DAPI 标记（以蓝色显示）。星号表示前脊髓动脉。秤杆 = 50μm。缩写：SEV = 小细胞外囊泡;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;GFAP = 胶质纤维酸性蛋白质;达皮 = 4 +， 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 苯林多勒。 请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在此协议中，我们展示了带有 PKH 染料的 SEV 标签及其在脊髓中的吸收的可视化。PKH嗜红荧光染料被广泛用于通过流细胞学和荧光显微镜3，5，6，12，24，25标记细胞。由于PKH染料的半衰岁和细胞毒性相对较低，可用于广泛的体内和体外细胞跟踪研究26，27。虽然出色的膜保留和生化稳定性是有利的，但荧光探针与脂蛋白污染物的相互作用，用SEV净化，可以损害SEV内化和功能研究的解释。因此，SEV的净化和标签是协议中的关键步骤，因为具有污染物的染料的持久性可能导致体内分布28的误解。由于颗粒的非特定标记和这些染料的长半衰期，包含控制对于避免误报荧光信号至关重要。
脂质染料的聚合和鼠标形成也可能产生错误信号。我们通过包括单独染料控制和在较早的时间点可视化 EV 吸收来解决免费或未绑定染料的问题。PKH 标签的一个重要限制是，在 SEV 的 PKH26 染料标签过程中形成了许多 PKH26 纳米粒子。虽然没有包括在本协议中，但据报道，PKH26纳米粒子可以通过蔗糖梯度29去除。另一项研究评估了PKH标签对NTA的SEV尺寸的影响，并报告说PKH标签30后尺寸增加。然而，PKH染料作为一个实用和有价值的示踪剂，以显示SEV走过的地方。这项研究的另一个局限性是，我们没有量化SEV，因为本协议侧重于确认细胞吸收后，内分娩。新型氰化物基膜探针最近开发用于对SEV进行高度灵敏的荧光成像，而不改变尺寸或产生人工制品，如PKH纳米粒子31的形成，无疑将改善未来的标签研究。
虽然巨噬细胞在神经刺激中起着重要作用，但它们也通过外显子32运送货物来发挥神经保护功能。我们的研究表明，标记的巨噬细胞衍生的SEV被神经-2a细胞，原发性星形细胞，并在脑脊髓内管理后。结果表明，更长的潜伏时间可降低SEV信号强度，这可归因于33、34培养中神经-2a细胞的SEV或细胞分裂的退化。虽然吞吐量低，但用于在脊髓中可视化标记的 SEV 的该协议可用于初始验证研究，在调查内传送的 SEV 的功能影响之前确认 SEV 吸收。正如我们在几个CNS细胞类型中观察到的通常类似的SEV吸收，吸收过程似乎是非选择性的。如果自发光是成像中的问题，则未标记的 SEV 可用作在组织和文化成像过程中否定 SEV 自动荧光的附加控项。虽然SEV的剂量和管理途径可以影响生物分布模式11，但该协议对于SEV吸收的定量分析并没有进行优化。正在采用几种不同的方法和各种成像策略来研究 SEV，这些方法正在不断改进和优化，以便对SEV2进行体内跟踪。
此协议仅是确认 SEV 吸收的一种方法。与所有协议一样，使用多模式方法进行交叉验证也是有益的。具体来说，通过调查生物分子货物转移到受体细胞和组织，可以确认SEV的吸收。如果研究者知道交付的 SEV 的 miRNA 组成，则确认 SEV 转移的另一种方法是检查受体细胞中的 miRNA 变化或确定转移的 miRNA 目标基因的表达水平变化。PBS 处理过的样品可用于此方法的控制。总的来说，这些结果支持了巨噬细胞衍生的SEV被CNS细胞 在体外 和 体内占据的概念。此协议可用于研究 SEV 在脊柱疾病、疼痛和炎症中的作用，并确定 SEV 是否可以开发为用于传递治疗性小分子、RNA 和蛋白质的细胞工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突可以披露。
Acknowledgments
这项研究得到了NIH NINDS R01NS102836和宾夕法尼亚州卫生部联邦普遍研究增强（CURE）授予西娜·阿吉特的资助。我们感谢布拉德利·纳什博士对手稿的批判性解读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
