Summary
Vi beskriver ett protokoll för att märka macrophage-härledda små extracellulära vesiklar med PKH färgämnen och observera deras upptag in vitro och i ryggmärgen efter intratekal leverans.
Abstract
Små extracellulära blåsor (sEVs) är 50-150 nm blåsor utsöndras av alla celler och finns i kroppsvätskor. sEVs överför biomolekyler som RNA, proteiner och lipider från givare till acceptorceller, vilket gör dem till viktiga signalmedlare mellan celler. I centrala nervsystemet (CNS) kan sEVs förmedla intercellulär signalering, inklusive neuroimmuna interaktioner. sEV-funktioner kan studeras genom att spåra användningen av märkta sEVs i mottagarceller både in vitro och in vivo. Detta dokument beskriver märkning av sEVs från konditionerade medier av RAW 264.7 makrofag celler med hjälp av en PKH membran färgämne. Det visar upptaget av olika koncentrationer av märkta sEVs vid flera tidpunkter av Neuro-2a celler och primära astrocyter in vitro. Också visas upptaget av sEVs levereras intratekalt i mus ryggmärg nervceller, astrocyter och microglia visualiseras av confocal mikroskopi. De representativa resultaten visar tidsberoende variation i upptaget av sEVs av olika celler, vilket kan bidra till att bekräfta framgångsrik sEVs leverans i ryggmärgen.
Introduction
Små extracellulära blåsor (sEVs) är nanosized, membran-härledda blåsor med ett storleksintervall på 50-150 nm. De kommer från multi-vesicular organ (MVBs) och frigörs från celler vid fusion av MVBs med plasmamembranet. SEVs innehåller miRNAs, mRNAs, proteiner och bioaktiva lipider, och dessa molekyler överförs mellan celler i form av cell-till-cell kommunikation. SEVs kan internaliseras av mottagarceller genom en mängd olika endocytiska vägar, och denna fångst av sEVs av mottagarceller förmedlas genom igenkänning av ytmolekyler på både EVs ochmålcellerna 1.
sEVs har fått intresse på grund av deras förmåga att utlösa molekylära och fenotypiska förändringar i acceptorceller, deras användbarhet som terapeutiskt medel och deras potential som bärare för lastmolekyler eller farmakologiska medel. På grund av deras lilla storlek kan avbildning och spårning av sEVs vara utmanande, särskilt för in vivo-studier och kliniska inställningar. Därför har många metoder utvecklats för att märka och avbilda sEVs för att hjälpa deras biodistribution och spårning in vitro och in vivo2.
Den vanligaste tekniken för att studera sEV biodistribution och mål cell interaktioner innebär att märka dem med fluorescerande färgämnenmolekyler 3,4,5,6,7. EVs var ursprungligen märkta med cellmembranfärger som ofta användes för att avbilda celler. Dessa fluorescerande färgämnen färgar i allmänhet lipid gallayer eller proteiner av intresse på sEVs. Flera lipofila färgämnen uppvisar en stark fluorescerande signal när de ingår i cytosolen, inklusive DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninjodid), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyaninperklorat) och DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyanin 4-klorobenzenesulfonatsalt)8,9,10,11.
Andra lipofila färgämnen, såsom PKH67 och PKH26, har en mycket fluorescerande polarhuvudgrupp och en lång alifatisk kolvätesvans som lätt intercalates i någon lipidstruktur och leder till långsiktig färgretention och stabil fluorescens12. PKH-färgämnen kan också märka EVs, vilket gör det möjligt att studera EV-egenskaper in vivo13. Många andra färgämnen har använts för att observera exosomer med fluorescensmikroskopi och flödescytometri, inklusive lipidmärkningsfärgämnen14 och cellgenomsläppliga färgämnen som karboxyfluoresceindiaktat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 och calcein acetoxymethyl (AM) ester17.
Studier av sEV-medierad crosstalk mellan olika celler i CNS har gett viktiga insikter om patogenesen vid neuroinflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar18. Till exempel kan sEVs från nervceller sprida beta-amyloidpeptider och fosforylerade tau-proteiner och hjälpa till med patogenesen vid Alzheimers sjukdom19. Dessutom innehåller EVs som härrör från erytrocyter stora mängder alfa-synuklein och kan korsa blod - hjärnbarriären och bidra till Parkinsons patologi20. SEVs förmåga att korsa fysiologiskahinder 21 och överföra sina biomolekyler till målceller gör dem till praktiska verktyg för att leverera terapeutiska läkemedel till CNS22.
Visualisera sEV upptag av otaliga CNS celler i ryggmärgen kommer att möjliggöra både mekanistiska studier och utvärdering av de terapeutiska fördelarna med exogent administrerade sEVs från olika cellulära källor. Detta dokument beskriver metoden att märka sEVs härrör från makrofager och avbilda deras upptag in vitro och in vivo i ländryggen ryggmärgen av nervceller, microglia och astrocyter att kvalitativt bekräfta sEV leverans genom visualisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla procedurer utfördes i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Institutional Animal Care & Use Committee vid Drexel University College of Medicine. Tidsbefriade CD-1 möss användes för astrocytisk kultur, och alla dammar mottogs 15 dagar efter impregnering. Tio-tolv veckor gamla C57BL/6 möss användes för in vivo upptag experiment.
1. Isolering av SEVs från RAW 264.7 makrofagceller
- Kultur RAW 264,7 celler i 75 cm2 flaskor i DMEM exosom-utarmat medium som innehåller 10% exosom-utarmat fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (penna-strep) för 24-48 h.
- Samla upp 300 ml konditionerat medium och centrifuger vid 300 × g i 10 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten och centrifugen vid 2 000 × g i 20 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till centrifugrör, centrifug i 35 min vid 12 000 × g vid 4 °C.
- Samla upp supernatanten och filtrera genom ett 0,22 μm sprutfilter.
- Överför till ultracentrifugrör och centrifuger i 80 min vid 110 000 × g vid 4 °C.
- Förvara supernatanten (exosom-utarmat medium), återanvänd pelleten i 2 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera i 1 timme vid 110 000 × g vid 4 °C.
- Återanvänd pelleten i 100 μL PBS för ytterligare karakterisering med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) eller i radioimmunoprecipitationsanalysbuffert (RIPA) för västra blotting.
2. Karakterisering av SEVs
- Nanopartikelspårningsanalys (NTA)
OBS: Storleksfördelningen och partikelnumret/koncentrationen av de renade sEVs från RAW 264,7-celler mättes av NTA.- Späd sEVs i filtrerad PBS för att få 20-60 vesiklar per synfält för optimal spårning.
- För in det utspädda provet i en flödescell med en sprutpump med konstant flödeshastighet.
- Ta 3-5 videor på 30 s vardera. Ställ in slutartid och förstärkning och fokusera manuellt kamerainställningarna för att maximalt antal blåsor ska vara synliga och kunna spåras och analyseras.
- För fram proverna mellan varje inspelning för att utföra replikerade mätningar. Optimera NTA-inställningarna efter förvärvet och håll inställningarna konstanta mellan exemplen.
- Analysera varje video med NTA-programvaran för att få den genomsnittliga storleken och koncentrationen av blåsorna.
- Utför alla NTA-mätningar med identiska systeminställningar för konsekvens.
- Västra fläcken
- Kvantifiera de totala proteinmängderna i sEVs, celllyater och exosomuterade medier med hjälp av ett proteintestkit enligt tillverkarens instruktioner.
- För celllyatberedning, odla RAW 264,7 celler i 75 cm2 flaskor tills 80-90% sammanflöde. Lossa cellerna med 0,25% trypsin i 10-15 min, neutralisera trypsin med odlingsmedia och pellet cellerna genom att snurra på 400 × g i 5 min. Återanvänd cellerna i färskt tillväxtmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och överför 1 × 106 celler till ett annat rör. Tvätta cellerna med PBS två gånger med samma centrifugeringsförhållanden som ovan och tillsätt 50 μL lysbuffert (RIPA-buffert med proteashämmarcocktail tillsatt) till cellpelleten från slutspinn.
- Virvel cellerna och håll dem på is i 20 min. Ställ blandningen på centrifugering vid 10 000 × g i 30 min vid 4 °C, samla upp supernatanten (dvs lysaten) i färska mikrocentrifugrör och håll den på −80 °C tills den används.
- Koncentrera 2 ml exosomutarmat medium till 100 μL med 3 kDa-cutoff centrifugalfilter innan du kvantifierar mängden protein. Blanda sEVs med lysbuffert i ett 1:1-förhållande, virvel i 30 s och inkubera på is i 15 minuter för att kvantifiera mängden protein.
- Blanda lika stora mängder protein (2 μg) av sEVs, RAW 264,7 celllyat och exosomuterade medier med reducerande provbuffert.
- Denaturera proverna vid 95 °C i 5 min, håll dem på is i 5 minuter och snurra i 2 minuter vid 10 000 × g. Ladda proverna på en 12% Tris-glycinproteingel och kör gelén på 125 V i 45 min.
- Överför proteinet till ett polyvinylidendfluoridmembran (PVDF) vid 25 V i 2 timmar.
- Efter överföringen, blockera PVDF-membranen med blockeringsbuffert (se materialförteckningen)i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera fläcken med primära antikroppar på en skakapparat över natten vid 4 °C.
OBS: Primära antikroppar som användes var anti-CD81 (1:1,000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransferas (ALG-2)-interagerande protein X (Alix) (1:1 000), anti-Calnexin (1:1,000) och anti-glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) (1:1,000). - Tvätta blots 3 x 15 min med 1x Tris-buffrad saltlösning, 0,1% Interpolering 20 (TBST) och inkubera vid rumstemperatur med get antimus IgG-pepparrot peroxidas (HRP)- eller åsna antikanin IgG-HRP-konjugerade sekundära antikroppar (1:10,000) i 1 h på skakapparaten.
- Tvätta blots 3 x 15 min med 1x TBST och detektera proteinerna med ett HRP-substrat.
- Analysera uppblåstheten genom förbättrad chemiluminescens med hjälp av en western blot-bild.
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Fixa sEVs genom att återanvända dem i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (PB); virvel i 2 x 15 s.
- Placera en droppe på 10 μL sEV-suspension på ren parafilm. Flyta det kolbelagda formvarnätet på droppen med sin belagda sida vänd mot fjädringen. Låt membranen absorbera i 20 minuter i torr miljö.
- Placera gallret (membransidan nedåt) på en droppe PB för att tvätta i 3 x 2 min.
- Överför gallret till 50 μL 1% glutaraldehyd i 5 min.
- Tvätta gallret med 100 μL destillerat vatten i 8 x 2 min.
- Kontrastera provet genom att placera gallret på en droppe av 1% uranylacetat i 2 min.
- Bädda in provet med 50 μL uranylacetat på 0,2 % med 2 % metylcellulosalösning i 10 minuter på en parafilmtäckt isrätt.
- Använd slingor i rostfritt stål för att hålla gallret och ta bort överflödig vätska med filterpapper.
- Lufttorka gallret i 10 minuter medan du fortfarande är på slingan.
- Observera under ett transmissionselektronmikroskop vid 80 kV.
3. Märkning av SEVs
- Späd 20 μg sEVs i 1 ml spädningsbuffert eller samma volym PBS i 1 ml spädningsbuffert för färgämneskontroll.
- Späd 3 μL PKH67- eller PKH26-färgämne i 1 ml spädningsbuffert och blanda genom pipetting.
- Tillsätt utspädda PKH-färgämnen till de utspädda sEVs och blanda genom pipetting. Inkubera i 5 minuter i mörker vid rumstemperatur. För en färgkontroll, blanda det utspädda färgämnet med utspädd PBS från steg 3.1.
- Tillsätt 2 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS till röret med färgämnet och sEV-blandningen och till färgningsröret för att absorbera överskottsfärgämne.
- Centrifug i 1 timme vid 110 000 × g vid 4 °C. Kassera supernatanten, återanvänd pelleten i 2 ml PBS och centrifugera i 1 timme vid 110 000 × g vid 4 °C. Upprepa tvätten med PBS och återanvänd de märkta sEVs eller färgkontrollen i en lika stor volym PBS.
- Kvantifiera mängden totalt protein med Bradford-metoden.
4. Upptag av SEVs av Neuro-2a celler
- Placera 18 mm täcken i en 12-brunnsplatta och platta 10 × 104 Neuro-2a-celler i varje brunn i totalt 1 ml komplett DMEM-medium som innehåller 10% FBS och 1% penna-strep.
- Ändra mediet till DMEM exosom-utarmat medium när cellkonfluensen är 80-90%. Tillsätt 1, 5 eller 10 μg märkta sEVs i varje brunn i 1, 4 och 24 timmar för dos- och tidsberoende upptag, eller tillsätt en lika stor mängd färgkontroll.
5. Primära astrocytiska kulturer
- Söv 4 postnatala valpar 4 dagar efter födseln genom att inducera hypotermi.
- Samla hjärnan i en 60 mm Petri-skål som innehåller iskall Hanks balanced salt solution (HBSS) kompletterad med 10 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES).
- Dissekera både närloberna och ta bort hjärnhinnorna. Hacka vävnaderna med ett steriliserat blad.
- Överför vävnaderna till ett koniskt rör på 15 ml innehållande papain/deoxyribonuclease I dissociationsbuffert och inkubera i 20 min vid 37 °C. Snurra var 5:e minut.
OBS: För 4 mus cortices aktiveras 9 ml 7,5 U/ml papain i HBSS vid 37 °C i minst 30 min, filtreras genom ett 0,22 μm sprutfilter och blandas med deoxyribonuclease I till en slutlig koncentration på 0, 1 mg/ml. - Aspirera supernaten och tillsätt 5 ml komplett DMEM för att inaktivera enzymaktiviteten. Triturera försiktigt för att skilja vävnaderna åt med en 5 ml glas serologisk pipett och en flampolerad Pasteur-pipett.
- För cellfjädringen genom en 40 μm cellsil och centrifugera cellerna vid 250 × g i 5 min vid 4 °C. Aspirera mediet och så cellerna i 10 ml komplett DMEM i en 75 cm2 kolv. Byt ut det övernaturliga mediet mot 15 ml färskt DMEM-medium 4 timmar efter plätering.
- Efter 14 dagars in vitroöverför du kolven till en orbital shaker för att lossa mikroglia och oligodendrocyter vid 320 varv/min i 6 timmar.
- Trypsinize de återstående astrocyterna med 5 ml av cell dissociation enzymet (Table of Materials) i 10 min vid 37 °C. Tillsätt 5 ml komplett DMEM för att inaktivera den enzymatiska verkan och pelletera cellerna vid 250 × g i 5 min vid 4 °C.
- Återanvänd cellerna i fullständig DMEM. Frö 5 × 104 celler på 12 mm #1,5 täcklips i en 24-brunnsplatta.
6. Användning av SEVs av astrocyter
- När astrocyter når 80-90% sammanflöde, ändra mediet till DMEM exosom-utarmat medium.
- Tillsätt 1 μg omärkta, märkta sEVs, en lika stor volym färgkontroll eller PBS till cellerna. Använd cellerna för färgning 1 timme och 24 timmar efter sEV-behandling.
7. Immunofluorescens
- Skölj cellerna med PBS 3x och fixera dem med 4% PFA i PB i 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta de fasta cellerna 3 x 5 min med PB och permeabilisera dem med 0,1% Triton X-100 i PB i 10-15 min och tvätta med PB 3 x 5 min.
- Blockera cellerna med 5% normalt getserum (NGS) i PB i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera cellerna med primära antikroppar: mikrotubule-associerat protein 2 (MAP2A, 1:500) för neuro-2a-celler eller glialt fibrillärt surt protein (GFAP, 1:500) för primära astrocyter i färska 5% NGS/PB över natten vid 4 °C med mild skakning.
- Tvätta 3 x 10 min med PB och tillsätt fluorforkonjugerade sekundära antikroppar (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; eller Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) i 5% NGS och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur på en rocker.
- Tvätta 3 x 10 min med PB och inkubera med 1 μg/ml kärnfläck 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 10 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna igen 3x med PB.
- Montera täckglasen på #1 bilder med ett antifade monteringsmedium. Låt dem torka över natten i mörkret och förvara de beredda glasrutschbanorna vid 4 °C tills de avbildningar på ett konfokalt mikroskop.
8. In vivo-användning av SEVs
- Utför intratekal injektion på 5 μg omärkta eller märkta sEVs återanvänds i 10 μL PBS, eller lika volym (10 μL) färgämneskontroll (enligt avsnitt 3) i C57BL/6 möss.
- Efter 6 och 18 h efter injektion av sEVs, djupt bedöva möss genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg kroppsvikt av ketamin och 10 mg/kg kroppsvikt av xylazin.
- Utför intrakardiell perfusion av möss med 0,9% saltlösning för att spola ut blod, följt av nygjord iskall 4% PFA/ PB.
- Dissekera ryggmärgen och fixera i 4% PFA/PB vid 4 °C i 24 timmar. Cryoprotect vävnaderna i 30% sackaros i PB vid 4 °C i 24 timmar eller tills vävnaderna sjunker. Förvara vävnaderna vid 4 °C tills immunohistokemin.
9. Immunohistokemi
- Bädda in L4-L5 ryggmärg i O.C.T förening. Frys på torris tills den är helt stelnad.
- Dela vävnaderna vid 30 μm (tvärsnitt för ryggmärgen) med en kryostat och samla sektionerna i en 24-brunnsplatta som innehåller PB. Tvätta sektionerna 3 x 5 min med 0,3% Triton i PB.
- Blockera icke-specifika bindningsställen med 5% NGS i 0,3% Triton/PB i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Utspädda primära antikroppar: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 för mikroglia (1:2,000) med 5% NGS i 0,3% Triton/ PB och inkubera sektionerna över natten vid 4 °C på en skakapparat.
- Tvätta sektionerna 3 x 5 min med 0,3% Triton/PB och tillsätt sekundära antikroppar (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 eller Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) i 5% NGS/PB i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 x 5 min med PB och inkubera sektionerna i 1 μg/ml DAPI i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sektionerna 3 x 5 min med PB.
- Montera sektionerna på en ren självhäftandediabild (Table of Materials)med en fin pensel under ett lätt mikroskop.
- Blöt täcket med monteringsmedium. Härda över natten i mörkret vid rumstemperatur.
- Bild under ett konfokalt mikroskop med respektive lasrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolering av SEVs från RAW 264.7 konditionerade medier via centrifugation användes NTA för att bestämma koncentrationen och storleksfördelningen av de renade sEVs. Den genomsnittliga medelstorleken på RAW 264,7-härledda sEVs var 140 nm, och topppartikelstorleken var 121,8 nm, vilket bekräftar att de flesta detekterbara partiklarna i ljusspridningsmätningen föll inom storleksområdet för exosomer eller sEVs vid 50-150 nm (Figur 1A). Som föreslås i den minimala informationen för studier av extracellulära blåsor 2018 (MISEV2018)23, analyserade vi en uppsättning proteiner som bör vara närvarande eller uteslutna från distinkta EV-populationer. Western blotting av sEVs, cell lysate och exo-utarmade medier visade att sEV-härledda proteinprover innehöll sEV markörproteinerna Alix, CD81 och GAPDH. Cell lysate fraktion berikades med endoplasmic reticulum bosatt protein, calnexin, som var frånvarande i sEVs. Calnexin fungerade således som en negativ markör för cellulär kontaminering(figur 1B).
Vi utförde därefter dos-svar och tidskurs experiment för sEV upptag in vitro. Neuro-2a celler inkuberades med en enda 1 μg dos av PKH67-märkta sEVs för 1, 4 och 24 h, varefter upptaget av olika koncentrationer av SEVs (1, 5 och 10 μg) undersöktes vid 1 h. Resultaten av NTA indikerade att 1 μg protein i genomsnitt var lika med ~1 x 109 partiklar. Parallellt testades pbs, omärkta sEVs och färgämne-ensam kontroller också. Vi observerade att upptaget av sEVs inträffade vid 1 timme (figur 2A) och för 1, 5 och 10 μg sEVs(figur 2B). Fluorescens kunde detekteras vid 4 timmar för 5 och 10 μg sEVs(figur 2C)efter inkubation. Därefter undersöktes användningen av PKH26-märkta sEVs av primära astrocyter(figur 3). Maximal fluorescens från sEV upptag i primära när astrocyter inträffade vid 24 h. Omärkta sEVs visade inte fluorescens, vilket visar att sEV autofluorescens inte väsentligt bidrar till falska positiva(kompletterande figur S1A).
Därefter injicerades märkta sEVs intratekalt i möss för att bedöma leverans och upptag av SEVs av olika celler i ryggmärgen med hjälp av immunohistokemi och confocal mikroskopi. Vi färgade för MAP2 som en neuronal markör, GFAP som en astrocytisk markör och IBA1 som en mikroglial markör. Nervceller (figur 4), astrocyter (figur 5) och mikrogliaceller (figur 6) tog alla upp PKH26-märkta sEVs, och maximal sEV fluorescens observerades vid 6 h efter injektion. Medan sEVs inte alltid colocalize med cellulära markörer, observerade vi inte någon differentiell upptag av CNS-celler. Intratekal injektion med 5 μg omärkt RAW 264,7 sEVs eller färgämneskontroll visade inte signifikant fluorescens (Kompletterande figur S1B). Fluorescerande signaler observerades i hjärnhinnorna, både 6 h och 18 timmar efter injektionen av sEVs(kompletterande figur S1C).
Figur 1: Karakterisering av renad RAW 264,7 sEVs. (A) Storlek och koncentration av sEVs bestämdes med NanoSight NS300. Partiklarna spårades och storleksanpassades baserat på brownsk rörelse och diffusionskoefficient. Storleksfördelningen för sEVs visas i nm. Koncentrationen av sEVs uttrycktes som partiklar/ml. B)Västerländsk fläck av proteiner som härrör från renade sEVs, celllyat och exosom-utarmat medium med hjälp av sEV-markörerna ALIX, GAPDH och CD81. Den endoplasmatiska reticulum protein markör, calnexin, fungerar som en kontroll för att övervaka cellulär kontaminering i sEV preparat. C)Transmissionselektronmikroskopi visade storleken och morfologin hos sEVs. Skalstång = 100 nm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; ALIX = Alfa-1,3/1,6-Mannosyltransferas (ALG-2)-interagerande protein X; GAPDH = glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas; CD81 = klustret differentiering 81. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Användning av märkta RAW 264,7 sEVs av Neuro-2a celler. (A) PKH67-märkta sEVs (1 μg) lades till de odlade Neuro-2a cellerna för 1, 4 eller 24 h. sEV upptag observerades hela tiden punkter med confocal mikroskopi. (B) PKH67-märkta SEVs (1, 5 eller 10 μg) lades till Neuro-2a celler för 1 h. (C) PKH67-märkta SEVs (5 eller 10 μg) lades till Neuro-2a celler för 4 h. SEV upptag observerades i alla dosering grupper med confocal mikroskopi. Negativa kontrollgrupper som behandlats med enbart PKH-färgämne visade inte sEV-färgning(kompletterande figur S1). Neuro-2a celler var immunostained med MAP2A (sonderade med Alexa Fluor 594, visas i rött), medan cellkärnor var färgade med DAPI (visas i blått) och sEVs med PKH67 (visas i grönt). Skalstång = 50 μm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; MAP2A = mikrotubule-associerat protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Upptag av PKH26-märkta RAW 264.7 sEVs med primära muskortikala astrocyter. En μg sEVs var märkt med PKH26 färgämne och läggs till det primära astrocyt kulturmediet. Upptag av SEVs observerades vid 1 och 24 h post-addition med hjälp av en confocal laser scanning mikroskop. Astrocyter var färgade med GFAP (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött), medan cellkärnor var motarbetade med DAPI (visas i blått), och sEVs var tidigare färgas med PKH26 (visas i grönt). Skala bommar för = 20 μm. PKH26 färgämne ensamt tjänat som som en negativ kontrollerar för sEV färgning. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; GFAP = glial fibrillary surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Upptag av RAW 264.7 sEVsin nervceller. PKH26-märkta sEVs injicerades intratekalt i möss; 6 och 18 h senare var mössen perfused med 4% PFA, och ryggmärgen isolerades och sektionerades vid 30 μm. Ryggmärg avsnitt var immunostained med en cell markör (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött) och DAPI kärnämne (visas i blått), medan sEVs var tidigare märkta med PKH26 (visas i grönt). Ryggmärg avsnitt var immunostained för MAP2A att visualisera nervceller (röd). Konfokal mikroskopi visar sEVs i MAP2A-positiva nervceller vid olika tidpunkter. Den negativa kontrollen, PKH26 färgämne-ensam grupp, visade inte sEV färgning. Skalstång = 20 μm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; PFA = paraformaldehyd; MAP2A = mikrotubule-associerat protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Användning av RAW 264.7 sEVs i astrocyter. PKH26-märkta sEVs injicerades intratekalt i möss; 6 och 18 h senare var mössen perfused med 4% PFA, och ryggmärgen isolerades och sektionerades vid 30 μm. Ryggmärg avsnitt var immunostained med en cell markör (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött) och DAPI kärnämne (visas i blått), medan sEVs var tidigare märkta med PKH26 (visas i grönt). Ryggmärg avsnitt var immunostained för GFAP att visualisera astrocyter (röd). Konfokal mikroskopi visar sEVs i GFAP-positiva astrocyter vid olika tidpunkter. Den negativa kontrollen, PKH26 färgämne-ensam grupp, visade inte sEV färgning. Skalstång = 20 μm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; PFA = paraformaldehyd; GFAP = glial fibrillary surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Användning av RAW 264,7 sEVs i mikroglia. PKH26-märkta sEVs injicerades intratekalt i möss; 6 och 18 h senare var mössen perfused med 4% PFA, och ryggmärgen isolerades och sektionerades vid 30 μm. Ryggmärg avsnitt var immunostained med en cell markör (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött) och DAPI kärnämne (visas i blått), medan sEVs var tidigare märkta med PKH26 (visas i grönt). Ryggmärg avsnitt var immunostained för IBA1 att visualisera microglia (röd). Konfokal mikroskopi visar sEVs i IBA1-positiva mikroglia vid olika tidpunkter. Den negativa kontrollen, PKH26 färgämne-ensam grupp, visade inte sEV färgning. Skalstång = 20 μm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; PFA = paraformaldehyd; IBA1 = joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur S1: Upptag av märkta RAW 264,7 sEVs med primära muskortikala astrocyter och i ryggmärgen. a)Kontroller för användning av PKH26-märkta RAW 264.7-sEVs med primära kortikala astrocyter med mus. En μg omärkta sEVs återanvänds i PBS eller en lika stor volym PBS lades till parallellt med odlingsmediet av astrocyter. Ingen fluorescens observerades vid 1 h för PBS och den omärkta kontrollen med hjälp av ett konfokal laser scanning mikroskop. Astrocyter var fläckade med GFAP (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött), medan atomkärnorna var motarbetade med DAPI (blå) och omärkta SEVs visualiserades under samma Alexa Fluor 546 kanal som PKH26-märkta sEVs. Skalstång = 50 μm. (B) Kontroller för upptag av PKH26-märkta RAW 264.7 sEVs med mus ryggmärg in vivo. Fem μg omärkta SEVs eller färgämne kontroll injicerades intratekalt i möss. Återigen observerades inte fluorescerande signaler för omärkta SEVs eller färgämne-ensam kontroll med hjälp av ett konfokal laser scanning mikroskop. Astrocyter var fläckade med GFAP (sonderade med Alexa Fluor 488, visas i rött), medan atomkärnor var motarbetade med DAPI (blå), och omärkta SEVs visualiserades under samma Alexa Fluor 546 kanal som PKH26-märkta sEVs. Skala bar = 50 μm. (C)Representativa bilder avslöjar förekomsten av RAW 264.7 sEVs i mus spinal meninges 6 h och 18 h efter intratekal leverans. Fem μg sEVs var märkta med PKH26 färgämne (visas i grönt), och kärnorna var motarbetade med DAPI (visas i blått). Asterisker indikerar den främre spinal gatan. Skalstång = 50 μm. Förkortningar: sEVs = små extracellulära blåsor; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. GFAP = glial fibrillary surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visade vi märkning av sEVs med PKH färgämnen och visualisering av deras upptag i ryggmärgen. PKH lipofila fluorescerande färgämnen används ofta för att märka celler efter flödescytometri och fluorescerande mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grund av deras relativt långa halveringstid och låga cytotoxicitet kan PKH-färgämnen användas för ett brett spektrum av in vivo- och in vitro-cellspårningsstudier 26,27. Även om utmärkt membranretention och biokemisk stabilitet är fördelaktiga, kan intercalation av fluorescerande sonder med lipoproteinföroreningar renas med SEVs äventyra tolkningen av sEV internalisering och funktionella studier. Således är rening och märkning av sEVs kritiska steg i protokollet eftersom persistensen av färgämnen med föroreningar kan leda till feltolkning av in vivo-fördelningen 28. Införandet av kontroller är avgörande för att undvika falskt positiva fluorescenssignaler på grund av icke-specifik märkning av partiklar och den långa halveringstid för dessa färgämnen.
Aggregering och micellebildning av lipofila färgämnen kan också ge falska signaler. Vi tog itu med problemet med fritt eller obundet färgämne genom att inkludera en färgämnes-ensam kontroll och visualisera EV-upptaget vid tidigare tidpunkter. En viktig begränsning som rapporteras för PKH märkning är att många PKH26 nanopartiklar bildas under PKH26 färgmärkning av sEVs. Även om det inte ingår i detta protokoll rapporteras att PKH26 nanopartiklar kan avlägsnas med en sackarosgradient29. En annan studie utvärderade effekten av PKH-märkning på storleken på SEVs av NTA och rapporterade en ökning av storleken efter PKH-märkning30. Ändå fungerar PKH-färgämnen som en pragmatisk och värdefull spårare för att visa var sEVs har korsat. En annan begränsning av denna studie är att vi inte kvantifierade SEVs eftersom detta protokoll fokuserar på bekräftelse av cellulärt upptag efter intratekal leverans. Nya cyaninbaserade membransonder har utvecklats nyligen för mycket känslig fluorescensavbildning av sEVs utan att ändra storleken eller generera artefakter, såsom bildandet av PKH nanopartiklar31, och kommer utan tvekan att förbättra framtida märkningsstudier.
Även om makrofager spelar viktiga roller i neuroinflammation, utövar de också neuroprotektiva funktioner genom att leverera sin last via exosomer32. Våra studier visar att märkta makrofag-härledda sEVs tas upp av Neuro-2a celler, primära astrocyter, och i ländryggen ryggmärg efter intratekal administration. Resultaten indikerar att en längre inkubationstid kan leda till lägre sEV-signalintensitet, vilket kan hänföras till nedbrytningen av sEVs eller celldelning av Neuro-2a-celler ikultur 33,34. Även om låg genomströmning, detta protokoll för visualisering märkta sEVs i ryggmärgen kan användas för inledande validering studier som bekräftar sEV upptag innan du undersöker den funktionella effekten av sEVs levereras intratekalt. Som vi observerade generellt liknande sEV upptag i flera CNS celltyper, upptagsprocessen verkar vara icke-selektiv. Om autofluorescens är ett problem i bildbehandling, omärkta sEVs kan användas som en ytterligare kontroll för att negera sEV autofluorescens under bildframställning av vävnader och kulturer. Även om dosen och administreringsvägen för sEVs kan påverka mönstret för biodistribution11, är detta protokoll inte optimerat för kvantitativ analys av sEV-upptag. Flera olika tillvägagångssätt och olika bildstrategier används för att undersöka sEVs, och dessa förfinas kontinuerligt och optimeras för in vivo-spårning av sEVs2.
Detta protokoll är tänkt att vara bara en metod för att bekräfta sEV-upptaget. Som med alla protokoll kan kors validering med multimodala metoder vara fördelaktigt. Specifikt kan användningen av SEVs bekräftas genom att undersöka biomolekylär lastöverföring till mottagarceller och vävnader. Om prövaren känner till miRNA-sammansättningen av levererade sEVs, skulle ett alternativt tillvägagångssätt för att bekräfta sEV-överföring vara att kontrollera miRNA-förändringar i mottagarcellerna eller bestämma förändringarna i uttrycksnivåer för målgener för de överförda miRNAs. PBS-behandlade prover kan användas som en kontroll för denna metod. Sammantaget stöder dessa resultat konceptet att makrofag-härledda sEVs tas upp av CNS-celler in vitro och in vivo. Detta protokoll kan användas för att undersöka sEVs roll i spinal störningar, smärta och inflammation och för att avgöra om sEVs kan utvecklas som cellulära fordon för leverans av terapeutiska små molekyler, RNA, och proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från NIH NINDS R01NS102836 och Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) som tilldelats Seena K. Ajit. Vi tackar dr Bradley Nash för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
