Summary
We beschrijven een protocol om van macrofagen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes te labelen met PKH-kleurstoffen en hun opname in vitro en in het ruggenmerg na intrathecale toediening te observeren.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn 50-150 nm blaasjes die door alle cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in lichaamsvloeistoffen. sEV's dragen biomoleculen zoals RNA, eiwitten en lipiden over van donor- naar acceptorcellen, waardoor ze belangrijke signaalmediatoren tussen cellen zijn. In het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen sEV's intercellulaire signalering bemiddelen, inclusief neuro-immuuninteracties. sEV-functies kunnen worden bestudeerd door de opname van gelabelde sEV's in ontvangende cellen zowel in vitro als in vivo tevolgen. Dit artikel beschrijft de etikettering van sEV's uit de geconditioneerde media van RAW 264.7 macrofaagcellen met behulp van een PKH-membraankleurstof. Het toont de opname van verschillende concentraties van gelabelde sEV's op meerdere tijdstippen door Neuro-2a-cellen en primaire astrocyten in vitro. Ook wordt de opname van sEV's getoond die intrathecaal worden afgeleverd in neuronen van het ruggenmerg van muizen, astrocyten en microglia gevisualiseerd door confocale microscopie. De representatieve resultaten tonen tijdsafhankelijke variatie in de opname van sEV's door verschillende cellen, wat kan helpen bij het bevestigen van succesvolle levering van sEV's in het ruggenmerg.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn nanosized, van membraan afgeleide blaasjes met een groottebereik van 50-150 nm. Ze zijn afkomstig van multi-vesiculaire lichamen (MVP's) en komen vrij uit cellen bij fusie van de MVP's met het plasmamembraan. sEV's bevatten miRNA's, mRNA's, eiwitten en bioactieve lipiden, en deze moleculen worden overgedragen tussen cellen in de vorm van cel-naar-cel communicatie. sEV's kunnen worden geïnternaliseerd door ontvangende cellen door een verscheidenheid aan endocytische routes, en deze vangst van sEV's door ontvangende cellen wordt gemedieerd door de herkenning van oppervlaktemoleculen op zowel EV's als de doelcellen1.
sEV's hebben belangstelling gekregen vanwege hun vermogen om moleculaire en fenotypische veranderingen in acceptorcellen te veroorzaken, hun nut als therapeutisch middel en hun potentieel als dragers voor vrachtmoleculen of farmacologische agentia. Vanwege hun kleine formaat kan het afbeelden en volgen van sEV's een uitdaging zijn, vooral voor in vivo studies en klinische omgevingen. Daarom zijn er veel methoden ontwikkeld om sEV's te labelen en inbeeld te brengen om hun biodistributie en tracking in vitro en in vivo te ondersteunen2.
De meest voorkomende techniek om sEV-biodistributie en doelcelinteracties te bestuderen, omvat het labelen ervan met fluorescerende kleurstofmoleculen3,4,5,6,7. EV's werden aanvankelijk gelabeld met celmembraankleurstoffen die vaak werden gebruikt om cellen in beeld te brengen. Deze fluorescerende kleurstoffen kleuren over het algemeen de lipide dubbellaag of eiwitten van belang op sEV's. Verschillende lipofiele kleurstoffen vertonen een sterk fluorescerend signaal wanneer ze in het cytosol worden opgenomen, waaronder DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninejodide), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanineperchloraat) en DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 4-chloorbenzenesulfonaatzout)8,9,10,11.
Andere lipofiele kleurstoffen, zoals PKH67 en PKH26, hebben een zeer fluorescerende polaire kopgroep en een lange alifatische koolwaterstofstaart die gemakkelijk intercaleert in elke lipidestructuur en leidt tot langdurige kleurstofretentie en stabiele fluorescentie12. PKH-kleurstoffen kunnen ook EV's labelen, waardoor ev-eigenschappen in vivo kunnen wordenbestudeerd13. Veel andere kleurstoffen zijn gebruikt om exosomen te observeren met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie, waaronder lipide-labelende kleurstoffen14 en celdoorlatende kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 en calceïne acetoxymethyl (AM) ester17.
Studies van sEV-gemedieerde kruisverwijzing tussen verschillende cellen in het CZS hebben belangrijke inzichten opgeleverd over de pathogenese van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten18. SEV's van neuronen kunnen bijvoorbeeld bèta-amyloïde peptiden en gefosforyleerde tau-eiwitten verspreiden en helpen bij de pathogenese van de ziekte van Alzheimer19. Bovendien bevatten EV's afgeleid van erytrocyten grote hoeveelheden alfa-synucleïne en kunnen ze de bloed-hersenbarrière passeren en bijdragen aan de pathologie van Parkinson20. Het vermogen van sEV's om fysiologische barrières21 te overschrijden en hun biomoleculen over te brengen naar doelcellen maakt ze handige hulpmiddelen om therapeutische geneesmiddelen aan het CZS te leveren22.
Het visualiseren van sEV-opname door talloze CZS-cellen in het ruggenmerg zal zowel mechanistische studies als de evaluatie van de therapeutische voordelen van exogene toegediende sEV's uit verschillende cellulaire bronnen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft de methodologie om sEV's afgeleid van macrofagen te labelen en hun opname in vitro en in vivo in het lumbale ruggenmerg door neuronen, microglia en astrocyten in beeld te brengen om de sEV-levering door visualisatie kwalitatief te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Institutional Animal Care & Use Committee van Drexel University College of Medicine. Getimed zwangere CD-1-muizen werden gebruikt voor astrocytische cultuur en alle dammen werden 15 dagen na impregnatie ontvangen. Tien-twaalf weken oude C57BL/6 muizen werden gebruikt voor in vivo opname-experimenten.
1. Isolatie van sEV's van RAW 264.7 macrofaagcellen
- Kweek RAW 264,7 cellen in 75 cm2 kolven in DMEM exosoom-uitgeput medium met 10% exosoom-uitgeput foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-strep) gedurende 24-48 uur.
- Verzamel 300 ml geconditioneerd medium en centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Vang het supernatant op en centrifugeer bij 2.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in centrifugebuizen, centrifugeer gedurende 35 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant en filter door een spuitfilter van 0,22 μm.
- Breng over op ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 80 minuten bij 110.000 × g bij 4 °C.
- Bewaar het supernatant (exosoom-uitgeput medium), resuspend de pellet in 2 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C.
- Resuspend de pellet in 100 μL PBS voor verdere karakterisering met behulp van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) of in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer voor western blotting.
2. Karakterisering van sEV's
- Nanodeeltjes tracking analyse (NTA)
OPMERKING: De grootteverdeling en het deeltjesaantal/de deeltjesaantal/concentratie van de gezuiverde sEV's uit RAW 264,7-cellen werden gemeten met NTA.- Verdun de sEV's in gefilterd PBS om 20-60 blaasjes per gezichtsveld te verkrijgen voor optimale tracking.
- Plaats het verdunde monster in een stroomcel met behulp van een spuitpomp met een constant debiet.
- Neem 3-5 video's van elk 30 s. Stel de sluitertijd en versterking in en stel de camera-instellingen handmatig scherp om het maximale aantal blaasjes zichtbaar te maken en te kunnen volgen en analyseren.
- Vervroeg de monsters tussen elke opname om replicatiemetingen uit te voeren. Optimaliseer de NTA-instellingen na acquisitie en houd de instellingen constant tussen de monsters.
- Analyseer elke video met behulp van de NTA-software om de gemiddelde grootte en concentratie van de blaasjes te verkrijgen.
- Voer alle NTA-metingen uit met identieke systeeminstellingen voor consistentie.
- Western blot
- Kwantificeer de totale eiwithoeveelheden in sEV's, cellysaten en exosoomarme media met behulp van een eiwittestkit volgens de instructies van de fabrikant.
- Kweek voor het cellysaatpreparaat de RAW 264,7 cellen in2 kolven van 75 cm tot 80-90% confluent. Maak de cellen los met 0,25% trypsine gedurende 10-15 minuten, neutraliseer de trypsine met kweekmedia en pellet de cellen door gedurende 5 minuten met 400 × g te draaien. Resuspend de cellen in vers groeimedium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en breng 1 × 106 cellen over naar een andere buis. Was de cellen tweemaal met PBS met dezelfde centrifugatiecondities als hierboven en voeg 50 μL lysisbuffer (RIPA-buffer met proteaseremmercocktail toegevoegd) toe aan de celkorrel vanaf de laatste spin.
- Vortex de cellen en houd ze 20 minuten op ijs. Laat het mengsel centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant (d.w.z. het lysaat) in verse microcentrifugebuizen en houd het op −80 °C tot gebruik.
- Concentreer 2 ml exosoomarme media tot 100 μL met behulp van 3 kDa-cutoff centrifugaalfilters voordat u de hoeveelheid eiwit kwantificeert. Meng de sEV's met lysisbuffer in een verhouding van 1:1, vortex gedurende 30 s en incubeer gedurende 15 minuten op ijs om de hoeveelheid eiwit te kwantificeren.
- Meng gelijke hoeveelheden eiwit (2 μg) van de sEV's, RAW 264.7-cellysaat en exosoomarme media met een afnemende monsterbuffer.
- Denatureer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C, houd ze 5 minuten op ijs en draai gedurende 2 minuten bij 10.000 × g. Laad de monsters op een 12% Tris-glycine eiwitgel en loop de gel gedurende 45 minuten op 125 V.
- Breng het eiwit over op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij 25 V gedurende 2 uur.
- Na de overdracht blokkeert u de PVDF-membranen met blokkeerbuffer (zie de tabel met materialen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de vlek met primaire antilichamen op een shaker gedurende een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Primaire antilichamen die werden gebruikt waren anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-interagerend eiwit X (Alix) (1:1.000), anti-calnexine (1:1.000) en anti-glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) (1:1.000). - Was de vlekken 3 x 15 min met 1x Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20 (TBST) en incubeer bij kamertemperatuur met geiten-anti-muis IgG-mierikswortelperoxidase (HRP)- of ezel anti-konijn IgG-HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:10.000) gedurende 1 uur op de shaker.
- Was de vlekken 3 x 15 min met 1x TBST en detecteer de eiwitten met behulp van een HRP-substraat.
- Analyseer de vlekken door verbeterde chemiluminescentie met behulp van een western blot imager.
- Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
- Fixeer sEV's door ze te resuspenderen in 2% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB); vortex voor 2 x 15 s.
- Plaats een druppel van 10 μL sEV-suspensie op schone parafilm. Drijf het met koolstof beklede formvar-raster op de druppel met hun gecoate kant naar de ophanging gericht. Laat de membranen 20 min intrekken in een droge omgeving.
- Plaats de roosters (membraan met de zijkant naar beneden) op een druppel PB om 3 x 2 minuten te wassen.
- Breng de roosters gedurende 5 min over in 50 μL 1% glutaaraldehyde.
- Was de roosters met 100 μL gedestilleerd water gedurende 8 x 2 min.
- Contrasteer het monster door de roosters gedurende 2 minuten op een druppel van 1% uranylacetaat te plaatsen.
- Sluit het monster met 50 μL 0,2% uranylacetaat met 2% methylcellulose-oplossing gedurende 10 minuten in op een met parafilm bedekte ijsschaal.
- Gebruik roestvrijstalen lussen om de roosters vast te houden en verwijder overtollig vocht met filterpapier.
- Droog het rooster gedurende 10 minuten aan de lucht terwijl het nog op de lus staat.
- Observeer onder een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.
3. Etikettering van sEV's
- Verdun 20 μg sEV's in 1 ml verdunningsbuffer of hetzelfde volume PBS in 1 ml verdunningsbuffer voor kleurstofbestrijding.
- Verdun 3 μL PKH67 of PKH26 kleurstof in 1 ml verdunningsbuffer en meng door pipetteren.
- Voeg verdunde PKH-kleurstof toe aan de verdunde sEV's en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Meng voor een kleurstofcontrole de verdunde kleurstof met verdund PBS uit stap 3.1.
- Voeg 2 ml 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS toe aan de buis met de kleurstof en het sEV-mengsel en aan de kleurstofcontrolebuis om overtollige kleurstof te absorberen.
- Centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg, resuspend de pellet in 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 1 uur bij 110.000 × g bij 4 °C. Herhaal de was met PBS en suspend de gelabelde sEV's of de kleurstofcontrole opnieuw in een gelijk volume PBS.
- Kwantificeer de hoeveelheid totaal eiwit volgens de Bradford-methode.
4. Opname van sEV's door Neuro-2a-cellen
- Plaats 18 mm coverslips in een 12-well plaat en plaat 10 × 104 Neuro-2a cellen in elke put in een totaal van 1 ml compleet DMEM-medium met 10% FBS en 1% pen-strep.
- Verander het medium in DMEM exosoom-uitgeput medium wanneer de celconfluentie 80-90% is. Voeg 1, 5 of 10 μg gelabelde sEV's toe in elke put gedurende 1, 4 en 24 uur voor dosis- en tijdsafhankelijke opname, of voeg een gelijk volume kleurstofcontrole toe.
5. Primaire astrocytische culturen
- Verdoving 4 postnatale pups 4 dagen na de geboorte door onderkoeling op te wekken.
- Verzamel de hersenen in een petrischaaltje van 60 mm met ijskoude Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES).
- Ontleed beide corticale kwabben en verwijder de hersenvliezen. Gehakt de weefsels met een gesteriliseerd mes.
- Breng de weefsels over in een conische buis van 15 ml met papaïne/desoxyribonuclease I-dissociatiebuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Wervel elke 5 min.
OPMERKING: Voor 4 muiscorticos wordt 9 ml van 7,5 E/ml papaïne in HBSS geactiveerd bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten, gefilterd door een spuitfilter van 0,22 μm en gemengd met desoxyribonuclease I tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml. - Aspirateer het supernatant en voeg 5 ml volledige DMEM toe om de enzymactiviteit te inactiveren. Triturateer zorgvuldig om de weefsels te dissociëren met een glazen serologische pipet van 5 ml en een vlamgepolijste Pasteur-pipet.
- Leid de celsuspensie door een celzeef van 40 μm en centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het medium en zaai de cellen in 10 ml complete DMEM in een kolf van 75 cm2. Vervang het supernatant medium 4 uur na het platen door 15 ml vers DMEM medium.
- Breng na 14 dagen in vitrode kolf over in een orbitale shaker om de microglia en oligodendrocyten bij 320 tpm gedurende 6 uur los te maken.
- Trypsiniseren van de resterende astrocyten met behulp van 5 ml van het celdissociatie-enzym (Tabel van materialen) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg 5 ml volledige DMEM toe om de enzymatische werking te inactiveren en pelleteer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Resuspend de cellen in volledige DMEM. Zaad 5 × 104 cellen op 12 mm #1.5 coverslips in een 24-well plaat.
6. Opname van sEV's door astrocyten
- Wanneer astrocyten 80-90% samenvloeiing bereiken, verander je het medium in DMEM exosoom-uitgeput medium.
- Voeg 1 μg ongelabelde, gelabelde sEV's, een gelijk volume kleurstofcontrole of PBS toe aan de cellen. Gebruik de cellen voor kleuring 1 uur en 24 uur na sEV-behandeling.
7. Immunofluorescentie
- Spoel de cellen met PBS 3x en bevestig ze met 4% PFA in PB gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de vaste cellen 3 x 5 min met PB en permeabiliseer ze met 0,1% Triton X-100 in PB gedurende 10-15 min en was met PB 3 x 5 min.
- Blokkeer de cellen met 5% normaal geitenserum (NGS) in PB gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubateer de cellen met primaire antilichamen: microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2A, 1:500) voor Neuro-2a cellen of glia fibrillair zuur eiwit (GFAP, 1:500) voor primaire astrocyten in verse 5% NGS/PB 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
- Was 3 x 10 minuten met PB en voeg fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; of Goat Anti-Mouse IgG H& L, Alexa Fluor 488) toe in 5% NGS en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rocker.
- Was 3 x 10 min met PB en incubeer met 1 μg/ml kernvlek 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Was de cellen opnieuw 3x met PB.
- Monteer de coverslips op #1 dia's met behulp van een antifade montagemedium. Laat ze een nacht in het donker drogen en bewaar de voorbereide glasglaasjes bij 4 °C totdat ze op een confocale microscoop worden ingebeeld.
8. In vivo opname van sEV's
- Voer intrathecale injectie uit van 5 μg niet-gelabelde of gelabelde sEV's die zijn geresuspendeerd in 10 μL PBS, of gelijk volume (10 μL) kleurstofcontrole (zoals bereid in sectie 3) in C57BL/6-muizen.
- Na 6 en 18 uur na injectie van sEV's, verdoven muizen diep door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine.
- Voer intracardiale perfusie van muizen uit met 0,9% zoutoplossing om bloed weg te spoelen, gevolgd door vers gemaakte ijskoude 4% PFA / PB.
- Ontleed het ruggenmerg en fixeer in 4% PFA/PB bij 4 °C gedurende 24 uur. Cryoprotect de weefsels in 30% sucrose in PB bij 4 °C gedurende 24 uur of totdat de weefsels zinken. Bewaar de weefsels bij 4 °C tot immunohistochemie.
9. Immunohistochemie
- Embed L4-L5 ruggenmerg in O.C.T verbinding. Bevries op droogijs tot het volledig gestold is.
- Sectie van de weefsels op 30 μm (dwarsdoorsnede voor het ruggenmerg) met behulp van een cryostaat en verzamel de secties in een 24-putplaat met PB. Was de secties 3 x 5 min met 0,3% Triton in PB.
- Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 5% NGS in 0,3% Triton/PB gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun primaire antilichamen: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 voor microglia (1:2.000) met 5% NGS in 0,3% Triton/PB, en incubeer de secties 's nachts bij 4 °C op een shaker.
- Was de secties 3 x 5 min met 0,3% Triton/PB en voeg secundaire antilichamen (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 of Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) toe in 5% NGS/PB gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3 x 5 min met PB en incubeer de secties in 1 μg/ml DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de secties 3 x 5 min met PB.
- Monteer de secties op een schone zelfklevende dia(Table of Materials)met een fijne verfkwast onder een lichtmicroscoop.
- Maak de afdekplaat nat met het bevestigingsmedium. Laat een nacht in het donker uitharden bij kamertemperatuur.
- Beeld onder een confocale microscoop met de respectievelijke lasers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de isolatie van sEV's van RAW 264.7 geconditioneerde media via centrifugatie, werd NTA gebruikt om de concentratie en grootteverdeling van de gezuiverde sEV's te bepalen. De gemiddelde gemiddelde grootte van RAW 264,7-afgeleide sEV's was 140 nm en de piekdeeltjesgrootte was 121,8 nm, wat bevestigt dat de meeste detecteerbare deeltjes in de lichtverstrooiingsmeting binnen het groottebereik van exosomen of sEV's vielen bij 50-150 nm (Figuur 1A). Zoals gesuggereerd in de minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes 2018 (MISEV2018)23, analyseerden we een reeks eiwitten die aanwezig of uitgesloten zouden moeten zijn van verschillende EV-populaties. Western blotting van sEV's, cellysaat en exo-uitgeputte media toonde aan dat sEV-afgeleide eiwitmonsters de sEV-markereiwitten Alix, CD81 en GAPDH bevatten. De cellysaatfractie werd verrijkt met het endoplasmatisch reticulum-residente eiwit, calnexine, dat afwezig was in de sEV's. Calnexine diende dus als een negatieve marker voor cellulaire besmetting(figuur 1B).
Vervolgens voerden we dosis-respons- en tijdsverloopexperimenten uit voor sEV-opname in vitro. Neuro-2a-cellen werden geïncubeerd met een enkele dosis van 1 μg PKH67-gelabelde sEV's gedurende 1, 4 en 24 uur, waarna de opname van verschillende concentraties sEV's (1, 5 en 10 μg) na 1 uur werd onderzocht. De resultaten van de NTA gaven aan dat gemiddeld 1 μg eiwit gelijk was aan ~1 x 109 deeltjes. Tegelijkertijd werden ook PBS, ongelabelde sEV's en dye-alone controles getest. We zagen dat de opname van sEV's plaatsvond bij 1 uur (figuur 2A) en voor de sEV's van 1, 5 en 10 μg (figuur 2B). Fluorescentie kon worden gedetecteerd na 4 uur voor 5 en 10 μg sEV's (figuur 2C) na incubatie. Vervolgens werd de opname van PKH26-gelabelde sEV's door primaire astrocyten onderzocht(figuur 3). Maximale fluorescentie van sEV-opname in primaire corticale astrocyten vond plaats na 24 uur. Ongelabelde sEV's vertoonden geen fluorescentie, wat aantoont dat sEV-autofluorescentie niet significant bijdraagt aan valse positieven(aanvullende figuur S1A).
Vervolgens werden gelabelde sEV's intrathecaal geïnjecteerd in muizen om de afgifte en opname van sEV's door verschillende cellen in het ruggenmerg te beoordelen met behulp van immunohistochemie en confocale microscopie. We kleurden voor MAP2 als een neuronale marker, GFAP als een astrocytische marker en IBA1 als een microgliale marker. Neuronen(figuur 4),astrocyten(figuur 5)en microgliale cellen(figuur 6)namen allemaal PKH26-gelabelde sEV's in gebruik en maximale sEV-fluorescentie werd waargenomen 6 uur na injectie. Hoewel de sEV's niet altijd colokaal waren met de cellulaire markers, hebben we geen differentiële opname door CZS-cellen waargenomen. Intrathecale injectie met 5 μg ongelabelde RAW 264.7 sEV's of kleurstofcontrole vertoonde geen significante fluorescentie(aanvullende figuur S1B). Fluorescerende signalen werden waargenomen in de hersenvliezen, zowel 6 uur als 18 uur na de injectie van sEV's (aanvullende figuur S1C).
Figuur 1: Karakterisering van gezuiverde RAW 264.7 sEV's. (A) Grootte en concentratie van sEV's werden bepaald met behulp van NanoSight NS300. De deeltjes werden gevolgd en gedimensioneerd op basis van de Brownse beweging en diffusiecoëfficiënt. De grootteverdeling van sEV's wordt weergegeven in nm. De concentratie van sEV's werd uitgedrukt als deeltjes/ml. B)Western blot van eiwitten afgeleid van gezuiverde sEV's, cellysaat en exosoom-uitgeputte media met behulp van sEV-markers ALIX, GAPDH en CD81. De endoplasmatische reticulum-eiwitmarker, calnexine, dient als een controle om cellulaire besmetting in sEV-preparaten te controleren. (C) Transmissie-elektronenmicroscopie toonde de grootte en morfologie van sEV's aan. Schaalbalk = 100 nm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; ALIX = Alfa-1,3/1,6-Mannosyltransferase (ALG-2)-interagerend eiwit X; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase; CD81 = cluster van differentiatie 81. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Opname van gelabelde RAW 264.7 sEV's door Neuro-2a cellen. (A)PKH67-gelabelde sEV's (1 μg) werden toegevoegd aan de gekweekte Neuro-2a-cellen voor 1, 4 of 24 uur. sEV-opname werd op alle tijdstippen waargenomen met confocale microscopie. (B)PKH67-gelabelde sEV's (1, 5 of 10 μg) werden toegevoegd aan Neuro-2a-cellen gedurende 1 uur. (C) PKH67-gelabelde sEV's (5 of 10 μg) werden toegevoegd aan Neuro-2a-cellen gedurende 4 uur. sEV-opname werd waargenomen in alle doseringsgroepen met confocale microscopie. Negatieve controlegroepen behandeld met PKH-kleurstof alleen vertoonden geen sEV-kleuring(aanvullende figuur S1). Neuro-2a-cellen werden immunos gekleurd met MAP2A (gesondeerd met Alexa Fluor 594, weergegeven in rood), terwijl celkernen werden gekleurd met DAPI (weergegeven in blauw) en SEV's met PKH67 (weergegeven in groen). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; MAP2A = microtubule-geassocieerd eiwit 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Opname van PKH26-gelabelde RAW 264.7 sEV's door primaire corticale astrocyten van muizen. Eén μg sEV's werd gelabeld met PKH26-kleurstof en toegevoegd aan het primaire astrocytencultuurmedium. Opname van sEV's werd waargenomen na 1 en 24 uur na toevoeging met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Astrocyten werden gekleurd met GFAP (onderzocht met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood), terwijl celkernen werden bevlekt met DAPI (weergegeven in blauw) en sEV's eerder werden gekleurd met PKH26 (weergegeven in groen). Schaalbalk = 20 μm. PKH26-kleurstof alleen diende als een negatieve controle voor sEV-kleuring. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Opname van RAW 264.7 sEVSin neuronen. PKH26-gelabelde sEV's werden intrathecaal geïnjecteerd bij muizen; 6 en 18 uur later werden de muizen doordrenkt met 4% PFA en werd het ruggenmerg geïsoleerd en gesegmenteerd op 30 μm. Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd met een celmarker (gesondeerd met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood) en DAPI-nucleaire counterstain (weergegeven in blauw), terwijl sEV's eerder werden gelabeld met PKH26 (weergegeven in groen). Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd voor MAP2A om de neuronen (rood) te visualiseren. Confocale microscopie toont sEV's in MAP2A-positieve neuronen op verschillende tijdstippen. De negatieve controle, PKH26 dye-alone groep, vertoonde geen sEV-kleuring. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; PFA = paraformaldehyde; MAP2A = microtubule-geassocieerd eiwit 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Opname van RAW 264.7 sEV's in astrocyten. PKH26-gelabelde sEV's werden intrathecaal geïnjecteerd bij muizen; 6 en 18 uur later werden de muizen doordrenkt met 4% PFA en werd het ruggenmerg geïsoleerd en gesegmenteerd op 30 μm. Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd met een celmarker (gesondeerd met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood) en DAPI-nucleaire counterstain (weergegeven in blauw), terwijl sEV's eerder werden gelabeld met PKH26 (weergegeven in groen). Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd voor GFAP om de astrocyten (rood) te visualiseren. Confocale microscopie toont sEV's in GFAP-positieve astrocyten op verschillende tijdstippen. De negatieve controle, PKH26 dye-alone groep, vertoonde geen sEV-kleuring. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; PFA = paraformaldehyde; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Opname van RAW 264.7 sEV's in microglia. PKH26-gelabelde sEV's werden intrathecaal geïnjecteerd bij muizen; 6 en 18 uur later werden de muizen doordrenkt met 4% PFA en werd het ruggenmerg geïsoleerd en gesegmenteerd op 30 μm. Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd met een celmarker (gesondeerd met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood) en DAPI-nucleaire counterstain (weergegeven in blauw), terwijl sEV's eerder werden gelabeld met PKH26 (weergegeven in groen). Ruggenmergsecties werden immunos gekleurd voor IBA1 om de microglia (rood) te visualiseren. Confocale microscopie toont sEV's in IBA1-positieve microglia op verschillende tijdstippen. De negatieve controle, PKH26 dye-alone groep, vertoonde geen sEV-kleuring. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; PFA = paraformaldehyde; IBA1 = geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Opname van gelabelde RAW 264.7 sEV's door primaire corticale astrocyten van muizen en in het ruggenmerg. (A) Controles voor de opname van PKH26-gelabelde RAW 264.7 sEV's door primaire corticale astrocyten van muizen. Eén μg niet-gelabelde sEV's geresuspendeerd in PBS of een gelijk volume PBS werd parallel aan het kweekmedium van astrocyten toegevoegd. Er werd geen fluorescentie waargenomen na 1 uur voor PBS en de niet-gelabelde controle met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Astrocyten werden gekleurd met GFAP (onderzocht met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood), terwijl de kernen werden bevlekt met DAPI (blauw) en ongelabelde sEV's werden gevisualiseerd onder hetzelfde Alexa Fluor 546-kanaal als PKH26-gelabelde sEV's. Schaalbalk = 50 μm. (B) Controles voor de opname van PKH26-gelabelde RAW 264.7 sEV's door het ruggenmerg van de muis in vivo. Vijf μg ongelabelde sEV's of kleurstofcontrole werden intrathecaal geïnjecteerd bij muizen. Nogmaals, fluorescerende signalen werden niet waargenomen voor niet-gelabelde sEV's of alleen-kleurstofcontrole met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Astrocyten werden gekleurd met GFAP (onderzocht met Alexa Fluor 488, weergegeven in rood), terwijl kernen werden bevlekt met DAPI (blauw) en ongelabelde sEV's werden gevisualiseerd onder hetzelfde Alexa Fluor 546-kanaal als PKH26-gelabelde sEV's. Schaalbalk = 50 μm. (C)Representatieve beelden onthullen de aanwezigheid van RAW 264,7 sEV's in de ruggenmergvliezen van muizen 6 uur en 18 uur na intrathecale toediening. Vijf μg sEV's werden gelabeld met PKH26-kleurstof (weergegeven in groen) en de kernen werden tegengekleurd met DAPI (weergegeven in blauw). Sterretjes geven de voorste spinale slagader aan. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: sEV's = kleine extracellulaire blaasjes; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol toonden we de etikettering van sEV's met PKH-kleurstoffen en de visualisatie van hun opname in het ruggenmerg. PKH lipofiele fluorescerende kleurstoffen worden veel gebruikt voor het labelen van cellen door flowcytometrie en fluorescerende microscopie3,5,6,12,24,25. Vanwege hun relatief lange halfwaardetijd en lage cytotoxiciteit kunnen PKH-kleurstoffen worden gebruikt voor een breed scala aan in vivo en in vitro celvolgstudies26,27. Hoewel uitstekende membraanretentie en biochemische stabiliteit voordelig zijn, kan de intercalatie van fluorescerende sondes met lipoproteïneverontreinigingen gezuiverd met sEV's de interpretatie van sEV-internalisatie en functionele studies in gevaar brengen. De zuivering en etikettering van sEV's zijn dus kritieke stappen in het protocol omdat de persistentie van de kleurstoffen met verontreinigingen kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de in vivo distributie28. De opname van controles is van cruciaal belang om vals-positieve fluorescentiesignalen te voorkomen als gevolg van niet-specifieke etikettering van deeltjes en de lange halfwaardetijd van deze kleurstoffen.
Aggregatie en micelvorming van lipofiele kleurstoffen kunnen ook valse signalen opleveren. We hebben het probleem van vrije of ongebonden kleurstof aangepakt door een kleurstof-alone controle op te nemen en de EV-opname op eerdere tijdstippen te visualiseren. Een belangrijke beperking die wordt gemeld voor PKH-etikettering is dat talrijke PKH26-nanodeeltjes worden gevormd tijdens PKH26-kleurstofetikettering van sEV's. Hoewel niet opgenomen in dit protocol, wordt gemeld dat PKH26 nanodeeltjes kunnen worden verwijderd door een sucrose gradiënt29. Een andere studie evalueerde het effect van PKH-etikettering op de grootte van sEV's door NTA en rapporteerde een toename in grootte na PKH-etikettering30. Niettemin dienen PKH-kleurstoffen als een pragmatische en waardevolle tracer om te laten zien waar de sEV's zijn gebleven. Een andere beperking van deze studie is dat we sEV's niet hebben gekwantificeerd, omdat dit protocol zich richt op de bevestiging van cellulaire opname na intrathecale levering. Nieuwe op cyanine gebaseerde membraansondes zijn onlangs ontwikkeld voor zeer gevoelige fluorescentiebeeldvorming van sEV's zonder de grootte te veranderen of artefacten te genereren, zoals de vorming van PKH-nanodeeltjes31, en zullen ongetwijfeld toekomstige etiketteringsstudies verbeteren.
Hoewel macrofagen een belangrijke rol spelen bij neuro-inflammatie, oefenen ze ook neuroprotectieve functies uit door hun lading via exosomen af te leveren32. Onze studies tonen aan dat gelabelde macrofaag-afgeleide sEV's worden opgenomen door Neuro-2a-cellen, primaire astrocyten en in het lumbale ruggenmerg na intrathecale toediening. De resultaten geven aan dat een langere incubatietijd kan leiden tot een lagere sEV-signaalintensiteit, wat kan worden toegeschreven aan de afbraak van sEV's of celdeling door Neuro-2a-cellen in cultuur33,34. Hoewel het een lage doorvoer heeft, kan dit protocol voor het visualiseren van gelabelde sEV's in het ruggenmerg worden gebruikt voor initiële validatiestudies die de opname van sEV bevestigen voordat de functionele impact van intrathecaal geleverde sEV's wordt onderzocht. Aangezien we over het algemeen een vergelijkbare sEV-opname in verschillende CZS-celtypen hebben waargenomen, lijkt het opnameproces niet-selectief te zijn. Als autofluorescentie een probleem is bij beeldvorming, kunnen niet-gelabelde sEV's worden gebruikt als een extra controle om sEV-autofluorescentie teniet te doen tijdens beeldvorming van weefsels en culturen. Hoewel de dosis en de toedieningsweg van sEV's het patroon van biodistributie11kunnen beïnvloeden, is dit protocol niet geoptimaliseerd voor de kwantitatieve analyse van de opname van sEV. Verschillende benaderingen en verschillende beeldvormingsstrategieën worden gebruikt om sEV's te onderzoeken, en deze worden voortdurend verfijnd en geoptimaliseerd voor in vivo tracking van sEV's2.
Dit protocol is bedoeld als slechts één benadering om de opname van sEV te bevestigen. Zoals met alle protocollen, kan kruisvalidatie met behulp van multimodale benaderingen nuttig zijn. In het bijzonder kan de opname van sEV's worden bevestigd door onderzoek te doen naar de overdracht van biomoleculaire lading naar ontvangende cellen en weefsels. Als de onderzoeker de miRNA-samenstelling van afgeleverde sEV's kent, zou een alternatieve benadering om sEV-overdracht te bevestigen zijn om te controleren op miRNA-veranderingen in de ontvangende cellen of de veranderingen in expressieniveaus van doelgenen voor de overgedragen miRNA's te bepalen. Pbs-behandelde monsters kunnen worden gebruikt als een controle voor deze aanpak. Over het algemeen ondersteunen deze resultaten het concept dat van macrofaag afgeleide sEV's in vitro en in vivodoor CZS-cellen worden opgenomen. Dit protocol kan worden gebruikt om de rol van sEV's bij spinale aandoeningen, pijn en ontsteking te onderzoeken en om te bepalen of sEV's kunnen worden ontwikkeld als cellulaire voertuigen voor de levering van therapeutische kleine moleculen, RNA en eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van NIH NINDS R01NS102836 en het Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) toegekend aan Seena K. Ajit. We bedanken Dr. Bradley Nash voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
