Descrevemos um protocolo para rotular pequenas vesículas extracelulares derivadas do macrófago com corantes PKH e observar sua absorção in vitro e na medula espinhal após a entrega intratecal.
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Artigo de método
Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas de 50-150 nm secretadas por todas as células e presentes em fluidos corporais. os sEVs transferem biomoléculas como RNA, proteínas e lipídios de doadores para células aceitadoras, tornando-os os principais mediadores de sinalização entre as células. No sistema nervoso central (SNC), os SEVs podem mediar a sinalização intercelular, incluindo interações neuroimunes. As funções sEV podem ser estudadas rastreando a absorção de sEVs rotulados em células receptoras tanto in vitro quanto in vivo. Este artigo descreve a rotulagem de sEVs da mídia condicionada de células macrófagos RAW 264.7 usando um corante de membrana PKH. Mostra a absorção de diferentes concentrações de SEVs rotulados em vários pontos de tempo por células Neuro-2a e astrócitos primários in vitro. Também é mostrada a absorção de sEVs entregues intrathecally em neurônios da medula espinhal do camundongo, astrócitos e microglia visualizados por microscopia confocal. Os resultados representativos demonstram variação dependente do tempo na absorção de SEVs por diferentes células, o que pode ajudar a confirmar a entrega bem-sucedida de SEVs na medula espinhal.
Introdução
Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas nanosized, derivadas de membrana com uma faixa de tamanho de 50-150 nm. Eles se originam de corpos multi-vesiculares (MVBs) e são liberados das células após a fusão dos MVBs com a membrana plasmática. os sEVs contêm miRNAs, mRNAs, proteínas e lipídios bioativos, e essas moléculas são transferidas entre células na forma de comunicação célula-celular. os sEVs podem ser internalizados por células receptoras por uma variedade de vias endocíticas, e esta captura de sEVs por células receptoras é mediada pelo reconhecimento de moléculas superficiais em EVs e nas células-alvo1.
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. Os camundongos CD-1 grávidas foram usados para a cultura astróctica, e todas as barragens foram recebidas 15 dias após a impregnação. Os camundongos C57BL/6 de dez e doze semanas foram usados para experimentos de absorção in vivo.
1. Isolamento de sEVs de células macrófagos RAW 264.7
- Cultura RAW 264,7 células em 75 cm2 frascos em MMEM exosome-despojado médio contendo 10% de s....
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Resultados
Após o isolamento dos SEVs da mídia RAW 264.7 condicionada via centrifugação, a NTA foi utilizada para determinar a concentração e distribuição de tamanho dos sEVs purificados. O tamanho médio médio dos SEVs DERIVADOS RAW 264,7 foi de 140 nm, e o tamanho da partícula máxima foi de 121,8 nm, confirmando que a maioria das partículas detectáveis na medição de dispersão de luz caiu dentro da faixa de tamanho de exossomos ou sEVs a 50-150 nm(Figura 1A). Conforme sugerido nas informações mínimas p.......
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Discussão
Neste protocolo, mostramos a rotulagem de sEVs com corantes PKH e a visualização de sua absorção na medula espinhal. Os corantes fluorescentes lipofílicos PKH são amplamente utilizados para rotulagem de células por citometria de fluxo e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. Devido à sua meia-vida relativamente longa e baixa.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por subsídios do NIH NINDS R01NS102836 e do Departamento de Saúde da Pensilvânia Universal Research Enhancement (CURE) concedidos a Seena K. Ajit. Agradecemos ao Dr. Bradley Nash pela leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtros centrífugos Amicon Ultra 0.5 mL | Anticorpo Anti-Alix MilliporeSigma | Z677094 | |
| Abcam | ab186429 | 1:1000 | |
| Anticorpo Anti-Calnexina | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Santa | Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Anticorpo Monoclonal (14C10) | Sinalização Celular Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 para IF; 1:1000 para IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A | Antibody Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μ m | VWR | 15-1040-1 | |
| Tubos de Centrífuga | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Lamínula, 12-mm, #1.5 | Microscopia Eletrônica Sciences | 72230-01 | |
| Lamínula, 18-mm, #1.5 | Microscopia Eletrônica Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µ g/mL |
| Ensaio de Proteína DC | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Desoxirribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Burro Anti-Coelho IgG H& L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Burro Anti-Coelho IgG H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Lâminas de Microscópio Duplo Fosco, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS sem Cálcio e Magnésio | Corning | 21-031-CV | |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Soro Fetal Bovino Depletado por Exossomo | Gibco | A27208-01 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M sistema de imagem | ProteinSimple | ||
| FV3000 Microscópio Confocal | Olympus | ||
| Cabra Anti-Rato IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| cabra anti-rato IgG H & L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Buffer de bloqueio de interceptação, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Tampão de Amostra | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Vidro de Cobertura, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Linha celular Neuro-2a | ATCC | CCL-131 | |
| de soro de cabra normal | S-1000 | ||
| O.C.T Composto | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Microscopia Eletrônica | de Paraformaldeído | 19210 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Inibidor de protease Coquetel | Thermo Scientific | 1862209 | |
| Membrana de transferência de PVDF | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Linha celular | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Cloreto de Sódio | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | lâminas adesivas |
| T-75 Frascos | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Microscópio Eletrônico de Transmissão Digital | FEI Company | ||
| TEM Grids | Microscopia Eletrônica Ciências | FSF300- | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | enzima |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Tripsina, 0,25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Beckman | 344058 | 110.000 x g |
Referências
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....
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Reimpressões e permissões
