Summary
אנו מתארים פרוטוקול לתיוג שלטי מקרופאג' קטנים חוץ-תאיים עם צבעי PKH ומתבוננים בקליטתם במבחנה ובחוט השדרה לאחר הלידה התוך-תאית.
Abstract
שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלל 50-150 ננומטר המופרש על ידי כל התאים ונוכח בנוזלי גוף. sEVs מעבירים ביומולקולים כגון RNA, חלבונים ושומנים מתורם לתאים מקבלים, מה שהופך אותם למתווכים מרכזיים בין תאים. במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), sEVs יכול לתווך איתות בין תאי, כולל אינטראקציות נוירואימוניות. פונקציות sEV ניתן ללמוד על ידי מעקב אחר ספיגת sEVs מסומן בתאי הנמען הן במבחנה והן ב- vivo. מאמר זה מתאר את התיוג של sEVs מהמדיה המותנית של תאי מקרופאגים RAW 264.7 באמצעות צבע קרום PKH. זה מראה את ספיגת ריכוזים שונים של sEVs מסומן בנקודות זמן מרובות על ידי תאי Neuro-2a אסטרוציטים ראשוניים במבחנה. כמו כן מוצגת ספיגת SEVs המועברת באופן תוך-רחמי בנוירונים של חוט השדרה של העכבר, אסטרוציטים ומיקרוגליה המודגמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התוצאות הייצוגיות מדגימות שונות תלוית זמן בספיגת ה- SEVs על ידי תאים שונים, אשר יכול לעזור לאשר מסירת SEVs מוצלחת לחוט השדרה.
Introduction
שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלטי ננו-ממברנה שמקורם בממברנה עם טווח גודל של 50-150 ננומטר. מקורם בגופים רב-דרכים (MVBs) ומשוחררים מתאים עם היתוך ה-MVBs עם קרום הפלזמה. sEVs מכילים miRNAs, mRNAs, חלבונים, שומנים ביואקטיביים, ומולקולות אלה מועברות בין תאים בצורה של תקשורת בין תא לתא. sEVs יכול להיות מופנמ על ידי תאי הנמען על ידי מגוון של מסלולים אנדוציטיים, ו לכידה זו של sEVs על ידי תאי הנמען מתווכת על ידי זיהוי של מולקולות פני השטח הן על כלי עבודה והן על תאי היעד1.
sEVs צברו עניין בשל יכולתם לעורר שינויים מולקולריים ופנוטיפיים בתאים המקובלים, התועלת שלהם כסוכן טיפולי, ואת הפוטנציאל שלהם כמו נשאים עבור מולקולות מטען או סוכנים פרמקולוגיים. בשל גודלם הקטן, ההדמיה והמעקב אחר SEVs יכולים להיות מאתגרים, במיוחד עבור מחקרי vivo והגדרות קליניות. לכן, פותחו שיטות רבות לתיוג ותמונה sEVs כדי לסייע biodistribution ומעקב במבחנה ו in vivo2.
הטכניקה הנפוצה ביותר לחקר ייחוס ביולוגי של sEV ואינטראקציות בין תאי יעד כוללת תיוג אותם עם מולקולות צבע פלואורסצנטי3,4,5,6,7. EVs סומנו בתחילה עם צבעי קרום התא ששימשו בדרך כלל לתאי תמונה. צבעים פלואורסצנטיים אלה מכתימים בדרך כלל את דו-שכבתי השומנים או חלבונים מעניינים על SEVs. מספר צבעים ליפופיליים מציגים אות פלואורסצנטי חזק כאשר הם משולבים בציטוסול, כולל DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine יוד), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate), ו- DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-כלורובצנסולפונט מלח)8,9,10,11.
צבעים ליפופיליים אחרים, כגון PKH67 ו- PKH26, יש קבוצת ראש קוטב פלואורסצנטית מאוד וזנב פחמימנים אליפטי ארוך כי בקלות intercalate לתוך כל מבנה שומנים ומוביל שימור צבע לטווח ארוך פלואורסצנטיותיציבה 12. צבעי PKH יכולים גם לתייג EVs, המאפשר את המחקר של תכונות EV ב vivo13. צבעים רבים אחרים שימשו לצפייה אקסוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, כולל צבעי תיוג שומנים14 וצבעים חדירים לתא כגון carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE)15,16 ו קלצ'ין אצטטוקסימתיל (AM) אסתר17.
מחקרים של sEV בתיווך צולב בין תאים שונים במערכת ן סיפקו תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות נוירו-דליקות ונוירודגנרטיביות18. לדוגמה, SEVs מתאי עצב יכולים להפיץ פפטידים בטא עמילואיד וחלבוני טאו זרחן ולסייע בפתוגנזה של מחלתאלצהיימר 19. בנוסף, כלי עבודה אלקטרוניים הנגזרים אריתרוציטים מכילים כמויות גדולות של אלפא-סינוקלין ויכולים לחצות את מחסום הדם - מוח ולתרום לפתולוגיה של פרקינסון20. היכולת של SEVs לחצות מחסומים פיזיולוגיים21 ולהעביר biomolecules שלהם לתאי היעד עושה להם כלים נוחים כדי לספק תרופות טיפוליות ל- CNS22.
הדמיית ספיגת SEV על ידי תאי CNS רבים בחוט השדרה תאפשר הן מחקרים מכניים והן הערכת היתרונות הטיפוליים של SEV מנוהל אקסוגני ממקורות תאיים שונים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לתייג SEVs הנגזר מקרופאגים ולדמיין את ספיגתם במבחנה וב- vivo בחוט השדרה המותני על ידי נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים כדי לאשר באופן איכותי את מסירת SEV על ידי הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללה לרפואה של אוניברסיטת דרקסל. עכברי CD-1 בהריון מתוזמן שימשו לתרבות אסטרוציטית, וכל הסכרים התקבלו 15 ימים לאחר הספגה. עכברי C57BL/6 בני 10-12 שבועות שימשו לניסויי ספיגת ויוו.
1. בידוד של SEVs מתאי מקרופאגים RAW 264.7
- תרבות RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות במדיום DMEM exosome-מרוקן המכיל 10% סרום בקר עוברי exosome מרוקן (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטוצין (עט-סטרפטוקוקוס) עבור 24-48 שעות.
- לאסוף 300 מ"ל של בינוני מותנה צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
- לאסוף את supernatant וצנטריפוגה ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).
- מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות, צנטריפוגה למשך 35 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאסוף את supernatant ולסנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- העבר צינורות אולטרה צנטריפוגה וצנטריפוגה במשך 80 דקות ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F).
- אחסן את החומר-על (בינוני מרוקן אקסוזום), תגדיל מחדש את הכדור ב-2 מ"ל של תמיסת מלח עם פוספט אחד (PBS) וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-110,000 גרם × ב-4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend הכדור ב 100 μL של PBS לאפיון נוסף באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) או ב- radioimmunoprecipitation assay (RIPA) חוצץ עבור סופג מערבי.
2. אפיון של SEVs
- ניתוח מעקב חלקיקים (NTA)
הערה: התפלגות הגודל ומספר החלקיקים/ריכוז ה- sEV המטוהרים מתאי RAW 264.7 נמדדו על ידי NTA.- לדלל את ה- sEVs ב- PBS מסונן כדי להשיג 20-60 של שלל לכל שדה תצוגה למעקב מיטבי.
- הציגו את הדגימה המדוללת לתא זרימה באמצעות משאבת מזרק עם קצב זרימה קבוע.
- צ'3-5 סרטונים של 30 שניות כל אחד. הגדר את מהירות הצמצם ואת הרווח, ומקד באופן ידני את הגדרות המצלמה עבור המספר המרבי של שלל להיות גלוי ומסוגל להיות במעקב וניתוח.
- קדם את הדגימות בין כל הקלטה כדי לבצע מדידות שכפול. מטב את ההגדרות לאחר הרכישה של NTA ושמור על ההגדרות קבועות בין הדוגמאות.
- נתח כל סרטון באמצעות תוכנת NTA כדי להשיג את הגודל והריכוז הממוצעים של השלל.
- בצע את כל מדידות NTA עם הגדרות מערכת זהות לעקביות.
- כתם מערבי
- לכמת את כמויות החלבון הכוללות ב- sEV, בליזאטים של תאים ומדיה מרוקנת אקסוזום באמצעות ערכת חלבון לפי הוראות היצרן.
- להכנת ליסאט תא, תרבית RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות עד 80-90% confluent. לנתק את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 10-15 דקות, לנטרל את טריפסין עם מדיה תרבית, ולגלות את התאים על ידי ספינינג ב 400 × גרם במשך 5 דקות. resuspend התאים במדיום צמיחה טרי.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר 1 × 106 תאים לצינור אחר. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים באמצעות אותם תנאי צנטריפוגה כמו לעיל ולהוסיף 50 μL של מאגר תמוגה (חוצץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז הוסיף) לכדור התא מן הסיבוב הסופי.
- מערבולת את התאים ולשמור אותם על קרח במשך 20 דקות. נושא את התערובת לצנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), לאסוף את supernatant (כלומר, ליסאט) בצינורות microcentrifuge טרי, ולשמור על −80 °C (70 °F) עד השימוש.
- מרכז 2 מ"ל של מדיה מרוקנת אקסוזום ל 100 μL באמצעות 3 מסננים צנטריפוגליים חתוך kDa לפני כימות כמות החלבון. מערבבים את ה-sEVs עם חיץ תמוגה ביחס של 1:1, מערבולת ל-30 מעלות ודגרה על קרח למשך 15 דקות כדי לכמת את כמות החלבון.
- ערבבו כמויות שוות של חלבון (2 מיקרוגרם) של ה-sEVs, ליסאט תאי RAW 264.7 ומדיה מרוקנת אקסוזום עם הפחתת מאגר הדגימה.
- דנטורה את הדגימות ב 95 °C (5 דקות), לשמור אותם על קרח במשך 5 דקות, ולהסתובב במשך 2 דקות ב 10,000 × גרם. טען את הדגימות על ג'ל חלבון טריס-גליצין 12% והפעל את הג'ל ב 125 V במשך 45 דקות.
- העבר את החלבון על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 25 V עבור 2 שעות.
- לאחר ההעברה, לחסום את ממברנות PVDF עם חוצץ חסימה (ראה טבלת החומרים) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- לדגור את כתם עם נוגדנים ראשוניים על שייקר לילה ב 4 °C (50 °F).
הערה: נוגדנים עיקריים בשימוש היו אנטי CD81 (1:1,000), אנטי אלפא-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-אינטראקציה חלבון X (Alix) (1:1,000), אנטי קלנקסין (1:1,000), ו anti-גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרונאז (GAPDH) (1:1,000). - לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x תמיסת מלח חוצצת טריס, 0.1% Tween 20 (TBST), ודגרה בטמפרטורת החדר עם עיזים נגד עכבר IgG-חזרת peroxidase (HRP)- או נוגדנים משניים נגד ארנב IgG-HRP-HRP(1:10,000) עבור 1 שעה על שייקר.
- לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x TBST, ולזהות את החלבונים באמצעות מצע HRP.
- נתח את הכתמים על ידי כימותרפיה משופרת באמצעות צלם כתם מערבי.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)
- תקן sEVs על-ידי שימוש חוזר בהם ב- paraformaldehyde של 2% (PFA) במאגר פוספט (PB) של 0.1 M; מערבולת עבור 2 x 15 s.
- מניח טיפה של 10 μL של השעיית sEV על parafilm נקי. צפים את רשת ה-formvar מצופה הפחמן בטיפה כשצדם מצופה פונה אל המתלים. תן לממברנות להיספג במשך 20 דקות בסביבה יבשה.
- מניחים את הרשתות (בצד הממברנה כלפי מטה) על טיפה של PB לשטוף במשך 3 x 2 דקות.
- העבר את הרשתות ל 50 μL של 1% glutaraldehyde במשך 5 דקות.
- לשטוף את הרשתות עם 100 μL של מים מזוקקים במשך 8 x 2 דקות.
- השווה את המדגם על ידי הצבת הרשתות על ירידה של 1% אורניל אצטט במשך 2 דקות.
- הטמיע את המדגם עם 50 μL של 0.2% אורניל אצטט עם 2% פתרון methylcellulose במשך 10 דקות על צלחת קרח מכוסה parafilm.
- השתמש לולאות נירוסטה להחזיק את הרשתות ולהסיר נוזל עודף עם נייר מסנן.
- ייבש את הרשת במשך 10 דקות בעוד עדיין בלולאה.
- צפה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 80 kV.
3. תיוג של SEVs
- לדלל 20 מיקרוגרם של sEVs ב 1 מ"ל של מאגר דילול או אותו נפח של PBS ב 1 מ"ל של מאגר דילול לשליטה בצבע.
- לדלל 3 μL של PKH67 או PKH26 צבע ב 1 מ"ל של חיץ דילול ומערבבים על ידי pipetting.
- הוסיפו צבע PKH מדולל לארופי ה-SEV המדוללים וערבבו על ידי צנרת. דגירה במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשליטה בצבע, ערבבו את הצבע מדולל עם PBS מדולל משלב 3.1.
- הוסיפו 2 מ"ל של 1% סרום בקר (BSA) ב-PBS לצינור עם הצבע ותערובת ה-sEV ולצינור בקרת הצבע כדי לספוג עודפי צבע.
- צנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F). השלך את supernatant, resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS, וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (60 °F). חזור על הכביסה עם PBS וערך מחדש את ה- sEV המסומן או את פקד הצבע בנפח שווה של PBS.
- לכמת את כמות החלבון הכוללת בשיטת ברדפורד.
4. ספיגת SEVs על ידי תאי Neuro-2a
- מניחים כיסויים של 18 מ"מ בצלחת 12-well ולוח 10 × 104 תאי Neuro-2a בכל באר בסך הכל 1 מ"ל של מדיום DMEM מלא המכיל 10% FBS ו 1% סטרפטוקוקו אחר עט.
- שנה את המדיום הבינוני למדיום המרוקן מ- DMEM כאשר ההשפעה על התא היא 80-90%. הוסף 1, 5 או 10 מיקרוגרם של SEVs המסומנים בכל באר עבור 1, 4 ו- 24 שעות עבור ספיגה תלוית מינון וזמן, או הוסף נפח שווה של בקרת צבע.
5. תרבויות אסטרוציטיות עיקריות
- מרדים 4 גורים לאחר הלידה 4 ימים לאחר הלידה על ידי גרימת היפותרמיה.
- לאסוף את המוחות בצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה קר כקרח האנק פתרון מלח מאוזן (HBSS) בתוספת 10 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES).
- לנתח את שתי האונות קליפת המוח ולהסיר את קרום המוח. טחון את הרקמות עם להב מעוקר.
- להעביר את הרקמות לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל פפאין / deoxyribonuclease אני חוצץ דיסוציאציה ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C (7 °F). מערבבים כל 5 דקות.
הערה: עבור 4 קליפות עכבר, 9 מ"ל של 7.5 U /mL פפאין ב HBSS מופעל ב 37 °C לפחות 30 דקות, מסונן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, מעורבב עם deoxyribonuclease I לריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל. - שאפו את supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לנטרל את פעילות האנזים. בזהירות טריטורציה כדי לנתק את הרקמות עם פיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל ופפטת פסטר מלוטשת להבה.
- להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצנטריפוגה התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). שאפו את המדיום וזרעו את התאים ב-10 מ"ל של DMEM שלםבבקבוקון 2 של 75 ס"מ. החלף את המדיום העל-טבעי ב-15 מ"ל של DMEM בינוני טרי 4 שעות לאחר ה ציפוי.
- לאחר 14 ימים במבחנה, להעביר את הבקבוקון לשייקר מסלולית לנתק את המיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים ב 320 סל"ד עבור 6 שעות.
- Trypsinize את אסטרוציטים הנותרים באמצעות 5 מ"ל של אנזים דיסוציאציה התא (שולחן החומרים) במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F). הוסף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לאפעיל את הפעולה אנזימטית ולכדור את התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
- תקיף מחדש את התאים ב- DMEM מלא. זרע 5 × 104 תאים על 12 מ"מ #1.5 מכסה בצלחת 24-well.
6. ספיגת SEVs על ידי אסטרוציטים
- כאשר אסטרוציטים מגיעים ל-80-90% שיתוף, שנה את המדיום למדיום מרוקן DMEM.
- הוסף 1 מיקרוגרם של sEV ללא תווית, עם תווית, נפח שווה של בקרת צבע או PBS לתאים. השתמש בתאים להכתמה 1 שעות ו 24 שעות לאחר טיפול sEV.
7. אימונופלואורסצנטיות
- לשטוף את התאים עם PBS 3x ולתקן אותם עם 4% PFA ב PB במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים הקבועים 3 x 5 דקות עם PB ולחלחל להם באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PB במשך 10-15 דקות לשטוף עם PB 3 x 5 דקות.
- לחסום את התאים עם 5% סרום עז נורמלי (NGS) ב PB במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים: חלבון הקשור microtubule 2 (MAP2A, 1:500) עבור תאי Neuro-2a או חלבון חומצי פרברי גליה (GFAP, 1:500) עבור אסטרוציטים ראשוניים טרי 5% NGS / PB לילה ב 4 °C עם רועד עדין.
- לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ולהוסיף נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (עז אנטי עכבר IgG1, אלכסה פלור 594; או עז אנטי עכבר IgG H&L, אלכסה פלור 488) ב 5% NGS ודגרה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר על רוקר.
- לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ודגורה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של כתם גרעיני 4 ',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שוב 3x עם PB.
- טען את כיסויי השער בשקופיות #1 באמצעות מדיום הרכבה נגד פיד. תן להם להתייבש לילה בחושך, ולאחסן את שקופיות הזכוכית המוכנות ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי.
8. ספיגת ויוו של SEVs
- בצע הזרקה תוך-תיאטרלית של 5 מיקרוגרם של sEVs ללא תווית או תווית resuspended ב 10 μL של PBS, או נפח שווה (10 μL) של בקרת צבע (כפי שהוכן בסעיף 3) לתוך עכברי C57BL /6.
- לאחר 6 ו 18 שעות לאחר הזרקה של SEVs, עמוק להרדים עכברים על ידי הזרקה תוך-אישית של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של xylazine.
- בצע זלוף תוך-קרדיאלי של עכברים עם 0.9% תמיסת מלח כדי לשטוף את הדם, ואחריו קר קרח טרי 4% PFA / PB.
- לנתח את חוט השדרה ולתקן ב 4% PFA / PB ב 4 °C (55 °F) עבור 24 שעות. Cryoprotect על הרקמות ב 30% סוכרוז ב PB ב 4 °C (50 °F) במשך 24 שעות או עד הרקמות לשקוע. לאחסן את הרקמות ב 4 °C (55 °F) עד immunohistochemistry.
9. אימונוהיסטוכימיה
- הטמע חוט השדרה L4-L5 במתחם O.C.T. יש להקפיא על קרח יבש עד להתגבשות מלאה.
- חלק את הרקמות ב 30 מיקרומטר (חתך עבור חוט השדרה) באמצעות cryostat, ולאסוף את החלקים בצלחת 24 באר המכיל PB. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון PB.
- חסום אתרי כריכה לא ספציפיים עם 5% NGS ב- 0.3% טריטון/PB למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לדלל נוגדנים עיקריים: אנטי MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 עבור מיקרוגליה (1:2,000) עם 5% NGS ב 0.3% טריטון / PB, ודגורת המקטעים לילה ב 4 °C על שייקר.
- לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון / PB, ולהוסיף נוגדנים משניים (חמור נגד ארנב IgG אלכסה פלואור 488, 1:500, או עז נגד עכבר IgG אלכסה פלור 488, 1:500) ב 5% NGS / PB עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 x 5 דקות עם PB, ולדגירה את החלקים ב 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם PB.
- הר את המקטעים על שקופית דבק נקי (שולחן חומרים) עם מברשת צבע עדינה תחת מיקרוסקופ אור.
- מרטיבים את כיסוי עם בינוני הרכבה. לרפא לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
- תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר בידוד של SEVs מ RAW 264.7 מדיה מותנית באמצעות צנטריפוגה, NTA שימש כדי לקבוע את הריכוז ואת התפלגות הגודל של SEVs מטוהר. הגודל הממוצע הממוצע של ה-RAW 264.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר, וגודל החלקיקים שיא היה 121.8 ננומטר, המאשר כי החלקיקים הניתנים לזיהוי ביותר במדידת פיזור האור נפלו בטווח הגודל של exosomes או sEVs ב 50-150 ננומטר (איור 1A). כפי שהוצע במידע המינימלי למחקרים של שלל חוץ תאי 2018 (MISEV2018)23, ניתחנו קבוצה של חלבונים שיש להציג או לא לכלול מאוכלוסיות EV נפרדות. סופות מערביות של SEVs, ליסאט תאים ומדיה מרוקנת אקסו הראו כי דגימות חלבון שמקורן ב-SEV הכילו את חלבוני הסמן SEV Alix, CD81 ו-GAPDH. שבר ליסאט התא הועשר בחלבון הרטיקולום האנדופלזמי, קלנקסין, שנעדר ב- sEVs. לפיכך, calnexin שימש סמן שלילי לזיהום הסלולר (איור 1B).
לאחר מכן ביצענו ניסויים בתגובה במינון ובמסלול זמן לספיגת sEV במבחנה. תאי Neuro-2a דוגרו עם מנה אחת של 1 מיקרוגרם של SEVs עם תווית PKH67 עבור 1, 4 ו 24 שעות, ולאחר מכן ספיגת ריכוזים שונים של SEVs (1, 5, ו 10 מיקרוגרם) נבדקה בשעה 1. התוצאות של NTA הצביעו על כך 1 מיקרוגרם של חלבון בממוצע היה שווה ~ 1 x 109 חלקיקים. במקביל נבדקו גם PBS, SEVs ללא תווית ובקרות צבע בלבד. ראינו כי ספיגת SEVs התרחשה בשעה 1(איור 2A)וב- 1, 5 ו - 10 מיקרוגרם sEV (איור 2B). פלואורסצנטיות יכולה להתגלות ב 4 שעות עבור 5 ו 10 מיקרוגרם של sEVs (איור 2C) לאחר הדגירה. לאחר מכן, נבדקה ספיגת SEVים המסומנים על ידי PKH26 על ידי אסטרוציטים עיקריים (איור 3). פלואורסצנטיות מקסימלית מספיגת SEV באסטרוציטים קליפת המוח העיקריים התרחשה בשעה 24 שעות. רכבי SEV ללא תווית לא הראו פלואורסצנטיות, והוכיחו כי פלואורסצנטיות sEV אינה תורמת באופן משמעותי לחיוביות שגויות(איור משלים S1A).
לאחר מכן, SEVs שכותרתו הוזרקו תוך אט-אטececally לעכברים כדי להעריך את המסירה וספיגת של SEVs על ידי תאים שונים בחוט השדרה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. אנו מוכתמים עבור MAP2 כסמן עצבי, GFAP כסמן אסטרוציטי, ו- IBA1 כסמן מיקרוגליאלי. תאי עצב (איור 4), אסטרוציטים(איור 5)ותאים מיקרו-גליאליים(איור 6)כולם תפסו תאי SEV בעלי תווית PKH26, ופלואורסצנטיות SEV מקסימלית נצפתה במהירות של 6 שעות לאחר ההזרקה. בעוד שה-sEVs לא תמיד התחברו עם הסמנים התאיים, לא ראינו ספיגה דיפרנציאלית כלשהי על ידי תאי מערכת קדם-קיום. הזרקה תוך-אט-אתא-תיאטרלית עם 5 מיקרוגרם של RAW 264.7 sEV או בקרת צבע לא הראתה פלואורסצנטיות משמעותית (איור משלים S1B). אותות פלואורסצנטיים נצפו בקרום החם, הן 6 שעות ו 18 שעות לאחר הזרקת SEVs (איור משלים S1C).
איור 1: אפיון של RAW מטוהר 264.7 sEVs. (A)גודל וריכוז של SEVs נקבעו באמצעות NanoSight NS300. החלקיקים היו במעקב וב בגודל בהתבסס על תנועה בראונית ומקדם דיפוזיה. התפלגות הגודל של sEVs מוצגת ב- nm. ריכוז ה-SEVs בא לידי ביטוי כחלקיקים/מ"ל. (B)כתם מערבי של חלבונים המופק מ- sEV מטוהר, ליסאט תאים ומדיה מרוקנת אקסוזום באמצעות סמני SEV ALIX, GAPDH ו- CD81. סמן חלבון רשתית אנדופלסמי, calnexin, משמש בקרה כדי לפקח על זיהום הסלולר בתכשירי sEV. (C)מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור הדגימה את הגודל והמורפולוגיה של SEVs. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; ALIX = אלפא-1,3/1,6-מנוסילטרנספראז (ALG-2) - חלבון אינטראקציה X; GAPDH = גליצרילדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; CD81 = אשכול של בידול 81. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספיגת תאי RAW 264.7 SEV בעלי תווית של תאי נוירו-2a. (A)SEVs עם תווית PKH67 (1 מיקרוגרם) נוספו לתאי Neuro-2a בתרבית עבור 1, 4 או 24 שעות ספיגת SEV נצפתה בכל נקודות הזמן עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. (B)SEVs עם תווית PKH67 (1, 5 או 10 מיקרוגרם) נוספו לתאי Neuro-2a למשך שעה אחת. (C) SEVs המסומנים PKH67 (5 או 10 מיקרוגרם) נוספו לתאי Neuro-2a עבור 4 שעות. ספיגת sEV נצפתה בכל קבוצות המינון עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. קבוצות בקרה שליליות שטופלו בצבע PKH בלבד לא הראו כתמי SEV(איור משלים S1). תאי Neuro-2a היו מחוסנים עם MAP2A (נחקר עם אלכסה פלור 594, מוצג באדום), בעוד גרעיני תאים היו מוכתמים עם DAPI (מוצג בכחול) ו sEVs עם PKH67 (מוצג בירוק). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; MAP2A = חלבון הקשור למיקרוטובולה 2A; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ספיגת טלוויזיות RAW 264.7 SEV עם תווית PKH26 על ידי אסטרוציטים קליפת מוח של עכבר ראשי. מיקרוגרם אחד של SEVs תויג בצבע PKH26 ונוסף למדיום התרבות האסטרוציטים העיקרי. ספיגת SEVs נצפתה ב 1 ו 24 שעות לאחר תוספת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. אסטרוציטים היו מוכתמים ב- GFAP (נחקר עם אלכסה פלור 488, המוצג באדום), ואילו גרעיני תאים היו מוכתמים נגד DAPI (מוצג בכחול), ו- sEVs היו מוכתמים בעבר עם PKH26 (מוצג בירוק). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. צבע PKH26 לבדו שימש כשליטה שלילית להכתמת SEV. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; GFAP = חלבון חומצי פרברילי גליה; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ספיגת תאי עצב מסוג RAW 264.7 sEVsin. PKH26-תוויות SEV הוזרקו תוך רחמיים בעכברים; 6 ו 18 שעות מאוחר יותר, העכברים היו perfused עם 4% PFA, וחוט השדרה היה מבודד וחתך ב 30 מיקרומטר. מקטעי חוט השדרה היו מחוסנים עם סמן תא (נחקר עם Alexa Fluor 488, מוצג באדום) ו- DAPI נגד גרעיני (מוצג בכחול), בעוד SEVs היו מסומנים בעבר עם PKH26 (מוצג בירוק). מקטעי חוט השדרה היו חיסונים עבור MAP2A כדי לדמיין את הנוירונים (אדום). מיקרוסקופיה קונפוקלית מציגה SEVs בנוירונים חיוביים MAP2A בנקודות זמן שונות. השליטה השלילית, PKH26 צבע לבד הקבוצה, לא הראה כתמים sEV. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; PFA = paraformaldehyde; MAP2A = חלבון הקשור למיקרוטובולה 2A; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ספיגת 264.7 SEVs גולמיים באסטרוציטים. PKH26-תוויות SEV הוזרקו תוך רחמיים בעכברים; 6 ו 18 שעות מאוחר יותר, העכברים היו perfused עם 4% PFA, וחוט השדרה היה מבודד וחתך ב 30 מיקרומטר. מקטעי חוט השדרה היו מחוסנים עם סמן תא (נחקר עם Alexa Fluor 488, מוצג באדום) ו- DAPI נגד גרעיני (מוצג בכחול), בעוד SEVs היו מסומנים בעבר עם PKH26 (מוצג בירוק). מקטעי חוט השדרה היו חיסוניים עבור GFAP לדמיין את האסטרוציטים (אדום). מיקרוסקופיה קונפוקלית מציגה SEVs באסטרוציטים חיוביים GFAP בנקודות זמן שונות. השליטה השלילית, PKH26 צבע לבד הקבוצה, לא הראה כתמים sEV. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; PFA = paraformaldehyde; GFAP = חלבון חומצי פרברילי גליה; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ספיגת 264.7 SEV RAW במיקרוגליה. PKH26-תוויות SEV הוזרקו תוך רחמיים בעכברים; 6 ו 18 שעות מאוחר יותר, העכברים היו perfused עם 4% PFA, וחוט השדרה היה מבודד וחתך ב 30 מיקרומטר. מקטעי חוט השדרה היו מחוסנים עם סמן תא (נחקר עם Alexa Fluor 488, מוצג באדום) ו- DAPI נגד גרעיני (מוצג בכחול), בעוד SEVs היו מסומנים בעבר עם PKH26 (מוצג בירוק). מקטעי חוט השדרה היו חיסוניים עבור IBA1 כדי לדמיין את המיקרוגליה (אדום). מיקרוסקופיה קונפוקלית מציגה SEV במיקרוגליה חיובית IBA1 בנקודות זמן שונות. השליטה השלילית, PKH26 צבע לבד הקבוצה, לא הראה כתמים sEV. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; PFA = paraformaldehyde; IBA1 = מולקולת מתאם מחייב סידן מיוננת 1; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: ספיגת טלוויזיות RAW 264.7 sEVs המסומנות על ידי אסטרוציטים קליפת המוח העיקריים של העכבר ובחוט השדרה. (A)פקדים לספיגת טלוויזיות RAW 264.7 SEV עם תווית PKH26 על-ידי אסטרוציטים קליפת המוח של העכבר הראשי. מיקרוגרם אחד של SEVs ללא תווית שהומצא מחדש ב- PBS או נפח שווה של PBS נוסף במקביל למדיום התרבותי של אסטרוציטים. לא נצפתה פלואורסצנטיות בשעה 1 שעות עבור PBS ובקרה ללא תווית באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. אסטרוציטים היו מוכתמים עם GFAP (נחקר עם אלכסה פלור 488, מוצג באדום), בעוד הגרעינים היו מוכתמים עם DAPI (כחול), ו- sEVs ללא תווית הוצגו תחת אותו ערוץ אלכסה פלור 546 כמו SEVs עם תווית PKH26. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) פקדים לספיגת PKH26-תווית RAW 264.7 sEVs על ידי חוט השדרה של העכבר ב vivo. חמישה מיקרוגרם של SEVs ללא תווית או בקרת צבע הוזרקו תוך אט-תקלי בעכברים. שוב, אותות פלואורסצנטיים לא נצפו עבור SEVs ללא תווית או שליטה לבד צבע באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית. אסטרוציטים היו מוכתמים ב- GFAP (נחקר עם אלכסה פלור 488, מוצג באדום), בעוד גרעינים היו מוכתמים עם DAPI (כחול), ו- sEVs ללא תווית הוצגו תחת אותו ערוץ אלכסה פלור 546 כמו SEVs עם תווית PKH26. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C)תמונות מייצגות חושפות את נוכחותם של RAW 264.7 sEVs בקרום השדרה של העכבר 6 שעות ו 18 שעות לאחר המסירה התוך-תרמית. חמישה מיקרוגרם של SEVs סומנו בצבע PKH26 (מוצג בירוק), וגרעין היו מוכתמים עם DAPI (מוצג בכחול). כוכביות מצביעות על עורק השדרה העורפי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: sEVs = שלל חוץ תאי קטן; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט; GFAP = חלבון חומצי פרברילי גליה; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, הראינו את התיוג של SEVs עם צבעי PKH ואת ההדמיה של ספיגתם בחוט השדרה. PKH צבעי פלואורסצנטית ליפופילית נמצאים בשימוש נרחב לתיוג תאים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית3,5,6,12,24,25. בשל מחצית החיים הארוכה יחסית שלהם וציטוקסיות נמוכה, צבעי PKH יכולים לשמש למגוון רחב של מחקרי מעקב אחר תאים במבחנה 26,27. למרות שימור ממברנה מעולה ויציבות ביוכימית הם יתרון, intercalation של בדיקות פלואורסצנטיות עם מזהמי ליפופרוטאין מטוהרים עם sEVs יכול לסכן את הפרשנות של הפנמת sEV ומחקרים פונקציונליים. לכן, טיהור ותיוג של sEVs הם צעדים קריטיים בפרוטוקול כי ההתמדה של הצבעים עם מזהמים יכול להוביל לפרשנות שגויה של התפלגות in vivo 28. הכללת פקדים היא קריטית כדי למנוע אותות פלואורסצנטיות חיוביים כוזבים עקב תיוג לא ספציפי של חלקיקים ואת מחצית החיים הארוכה של צבעים אלה.
היווצרות צבירה ומיסל של צבעים ליפופיליים עשוי גם להניב אותות שווא. טיפלנו בבעיה של צבע חופשי או לא מאוגד על ידי הכללת שליטה לבד בצבע והדמיה של ספיגת EV בנקודות זמן מוקדמות יותר. מגבלה חשובה שדווחה עבור תיוג PKH היא כי חלקיקי PKH26 רבים נוצרים במהלך תיוג צבע PKH26 של SEVs. למרות שלא נכלל בפרוטוקול זה, הוא דיווח כי חלקיקי PKH26 ניתן להסיר על ידי הדרגתי סוכרוז29. מחקר אחר העריך את ההשפעה של תיוג PKH על גודל ה- sEVs על ידי NTA ודיווח על עלייה בגודל בעקבות תיוג PKH30. עם זאת, צבעי PKH משמשים כמעקב פרגמטי ויקר ערך כדי להראות היכן חצו ה- SEVs. מגבלה נוספת של מחקר זה היא כי לא לכמת sEVs כמו פרוטוקול זה מתמקד באישור של ספיגה הסלולר לאחר משלוח תוך-תיא-שתתף. בדיקות ממברנה חדשניות מבוססות ציאנין פותחו לאחרונה עבור הדמיית פלואורסצנטיות רגישה מאוד של SEVs מבלי לשנות את הגודל או לייצר חפצים, כגון היווצרות של חלקיקי PKH31, וללא ספק ישפר את מחקרי התיוג העתידיים.
למרות מקרופאגים לשחק תפקידים חשובים neuroinflammation, הם גם להפעיל פונקציות neuroprotective על ידי אספקת המטען שלהם באמצעות exosomes32. המחקרים שלנו מראים כי SEVs נגזר מקרופאגים שכותרתו נלקחים על ידי תאי Neuro-2a, אסטרוציטים ראשוניים, בחוט השדרה המותני לאחר מתן תוך-תיא-תקלי. התוצאות מצביעות על כך שזמן דגירה ארוך יותר יכול להוביל לעוצמת אות SEV נמוכה יותר, אשר ניתן לייחס השפלה של SEVs או חלוקת תאים על ידי תאי Neuro-2a בתרבות33,34. למרות תפוקה נמוכה, פרוטוקול זה להדמיה של sEVs שכותרתו בחוט השדרה יכול לשמש עבור מחקרי אימות ראשוניים המאשרים ספיגת sEV לפני חקירת ההשפעה התפקודית של sEVs נמסר תוך-אט-אקזי. כפי שצפינו בדרך כלל ספיגת sEV דומה במספר סוגי תאים של מערכות ום, תהליך הספיגה נראה לא סלקטיבי. אם autofluorescence היא בעיה בהדמיה, SEVs ללא תווית יכול לשמש כבקרה נוספת כדי לשלול את ה- sEV autofluorescence במהלך הדמיה של רקמות ותרבויות. למרות המינון ואת המסלול של ניהול של SEVs יכול להשפיע על הדפוס של biodistribution11, פרוטוקול זה אינו מותאם לניתוח כמותי של ספיגת sEV. מספר גישות שונות ואסטרטגיות הדמיה שונות משמשות כדי לחקור SEVs, ואלה הם להיות מעודן ללא הרף ומותאם למעקב in vivo של sEVs2.
פרוטוקול זה אמור להיות רק גישה אחת כדי לאשר ספיגת SEV. כמו בכל הפרוטוקולים, אימות צולב באמצעות גישות מרובות מודים יכול להיות מועיל. באופן ספציפי, ספיגת SEVs ניתן לאשר על ידי חקירת העברת מטען ביומולקולרי לתאי הנמען ורקמות. אם החוקר יודע את הרכב ה- miRNA של SEVs שנמסרו, גישה חלופית לאישור העברת sEV תהיה לבדוק אם קיימים שינויים ב- miRNA בתאי הנמען או לקבוע את השינויים ברמות הביטוי של גני היעד עבור miRNAs שהועברו. דגימות שטופלו ב- PBS יכולות לשמש כפקד עבור גישה זו. בסך הכל, תוצאות אלה תומכות ברעיון כי SEVs נגזר מקרופאגים נלקחים על ידי תאי מערכות דם במבחנה וב- in vivo. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את תפקידם של SEVs בהפרעות בעמוד השדרה, כאב, ודלקת ולקבוע אם ניתן לפתח SEVs ככלי רכב סלולריים לאספקת מולקולות קטנות טיפוליות, RNA וחלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ NIH NINDS R01NS102836 ואת מחלקת הבריאות של חבר העמים הבריטי אוניברסלי שיפור מחקר (CURE) הוענק Seena ק אג'יט. אנו מודים לד"ר בראדלי נאש על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
