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Neuroscience

फ्लोरोसेंट का तेज छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स इन विट्रो और स्पाइनल कॉर्ड में लेबल किया गया

Published: May 23, 2021 doi: 10.3791/62537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

Summary

हम पीकेएच रंगों के साथ मैक्रोफेज-व्युत्पन्न छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स को लेबल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और इंट्राथेकल डिलीवरी के बाद विट्रो और रीढ़ की हड्डी में उनके तेज का निरीक्षण करते हैं।

Abstract

छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (एसईवी) 50-150 एनएम वेसिकल्स हैं जो सभी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और शारीरिक तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। SEVs ऐसे आरएनए, प्रोटीन, और लिपिड जैसे जैव अणुओं को दाता से स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में स्थानांतरित करते हैं, जिससे वे कोशिकाओं के बीच प्रमुख संकेत मध्यस्थ बन जाते हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, एसईवी न्यूरोइम्यून इंटरैक्शन सहित इंटरसेलुलर सिग्नलिंग में मध्यस्थता कर सकते हैं। सेव कार्यों को इन विट्रो और वीवो दोनों में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में लेबल वाले एसईवी के तेज को ट्रैक करके अध्ययन किया जा सकताहै । यह पेपर पीकेएच झिल्ली डाई का उपयोग करके रॉ 264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से एसईवी की लेबलिंग का वर्णन करता है। यह न्यूरो-2ए कोशिकाओं और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स इन विट्रोद्वारा कई समय बिंदुओं पर लेबल किए गए एसईवी की विभिन्न सांद्रता के तेज को दर्शाता है। यह भी दिखाया गया है कि माउस स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए गए माइक्रोग्लिया में इंट्राथेकेली रूप से वितरित SEVs का तेज है। प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न कोशिकाओं द्वारा एसईवी के तेज में समय पर निर्भर भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी में सफल एसईवी वितरण की पुष्टि करने में मदद कर सकता है।

Introduction

छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (एसईवी) नैनोसाइज्ड, झिल्ली-व्युत्पन्न वेसिकल्स हैं, जिनका आकार 50-150 एनएम है। वे बहु-वेसिकुलर निकायों (एमवीबी) से उत्पन्न होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली के साथ एमवीबी के संलयन पर कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं। SEVs में मीन्राना, एमएचआरए, प्रोटीन और बायोएक्टिव लिपिड होते हैं, और इन अणुओं को कोशिका-से-कोशिका संचार के रूप में कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित किया जाता है। एसईवी को विभिन्न प्रकार के एंडोसाइटिक रास्तों द्वारा प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जा सकता है, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा एसईवी का यह कैप्चर ईवीएस और लक्ष्य कोशिकाओं दोनों पर सतह के अणुओं की मान्यता द्वारा मध्यस्थता की जाती है1।

SEVs अपनी क्षमता के कारण ब्याज प्राप्त किया है स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में आणविक और phenotypic परिवर्तन ट्रिगर, एक चिकित्सकीय एजेंट के रूप में उनकी उपयोगिता, और कार्गो अणुओं या औषधीय एजेंटों के लिए वाहक के रूप में उनकी क्षमता । उनके छोटे आकार के कारण, एसईवी की इमेजिंग और ट्रैकिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है, खासकर वीवो अध्ययन और नैदानिक सेटिंग्स में। इसलिए, विट्रो और वीवो2में उनके बायोडिविशनल और ट्रैकिंग की सहायता करने के लिए एसईवी को लेबल और छवि बनाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं।

एसईवी बायोडिव्रिब्यूशन और टारगेट सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की सबसे आम तकनीक में उन्हें फ्लोरोसेंट डाई अणुओं 3 ,4,5 ,6,7के साथ लेबल करना शामिल है । ईवीएस को शुरू में कोशिका झिल्ली रंगों के साथ लेबल किया गया था जो आमतौर पर छवि कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाते थे। ये फ्लोरोसेंट रंग आम तौर पर एसईवी पर लिपिड बाइलेयर या ब्याज के प्रोटीन को दाग देते हैं। साइटोसोल में शामिल होने पर कई लिपोफिलिक रंग एक मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रदर्शित करते हैं, जिसमें डीआईआर (1,1′-डायक्टाडेसिल-3,3,3′,3′-टेट्रामेथाइलिंटोट्रिकरबोसायनी आयोडाइड), डीआईएल (1, 1′-डायक्टाडाइल-3, 3, 3', 3'-टेट्रामेथिल इंडोकार्बोसिनाइन परक्लोरेट), और डीआईडी (1, 1′-डायक्टाडेसिल-3, 3, 3′, 3′-टेट्रामेथिल इंडोकार्बोसायनिन 4-क्लोरोबेनजेनेसुलफनेट नमक)8,9,10,11।

PKH67 और PKH26 जैसे अन्य लिपोफिलिक रंगों में एक अत्यधिक फ्लोरोसेंट ध्रुवीय प्रमुख समूह और एक लंबी एलिफेटिक हाइड्रोकार्बन पूंछ होती है जो आसानी से किसी भी लिपिड संरचना में इंटरकैलेट करती है और दीर्घकालिक डाई प्रतिधारण और स्थिर फ्लोरेसेंस12की ओर ले जाती है। PKH रंग ईवीएस को भी लेबल कर सकते हैं, जो वीवो13में ईवी गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एक्सोसोम्स का निरीक्षण करने के लिए कई अन्य रंगों का उपयोग किया गया है, जिसमें लिपिड-लेबलिंग रंग14 और सेल-पारगम्य रंग जैसे कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट सुसिनिमिडिल एस्टर (सीएफडीए-एसई)15,16 और कैल्सीन एसिटॉक्सीमिथिल (एएम) एस्टर17शामिल हैं।

सीएनएस में विभिन्न कोशिकाओं के बीच एसईवी-मध्यस्थता क्रॉसटॉक के अध्ययनों ने न्यूरोइंफ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों18के रोगजनन पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स से SEVs बीटा-एमिलॉयड पेप्टाइड्स और फॉस्फोरिलेटेड ताऊ प्रोटीन और अल्जाइमर रोग19के रोगजनन में सहायता फैल सकता है । इसके अतिरिक्त, एरिथ्रोसाइट्स से प्राप्त ईवीएस में बड़ी मात्रा में अल्फा-सिन्यूक्लिन होते हैं और रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार कर सकते हैं और पार्किंसंस की विकृति20में योगदान दे सकते हैं। SEVs की शारीरिक बाधाओं को पार करने की क्षमता21 और उनके जैव अणुओं को लक्षित कोशिकाओं में स्थानांतरित करने से उन्हें सीएनएस22में चिकित्सीय दवाओं को वितरित करने के लिए सुविधाजनक उपकरण बन जाते हैं ।

रीढ़ की हड्डी में असंख्य सीएनएस कोशिकाओं द्वारा सेव तेज की कल्पना करने से मशीनी अध्ययन और विभिन्न सेलुलर स्रोतों से एक्सोजेनोसली प्रशासित एसईवी के चिकित्सीय लाभों का मूल्यांकन दोनों सक्षम होंगे। यह पेपर मैक्रोफेज से प्राप्त SEVs को लेबल करने की पद्धति का वर्णन करता है और काठ की रीढ़ की हड्डी में और वीवो में न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स द्वारा दृश्य द्वारा एसईवी वितरण की गुणात्मक पुष्टि करने के लिए उनकी गति को छवि देता है।

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Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया और ड्रेक्सेल विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित । समय पर गर्भवती सीडी-1 चूहों का उपयोग एस्ट्रोसाइटिक संस्कृति के लिए किया जाता था, और सभी बांधों को गर्भवती होने के 15 दिन बाद प्राप्त किया गया था। दस-बारह सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों के लिए वीवो तेज प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया ।

1. रॉ 264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं से SEVs का अलगाव

  1. संस्कृति रॉ 264.7 कोशिकाओं में 75 सेमी2 फ्लैक्स डीएमईएम एक्सोसोम-समाप्त माध्यम में 10% एक्सोसोम-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) 24-48 एच के लिए समाप्त हो गया।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 × जी पर वातानुकूलित मध्यम और अपकेंद्रित्र की 300 मिलीएल ले लीजिए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2,000 × जी पर सुपरनेट और सेंट्रलाइज लीजिए।
  4. सुपरनेट को सेंट्रलाइज ट्यूब, सेंट्रलाइज को 12,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  5. सुपरनेट और फिल्टर को 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से इकट्ठा करें।
  6. अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब और सेंट्रलाइज को 110,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 80 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  7. सुपरनैंट (एक्सएक्स-कम्ड मीडियम) को स्टोर करें, 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलन में गोली को फिर से खर्च करें, और 1 घंटे के लिए 110,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें।
  8. पश्चिमी ब्लोटिंग के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई) या रेडियोइम्यूनोप्रिपिcipitेशन परख (रिपा) बफर का उपयोग करके आगे के लक्षण वर्णन के लिए पीबीएस के 100 माइक्रोल में गोली को फिर से खर्च करें।

2. SEVs का लक्षण वर्णन

  1. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)
    नोट: कच्चे २६४.७ कोशिकाओं से शुद्ध sEVs के आकार वितरण और कण संख्या/एकाग्रता एनटीए द्वारा मापा गया ।
    1. इष्टतम ट्रैकिंग के लिए देखने के क्षेत्र प्रति 20-60 vesicles प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर पीबीएस में SEVs पतला।
    2. एक निरंतर प्रवाह दर के साथ एक सिरिंज पंप का उपयोग कर एक प्रवाह सेल में पतला नमूना परिचय।
    3. प्रत्येक 30 एस के 3-5 वीडियो लें। शटर की गति और लाभ सेट करें, और मैन्युअल रूप से दिखाई देने वाले और विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए अधिकतम संख्या में वेसिकल्स के लिए कैमरा सेटिंग्स पर ध्यान केंद्रित करें।
    4. प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बीच नमूनों को दोहराने माप करने के लिए आगे बढ़ें। एनटीए पोस्ट-एक्विजिशन सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करें और नमूनों के बीच सेटिंग्स को स्थिर रखें।
    5. वेसिकल्स के औसत आकार और एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एनटीए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक वीडियो का विश्लेषण करें।
    6. स्थिरता के लिए समान सिस्टम सेटिंग्स के साथ सभी एनटीए माप ों को पूरा करें।
  2. पश्चिमी धब्बा
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके SEVs, सेल लाइसेट्स और एक्सोसोम-समाप्त मीडिया में कुल प्रोटीन मात्रा की मात्रा निर्धारित करें।
    2. सेल lysate तैयारी के लिए, संस्कृति 264.7 कोशिकाओं में 75 सेमी2 फ्लास्क में 80-90% ढुलमुल तक। 10-15 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन के साथ कोशिकाओं को अलग करें, संस्कृति मीडिया के साथ ट्राइपसिन को बेअसर करें, और 5 मिनट के लिए 400 × जी पर कताई करके कोशिकाओं को गोली मारें। कोशिकाओं को ताजा विकास माध्यम में पुनर्व्यापित करें।
    3. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें और 1 × 106 कोशिकाओं को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार ऊपर के रूप में एक ही अपकेंद्रित्र शर्तों का उपयोग करके धोएं और अंतिम स्पिन से सेल पेलेट में लाइसिस बफर (प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ रिपा बफर जोड़ा) के 50 माइक्रोन जोड़ें।
    4. भंवर कोशिकाओं और उन्हें 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए। मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र के अधीन करें, ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में सुपरनेट (यानी, lysate) एकत्र करें, और उपयोग होने तक −80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. प्रोटीन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने से पहले 3 केडीए-कटऑफ अपकेंद्रित्र फिल्टर का उपयोग करके एक्सोसोम-समाप्त मीडिया के 2 एमएल को 100 माइक्रोन पर केंद्रित करें। 1:1 अनुपात में लाइसिस बफर के साथ SEVs मिलाएं, 30 एस के लिए भंवर, और प्रोटीन की मात्रा को निर्धारित करने के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    6. एसईवी के प्रोटीन (2 माइक्रोन) की बराबर मात्रा, रॉ 264.7 सेल लाइज़ेट, और नमूना बफर को कम करने के साथ एक्सोसोम-समाप्त मीडिया मिलाएं।
    7. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को विकृत करें, उन्हें 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, और 10,000 × जीपर 2 मिनट के लिए स्पिन करें। नमूनों को 12% ट्राइस-ग्लाइसिन प्रोटीन जेल पर लोड करें और 45 मिनट के लिए 125 वी पर जेल चलाएं।
    8. प्रोटीन को 2 घंटे के लिए 25 वी पर पॉलीविनाइलाइडन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
    9. स्थानांतरण के बाद, पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध बफर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध करें।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक शेखर पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया विरोधी CD81 (1:1,000), विरोधी अल्फा-1,3/1,6-मैनोसाइलट्रांसफरेज (एएलजी-2)- बातचीत प्रोटीन एक्स (Alix) (1:1:1:1:1:1: 1,000), एंटी-कैल्नेक्सिन (1:1,000), और एंटी-ग्लाइसरल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़ (गपध) (1:1,000)।
    11. 1x Tris-बफर नमकीन, 0.1% ट्वीन 20 (TBST) के साथ दाग 3 x 15 मिनट धोएं, और बकरी विरोधी माउस IgG-सहिजन पेरोक्सिडेज (HRP) के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट- या गधा विरोधी खरगोश IgG-HRP-संजुगेट माध्यमिक एंटीबॉडी (1:10,000) के लिए 1 h शकर पर।
    12. 1x टीबीएसटी के साथ 3 x 15 मिनट के धब्बे धोएं, और एचआरपी सब्सट्रेट का उपयोग करके प्रोटीन का पता लगाएं।
    13. पश्चिमी दाग इमेजर का उपयोग करके बढ़ी हुई रसायनों द्वारा दाग का विश्लेषण करें।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)
    1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) में उन्हें 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में फिर से खर्च करके एसईवी को ठीक करें; 2 x 15 एस के लिए भंवर।
    2. स्वच्छ पैराफिल्म पर एसईवी निलंबन के 10 माइक्रोन की एक बूंद रखें। निलंबन का सामना कर रहे अपने लेपित पक्ष के साथ ड्रॉप पर कार्बन-लेपित फॉर्मवर ग्रिड फ्लोट करें। झिल्ली को सूखे वातावरण में 20 मिनट तक अवशोषित होने दें।
    3. 3 x 2 मिनट के लिए धोने के लिए पीबी की एक बूंद पर ग्रिड (झिल्ली की ओर नीचे) रखें।
    4. ग्रिडों को 5 मिनट के लिए 1% ग्लूटाराल्डिहाइड के 50 माइक्रोन में स्थानांतरित करें।
    5. ग्रिड को 8 x 2 मिनट के लिए आसुत पानी के 100 माइक्रोन से धोएं।
    6. इसके विपरीत 2 मिनट के लिए 1% यूरेसिल एसीटेट की एक बूंद पर ग्रिड रखकर नमूना।
    7. पैराफिल्म से ढके आइस डिश पर 10 मिनट के लिए 2% मिथाइलसेलुलोस समाधान के साथ 0.2% यूराइल एसीटेट के 50 माइक्रोन के साथ नमूना एम्बेड करें।
    8. ग्रिड को पकड़ने और फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए स्टेनलेस स्टील लूप का उपयोग करें।
    9. हवा-10 मिनट के लिए ग्रिड सूखी, जबकि अभी भी पाश पर ।
    10. 80 केवी पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।

3. SEVs की लेबलिंग

  1. डाइन कंट्रोल के लिए डिलुएंट बफर के 1 एमएल में एसईवी का पतला 20 माइक्रोन या डाई कंट्रोल के लिए 1 एमएल में पीबीएस की इतनी ही मात्रा।
  2. पतला बफर के 1 मिलील में PKH67 या PKH26 डाई के 3 μL पतला और पाइपिंग द्वारा मिश्रण।
  3. पतला sEVs में पतला PKH डाई जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिश्रण। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। डाई नियंत्रण के लिए, पतला डाई को चरण 3.1 से पतला पीबीएस के साथ मिलाएं।
  4. डाई और एसईवी मिश्रण के साथ ट्यूब में पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 2 एमएल जोड़ें और अतिरिक्त डाई को अवशोषित करने के लिए डाई नियंत्रण ट्यूब में।
  5. 1 घंटे के लिए 110,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। सुपरनैंट को त्यागें, पीबीएस के 2 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें, और 1 घंटे के लिए 110,000 × जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस के साथ वॉश दोहराएं और लेबल किए गए एसईवी या डाई कंट्रोल को पीबीएस की बराबर मात्रा में फिर से खर्च करें।
  6. ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा कुल प्रोटीन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करें।

4. न्यूरो-2ए कोशिकाओं द्वारा एसईवी का तेज

  1. 10% एफबीएस और 1% पेन-स्ट्रेप युक्त पूर्ण डीएमईएम माध्यम के कुल 1 मिलीलीटर में प्रत्येक कुएं में 12-वेल प्लेट और प्लेट 10 × 104 न्यूरो-2ए कोशिकाओं में 18-मिमी कवरलिप रखें।
  2. जब सेल में 80-90% क्षमता हो तो माध्यम को डीएमईएम एक्सोसोम-समाप्त माध्यम में बदलें। खुराक और समय पर निर्भर तेज के लिए प्रत्येक कुएं में 1, 5, या 10 माइक्रोग्राम लेबल वाले एसईवी जोड़ें, या डाई नियंत्रण की बराबर मात्रा जोड़ें।

5. प्राथमिक एस्ट्रोसाइटिक संस्कृतियां

  1. जन्म के 4 दिन बाद हाइपोथर्मिया को प्रेरित करके 4 प्रसवोत्तर पिल्ले को एनेस्थेटाइज करें।
  2. 10 एमएम 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल)-1-पिपराज़ीनीथानेसुल्फोनिक एसिड (HEPES) के साथ पूरक बर्फ-ठंड हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) युक्त ६० मिमी पेट्री डिश में दिमाग को इकट्ठा करें ।
  3. दोनों कॉर्टिकल लोब्स को विच्छेदन करें और मेनिंग्स को हटा दें। एक निष्फल ब्लेड के साथ ऊतकों कीमा।
  4. ऊतकों को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें पापिन/डिऑक्सीरिबोक्यूक्लीज आई डिसोशन बफर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट में चक्कर घूमते हैं।
    नोट: 4 माउस कोर्टिस के लिए, एचबीबीएस में 7.5 यू/एमएल पैपिन का 9 एमएल कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय किया जाता है, जो 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, और डिऑक्सीरिबो न्यूक्लियसेज के साथ 0.1 मिलीग्राम/एमएनएल की अंतिम एकाग्रता के साथ मिलाया जाता है।
  5. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और एंजाइम गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें। 5 एमएल ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट और लौ-पॉलिश पाश्चुर पिपेट के साथ ऊतकों को अलग करने के लिए सावधानीपूर्वक ट्रिट करें।
  6. सेल सस्पेंशन को 40 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से पास करें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। मध्यम को एएसपिरेट करें और कोशिकाओं को 75 सेमी2 फ्लास्क में पूर्ण डीएमईएम के 10 एमएल में बीज दें। सुपरनेट माध्यम को चढ़ाना के बाद ताजा डीएमईएम माध्यम 4 घंटे के 15 एमएल के साथ बदलें।
  7. 14 दिनों के बाद,फ्लास्क को एक कक्षीय शेखर में स्थानांतरित करें ताकि माइक्रोग्लिया और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स को 6 घंटे के लिए 320 आरपीएम पर अलग किया जा सके।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेल वियोजन एंजाइम(सामग्री की तालिका) के5 एमसीएल का उपयोग करके शेष एस्ट्रोसाइट्स को ट्रिप्सिनाइज करें। एंजाइमेटिक कार्रवाई को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 × जी पर गोली करें।
  9. कोशिकाओं को पूर्ण डीएमईएम में पुनर्सुइपेंड करें। बीज 5 ×10 4 कोशिकाओं पर 12 मिमी #1.5 एक 24 अच्छी तरह से थाली में कवरलिप ।

6. एस्ट्रोसाइट्स द्वारा SEVs का तेज

  1. जब एस्ट्रोसाइट्स 80-90% की नरमी तक पहुंचते हैं, तो माध्यम को डीएमईएम एक्सोसोम-समाप्त माध्यम में बदल दें।
  2. कोशिकाओं में अवेलेबल, लेबल वाले एसईवी, डाई नियंत्रण की बराबर मात्रा या पीबीएस के 1 माइक्रोग्राम जोड़ें। एसईवी उपचार के बाद 1 घंटे और 24 घंटे धुंधला करने के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. पीबीएस 3x के साथ कोशिकाओं कुल्ला और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबी में 4% पीएफए के साथ उन्हें ठीक।
  2. फिक्स्ड सेल को पीबी के साथ 3 x 5 मिनट धोएं और पीबी में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 का उपयोग करके 10-15 मिनट के लिए और पीबी 3 x 5 मिनट के साथ धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबी में 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें: न्यूरो-2ए कोशिकाओं या ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी, 1:500) के लिए माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2A, 1:500) ताजा 5% एनजीएस/पीबी में रात भर कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. पीबी के साथ 3 x 10 मिनट धोएं और फ्लोरोफोर-कंजूग्ड माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस IgG1, एलेक्सा फ्लोर 594; या बकरी विरोधी माउस आईजीजी एचएंडएल, एलेक्सा फ्लोर 488) 5% एनजी में जोड़ें और एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. पीबी के साथ 3 x 10 मिनट धोएं और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए परमाणु दाग 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के 1 μg/ml के साथ इनक्यूबेट करें । कोशिकाओं को पीबी के साथ 3x फिर से धोएं।
  7. एक एंटीफेड बढ़ते माध्यम का उपयोग कर #1 स्लाइड पर कवरस्लिप माउंट । उन्हें अंधेरे में रात भर सूखने दें, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग तक तैयार ग्लास स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. एसईवी के वीवो तेज में

  1. PBS के 10 माइक्रोन में पुनर्स्थापित या लेबल वाले एसईवी के 5 माइक्रोग्राम के इंट्राथेकल इंजेक्शन को करें, या डाई नियंत्रण के बराबर मात्रा (10 माइक्रोल) (जैसा कि धारा 3 में तैयार किया गया है) C57BL/6 चूहों में।
  2. SEVs के 6 और 18 घंटे के बाद इंजेक्शन के बाद, केटामाइन के १०० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन और जाइलाज़ीन के 10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज करें ।
  3. रक्त को बाहर निकालने के लिए 0.9% खारा के साथ चूहों के इंट्राकार्डियल पर्फ्यूजन करें, इसके बाद हौसले से बनाया गया बर्फ-ठंडा 4% पीएफए/पीबी।
  4. रीढ़ की हड्डी को विच्छेदन करें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए/पीबी में ठीक करें। क्रायो 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबी में 30% सुक्रोज में ऊतकों को सुरक्षित रखें या जब तक ऊतक सिंक न हो जाएं। ऊतकों को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. ओ.C टी कंपाउंड में एल4-एल5 स्पाइनल कॉर्ड को एम्बेड करें। पूरी तरह से जम जाने तक सूखी बर्फ पर फ्रीज करें।
  2. एक क्रायोस्टेट का उपयोग करके 30 माइक्रोन (रीढ़ की हड्डी के लिए क्रॉस-सेक्शनली) पर ऊतकों को अनुभागित करें, और पीबी युक्त 24-अच्छी प्लेट में अनुभागों को एकत्र करें। पीबी में 0.3% ट्राइटन के साथ सेक्शन 3 x 5 मिनट धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 0.3% ट्राइटन/पीबी में 5% एनजी के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करें।
  4. तनु प्राथमिक एंटीबॉडी: एंटी-MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), माइक्रोग्लिया के लिए आईबीए1 (1:2,000) 0.3% ट्राइटन/पीबी में 5% एनजी के साथ, और एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वर्गों को इनक्यूबेट करते हैं।
  5. 0.3% ट्राइटन/पीबी के साथ वर्गों 3 x 5 मिनट धोएं, और माध्यमिक एंटीबॉडी (गधा एंटी-रैबिट आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 488, 1:500, या बकरी एंटी-माउस आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 488, 1:500) में 2 घंटे के तापमान पर 2 घंटे के लिए जोड़ें।
  6. पीबी के साथ 3 x 5 मिनट धोएं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए DAPI के 1 μg/mL में वर्गों को इनक्यूबेट करें । पीबी के साथ सेक्शन 3 x 5 मिनट धोएं।
  7. एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे एक ठीक तूलिका के साथ एक साफ चिपकने वाला स्लाइड(सामग्री की मेज)पर वर्गों माउंट।
  8. बढ़ते माध्यम के साथ कवरस्लिप गीला। कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर इलाज।
  9. संबंधित लेजर के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे छवि।

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Representative Results

अपकेंद्रित्र के माध्यम से रॉ 264.7 वातानुकूलित मीडिया से SEVs के अलगाव के बाद, एनटीए का उपयोग शुद्ध sEVs की एकाग्रता और आकार वितरण को निर्धारित करने के लिए किया गया था। रॉ 264.7-व्युत्पन्न एसईवी का औसत औसत औसत आकार 140 एनएम था, और पीक पार्टिकल का आकार 121.8 एनएम था, इस बात की पुष्टि करता है कि प्रकाश बिखरने वाले माप में अधिकांश पता लगाने योग्य कण 50-150 एनएम(चित्रा 1A)पर एक्सोसोम या एसईवी के आकार सीमा के भीतर गिर गए। जैसा कि एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स 2018 (MISEV2018)23के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी में सुझाव दिया गया है, हमने प्रोटीन के एक सेट का विश्लेषण किया जो अलग ईवी आबादी से मौजूद या बाहर होना चाहिए। एसईवी, सेल lysate, और exo-समाप्त मीडिया के पश्चिमी दाग का प्रदर्शन किया है कि SEV-व्युत्पन्न प्रोटीन नमूनों सेव मार्कर प्रोटीन Alix, सीडी 81, और GAPDH निहित । सेल लिसेट अंश को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम निवासी प्रोटीन, कैल्नेक्सिन से समृद्ध किया गया था, जो एसईवी में अनुपस्थित था। इस प्रकार, कैल्नेक्सिन ने सेलुलर संदूषण(चित्रा 1B)के लिए एक नकारात्मक मार्कर के रूप में कार्य किया।

हमने अगले विट्रो मेंएसईवी तेज के लिए खुराक-प्रतिक्रिया और समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों का प्रदर्शन किया। न्यूरो-2ए कोशिकाओं को 1, 4 और 24 घंटे के लिए PKH67-लेबल sEVs की एकल 1 माइक्रोग्राम खुराक के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था, जिसके बाद SEVs (1, 5, और 10 माइक्रोन) की विभिन्न सांद्रता के तेज की जांच 1 घंटे में की गई थी। एनटीए के परिणामों ने बताया कि औसतन 1 माइक्रोग्राम प्रोटीन ~1 x 109 कणों के बराबर था। समानांतर में, पीबीएस, अवेलेबल sEVs, और डाई-अलोन नियंत्रणों का भी परीक्षण किया गया। हमने देखा कि SEVs का तेज 1 घंटे(चित्रा 2A)और 1, 5, और 10 माइक्रोग्राम SEVs(चित्रा 2B)के लिए हुआ । फ्लोरेसेंस को इनक्यूबेशन के बाद एसईवी(चित्रा 2सी)के 5 और 10 माइक्रोग्राम के लिए 4 घंटे में पता लगाया जा सकता है। इसके बाद, प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स द्वारा PKH26-लेबल वाले SEVs के तेज की जांच की गई(चित्र 3)। प्राथमिक कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स में एसईवी तेज से अधिकतम फ्लोरेसेंस 24 घंटे में हुआ। अवेलेबल SEVs फ्लोरेसेंस नहीं दिखा, प्रदर्शन है कि एसईवी autofluorescence काफी झूठी सकारात्मक(पूरक आंकड़ा S1A) के लिए योगदान नहीं करता है ।

इसके बाद, लेबल किए गए SEVs को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में विभिन्न कोशिकाओं द्वारा sEVs की डिलीवरी और तेज का आकलन करने के लिए चूहों में इंट्राथेकाल इंजेक्शन दिया गया था। हमने मानचित्र 2 के लिए एक न्यूरोनल मार्कर, एक एस्ट्रोसाइटिक मार्कर के रूप में GFAP, और एक माइक्रोग्लियल मार्कर के रूप में IBA1 के लिए दाग दिया। न्यूरॉन्स(चित्रा 4),एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 5),और माइक्रोग्लियल कोशिकाओं(चित्रा 6)सभी PKH26-लेबल sEVs लिया, और अधिकतम एसईवी फ्लोरेसेंस 6 घंटे के बाद इंजेक्शन पर मनाया गया था । जबकि SEVs हमेशा सेलुलर मार्कर के साथ colocalize नहीं था, हम सीएनएस कोशिकाओं द्वारा किसी भी अंतर तेज का पालन नहीं किया । अवेलेबल रॉ 264.7 एसईवी या डाई कंट्रोल के 5 माइक्रोग्राम के साथ इंट्राथेकल इंजेक्शन में महत्वपूर्ण फ्लोरेसेंस(पूरक चित्रा S1B)नहीं दिखा। sEVs(पूरक चित्रा S1C)के इंजेक्शन के बाद 6 एच और 18 घंटे दोनों मेनिंग्स में फ्लोरोसेंट सिग्नल देखे गए।

Figure 1
चित्रा 1:शुद्ध रॉ 264.7 sEVs. (A)आकार और SEVs की एकाग्रता नैनोसाइट NS300 का उपयोग कर निर्धारित किया गया। कणों को ट्रैक किया गया और ब्राउनियन गति और प्रसार गुणांक के आधार पर आकार दिया गया । एसईवी का आकार वितरण एनएम में दिखाया गया है। एसईवी की सांद्रता कणों/एमएल के रूप में व्यक्त की गई थी । (ख)शुद्ध SEVs, सेल लाइसेट, और एक्सोसोम-समाप्त मीडिया से प्राप्त प्रोटीन के पश्चिमी दाग एसईवी मार्कर ALIX, GAPDH, और सीडी 81 का उपयोग कर । एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम प्रोटीन मार्कर, कैल्नेक्सिन, एसईवी तैयारी में सेलुलर संदूषण की निगरानी के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। (ग)ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने एसईवी के आकार और आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया । स्केल बार = 100 एनएम। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; ALIX = अल्फा-1,3/1,6-मैनोसाइलट्रांसफेरेज (एएलजी-2) -इंटरैक्टिंग प्रोटीन एक्स; गपध = ग्लाइफरल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़; सीडी 81 = भेदभाव का क्लस्टर 81. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:न्यूरो-2ए कोशिकाओं द्वारा लेबलेड रॉ 264.7 एसईवी का तेज। (A)PKH67-लेबल sEVs (1 μg) 1, 4, या 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत न्यूरो-2ए कोशिकाओं में जोड़ा गया था। (ख)PKH67-लेबल SEVs (1, 5, या 10 μg) न्यूरो-2ए कोशिकाओं में 1 घंटे के लिए जोड़ा गया था ।(C)PKH67-लेबल sEVs (5 या 10 μg) के लिए न्यूरो-2ए कोशिकाओं में जोड़ा गया था 4 घंटे के लिए sEV तेज सभी खुराक समूहों में देखा गया था । अकेले पीकेएच डाई के साथ इलाज किए गए नकारात्मक नियंत्रण समूहों ने एसईवी स्टेनिंग(पूरक चित्रा S1) नहीं दिखाया। न्यूरो-2ए कोशिकाओं को MAP2A (एलेक्सा फ्लोर 594 के साथ जांच की गई थी, जो लाल रंग में दिखाया गया था), जबकि सेल न्यूक्लियी को डीएपीआई (नीले रंग में दिखाया गया) और PKH67 के साथ SEVs (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ दाग दिया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; MAP2A = माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन 2A; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:प्राथमिक माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स द्वारा PKH26-लेबल RAW 264.7 sEVs का तेज। SEVs का एक μg PKH26 डाई के साथ लेबल किया गया था और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था। एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 1 और 24 घंटे के बाद इसके अलावा SEVs का तेज देखा गया था। एस्ट्रोसाइट्स को GFAP (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई, लाल रंग में दिखाया गया) के साथ दाग दिया गया था, जबकि सेल नाभिक दापी (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ दाग थे, और SEVs पहले PKH26 (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ दाग थे। स्केल बार = 20 μm. PKH26 डाई अकेले सेव धुंधला के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया । संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; GFAP = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:रॉ 264.7 sEVsin न्यूरॉन्स का तेज। PKH26-लेबल sEVs चूहों में इंट्राथेकाली इंजेक्शन थे; 6 और 18 घंटे बाद, चूहों को 4% पीएफए के साथ छिद्रित किया गया था, और रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग कर दिया गया था और 30 माइक्रोन पर खंडित किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को सेल मार्कर (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई, लाल रंग में दिखाया गया) और DAPI परमाणु काउंटरदाग (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ इम्यूनोडाटा हुआ था, जबकि एसईवी को पहले PKH26 (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ लेबल किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को न्यूरॉन्स (लाल) की कल्पना करने के लिए MAP2A के लिए इम्यूनोडांडा हुआ था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विभिन्न समय बिंदुओं पर MAP2A-सकारात्मक न्यूरॉन्स में SEVs दिखाता है। नकारात्मक नियंत्रण, PKH26 डाई अकेले समूह, एसईवी धुंधला नहीं दिखा था । स्केल बार = 20 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; पीएफए = पैराफॉर्मल्डिहाइड; MAP2A = माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन 2A; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:एस्ट्रोसाइट्स में रॉ 264.7 एसईवी का तेज। PKH26-लेबल sEVs चूहों में इंट्राथेकाली इंजेक्शन थे; 6 और 18 घंटे बाद, चूहों को 4% पीएफए के साथ छिद्रित किया गया था, और रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग कर दिया गया था और 30 माइक्रोन पर खंडित किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को सेल मार्कर (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई, लाल रंग में दिखाया गया) और DAPI परमाणु काउंटरदाग (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ इम्यूनोडाटा हुआ था, जबकि एसईवी को पहले PKH26 (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ लेबल किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को एस्ट्रोसाइट्स (लाल) की कल्पना करने के लिए जीएफएपी के लिए इम्यूनोडाड सना हुआ था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी अलग-अलग समय बिंदुओं पर GFAP-सकारात्मक एस्ट्रोसाइट्स में SEVs दिखाता है। नकारात्मक नियंत्रण, PKH26 डाई अकेले समूह, एसईवी धुंधला नहीं दिखा था । स्केल बार = 20 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; पीएफए = पैराफॉर्मल्डिहाइड; GFAP = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:माइक्रोग्लिया में रॉ 264.7 एसईवी का तेज। PKH26-लेबल sEVs चूहों में इंट्राथेकाली इंजेक्शन थे; 6 और 18 घंटे बाद, चूहों को 4% पीएफए के साथ छिद्रित किया गया था, और रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग कर दिया गया था और 30 माइक्रोन पर खंडित किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को सेल मार्कर (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई, लाल रंग में दिखाया गया) और DAPI परमाणु काउंटरदाग (नीले रंग में दिखाया गया) के साथ इम्यूनोडाटा हुआ था, जबकि एसईवी को पहले PKH26 (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ लेबल किया गया था। रीढ़ की हड्डी के खंडों को माइक्रोग्लिया (लाल) की कल्पना करने के लिए आईबीए1 के लिए इम्यूनोडांडा था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विभिन्न समय बिंदुओं पर IBA1-सकारात्मक माइक्रोग्लिया में SEVs दिखाता है । नकारात्मक नियंत्रण, PKH26 डाई अकेले समूह, एसईवी धुंधला नहीं दिखा था । स्केल बार = 20 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; पीएफए = पैराफॉर्मल्डिहाइड; IBA1 = आयनित कैल्शियम-बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S1: प्राथमिक माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स और रीढ़ की हड्डी में लेबल रॉ 264.7 sEVs का तेज। (क)प्राथमिक माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स द्वारा PKH26-लेबल RAW 264.7 sEVs के तेज के लिए नियंत्रण। पीबीएस में अवेलेबल एसईवी का एक माइक्रोन या पीबीएस की बराबर मात्रा एस्ट्रोसाइट्स के संस्कृति माध्यम के समानांतर जोड़ा गया था। पीबीएस और अवेलेबल कंट्रोल के लिए 1 घंटे में कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करते हुए कोई फ्लोरेसेंस नहीं देखा गया । एस्ट्रोसाइट्स को GFAP (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई थी, जो लाल रंग में दिखाया गया था), जबकि नाभिक को डीएपीआई (नीले) के साथ उल्टा किया गया था, और अवेलेबल SEVs को उसी एलेक्सा फ्लोर 546 चैनल के तहत PKH26-लेबल वाले SEVs के रूप में कल्पना की गई थी। स्केल बार = 50 माइक्रोन (बी) वीवो मेंमाउस रीढ़ की हड्डी द्वारा PKH26-लेबल रॉ 264.7 sEVs के तेज के लिए नियंत्रण। अवेलेबल sEVs या डाई नियंत्रण के पांच μg चूहों में इंट्राथेकैलाई इंजेक्शन थे । फिर, फ्लोरोसेंट संकेतों को एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अवेलेबल एसईवी या डाई-अलोन नियंत्रण के लिए नहीं देखा गया। एस्ट्रोसाइट्स को जीएफएपी (एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ जांच की गई थी, जो लाल रंग में दिखाया गया था), जबकि नाभिक को डीएपीआई (नीले) के साथ जवाबी दाग दिया गया था, और अवेलेबल SEVs को उसी एलेक्सा फ्लोर 546 चैनल के तहत PKH26-लेबल एसईवी के रूप में कल्पना की गई थी। स्केल बार = 50 माइक्रोन( सी) प्रतिनिधि छवियां इंट्राथेकल डिलीवरी के बाद माउस स्पाइनल मेनिंग 6 एच और 18 घंटे में रॉ 264.7 एसईवी की उपस्थिति का पता चलता है। SEVs के पांच μg PKH26 डाई (हरे रंग में दिखाया गया) के साथ लेबल किया गया था, और नाभिक DAPI के साथ दाग थे (नीले रंग में दिखाया गया है) । तारांकन पूर्वकाल रीढ़ की हड्डी धमनी का संकेत देते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: sEVs = छोटे बाहुलर वेसिकल्स; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर नमकीन; GFAP = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने पीकेएच रंगों के साथ SEVs की लेबलिंग और रीढ़ की हड्डी में उनके तेज के दृश्य को दिखाया। पीकेएच लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का व्यापक रूप से उपयोग कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 3 ,5, 6 , 12,24,25द्वारा लेबलिंग कोशिकाओं के लिए कियाजाताहै । उनके अपेक्षाकृत लंबे आधे जीवन और कम साइटोटॉक्सिकिटी के कारण, पीकेएच रंगों का उपयोग वीवो और इन विट्रो सेल-ट्रैकिंग अध्ययन26,27में एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है। यद्यपि उत्कृष्ट झिल्ली प्रतिधारण और जैव रासायनिक स्थिरता लाभप्रद है, लेकिन एसईवी के साथ शुद्ध लिपोप्रोटीन संदूषकों के साथ फ्लोरोसेंट जांच का अंतर- एसईवी एसईवी आंतरिककरण और कार्यात्मक अध्ययनों की व्याख्या से समझौता कर सकता है। इस प्रकार, एसईवी का शुद्धिकरण और लेबलिंग प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं क्योंकि संदूषकों के साथ रंगों के हठ से वीवो वितरण28में गलत व्याख्या हो सकती है । कणों की गैर-विशिष्ट लेबलिंग और इन रंगों के लंबे आधे जीवन के कारण झूठे-सकारात्मक फ्लोरेसेंस संकेतों से बचने के लिए नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है ।

लिपोफिलिक रंगों के एकत्रीकरण और मिसेल गठन से भी झूठे संकेत मिल सकते हैं। हम एक डाई अकेले नियंत्रण शामिल है और पहले समय अंक पर EV तेज कल्पना द्वारा मुक्त या अनबाउंड डाई की समस्या का समाधान किया । PKH लेबलिंग के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि SEVs के PKH26 डाई लेबलिंग के दौरान कई PKH26 नैनोकणों का गठन किया जाता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, यह बताया गया है कि PKH26 नैनोकणों को सुक्रोज ढाल29द्वारा हटाया जा सकता है। एक अन्य अध्ययन में एनटीए द्वारा एसईवी के आकार पर पीकेएच लेबलिंग के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया और30के बाद पीकेएच लेबलिंग के बाद आकार में वृद्धि की सूचना दी गई । फिर भी, PKH रंग एक व्यावहारिक और मूल्यवान ट्रेसर के रूप में सेवा करने के लिए दिखाने के लिए जहां SEVs तय किया है । इस अध्ययन की एक और सीमा यह है कि हमने SEVs की मात्रा नहीं दी क्योंकि यह प्रोटोकॉल इंट्राथेकल डिलीवरी के बाद सेलुलर तेज की पुष्टि पर केंद्रित है। उपन्यास साइनिन आधारित झिल्ली जांच हाल ही में आकार में फेरबदल या कलाकृतियों, जैसे PKH नैनोकण31के गठन के रूप में कलाकृतियों पैदा करने के बिना SEVs के अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए विकसित किया गया है, और निस्संदेह भविष्य लेबलिंग अध्ययन में सुधार होगा ।

यद्यपि मैक्रोफेज न्यूरोइनफ्लेमेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, वे एक्सोसोम्स32के माध्यम से अपने कार्गो को वितरित करके न्यूरोप्रोटेक्टिव कार्य भी करते हैं। हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि लेबल मैक्रोफेज-व्युत्पन्न sEVs न्यूरो-2ए कोशिकाओं, प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स, और काठ रीढ़ की हड्डी में इंट्राथेकल प्रशासन के बाद लिया जाता है । परिणामों से संकेत मिलता है कि एक लंबा इनक्यूबेशन समय कम एसईवी संकेत तीव्रता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो संस्कृति३३, ३४में न्यूरो-2ए कोशिकाओं द्वारा SEVs या सेल डिवीजन के क्षरण के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । हालांकि कम थ्रूपुट, रीढ़ की हड्डी में लेबल किए गए एसईवी की कल्पना के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रारंभिक सत्यापन अध्ययनों के लिए किया जा सकता है जो SEVs के कार्यात्मक प्रभाव की जांच करने से पहले एसईवी तेज की पुष्टि करता है। जैसा कि हमने कई सीएनएस सेल प्रकारों में आम तौर पर समान एसईवी तेज देखा, तेज प्रक्रिया गैर-चयनात्मक प्रतीत होती है। यदि ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में एक मुद्दा है, तो ऊतकों और संस्कृतियों की इमेजिंग के दौरान एसईवी ऑटोफ्लोरेसेंस को नकारना करने के लिए अवेलेबल एसईवी का उपयोग अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। यद्यपि खुराक और एसईवी के प्रशासन का मार्ग जैव वितरण11के पैटर्न को प्रभावित कर सकता है, इस प्रोटोकॉल को एसईवी तेज के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। एसईवी की जांच करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण और विभिन्न इमेजिंग रणनीतियों को नियोजित किया जा रहा है, और इन्हें एसईवी2के वीवो ट्रैकिंग में लगातार परिष्कृत और अनुकूलित किया जा रहा है।

इस प्रोटोकॉल के लिए सिर्फ एक दृष्टिकोण सेव तेज की पुष्टि करने के लिए होती है । सभी प्रोटोकॉल के साथ, मल्टीमॉडल दृष्टिकोण का उपयोग करके क्रॉस-वैलिडेशन फायदेमंद हो सकता है। विशेष रूप से, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं और ऊतकों को बायोमॉलिक्यूलर कार्गो हस्तांतरण की जांच करके SEVs के तेज की पुष्टि की जा सकती है। यदि अन्वेषक वितरित SEVs की miRNA संरचना जानता है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सेव हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में miRNA परिवर्तन के लिए जांच या miRNAs स्थानांतरित के लिए लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन का निर्धारण किया जाएगा । पीबीएस-उपचारित नमूनों को इस दृष्टिकोण के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस अवधारणा का समर्थन करते हैं कि मैक्रोफेज-व्युत्पन्न एसईवी को सीएनएस कोशिकाओं इन विट्रो और वीवो द्वारालिया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग रीढ़ की हड्डी के विकारों, दर्द और सूजन में SEVs की भूमिका की जांच करने और यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या एसईवी को चिकित्सीय छोटे अणुओं, आरएनए और प्रोटीन के वितरण के लिए सेलुलर वाहनों के रूप में विकसित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनआईएच एनआईएनडीएस R01NS102836 और पेंसिल्वेनिया डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ कॉमनवेल्थ यूनिवर्सल रिसर्च एन्हांसमेंट (इलाज) से मिलेना के अजीत को दिए गए अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ ब्राडली नैश का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters MilliporeSigma Z677094
Anti-Alix Antibody Abcam ab186429 1:1000
Anti-Calnexin Antibody Abcam Ab10286 1:1000
Anti-CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-166029 1:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) Cell Signaling Technology 2118 1:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Sigma-Aldrich MAB360 1:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 Antibody Wako 019-19741 1:2000
Anti-MAP2A Antibody Sigma-Aldrich MAB378 1:500
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332
Cell Strainer, 40 μm VWR 15-1040-1
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3118-0050 12,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72222-01
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG 1 µg/mL
DC Protein Assay Bio-Rad 500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I) MilliporeSigma D4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcam ab16284 1:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21206 1:500
Double Frosted Microscope Slides, #1 Thermo Scientific 12-552-5
DPBS without Calcium and Magnesium Corning 21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Gibco A27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
FluorChem M imaging system ProteinSimple
FV3000 Confocal Microscope Olympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) Abcam ab6789 1:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 1:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21125 1:500
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) VWR 02-0121
HEPES Gibco 15630080
HRP Substrate Thermo Scientific 34094
Intercept blocking buffer, TBS LI-COR Biosciences 927-60001
Laemmli SDS Sample Buffer Alfa Aesar AAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1 VWR 48404-454
Microm HM550 Thermo Scientific
NanoSight NS300 system Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 software Malvern Panalytical
Neuro-2a Cell Line ATCC CCL-131
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
O.C.T Compound Sakura Finetek 4583
Papain Worthington Biochemical Corporation NC9597281
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PKH26 Sigma-Aldrich MINI26-1KT
PKH67 Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 1862209
PVDF Transfer Membrane MDI SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell Line ATCC TIB-71
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Sodium Chloride AMRESCO 0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold Slides Thermo Scientific 15-188-48 adhesive slides
T-75 Flasks Corning 431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope FEI Company
TEM Grids Electron Microscopy Sciences FSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12% Invitrogen XP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC26755
Tris-Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
TrypLE Express Gibco 12605028 cell dissociation enzyme
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Trypsin, 0.25% Corning 25-053-CL
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Ultracentrifuge Tubes Beckman 344058 110,000 x g

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 171 एक्सेसेलुलर वेसिकल्स एक्सोसोम्स पीकेएच रंग रीढ़ की हड्डी मैक्रोफेज-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स एस्ट्रोसाइट्स न्यूरॉन्स माइक्रोग्लिया
फ्लोरोसेंट का तेज छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स <em>इन विट्रो</em> और स्पाइनल कॉर्ड में लेबल किया गया
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Gupta, R., Luo, X., Lin, Z., Tian, Y., Ajit, S. K. Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord. J. Vis. Exp. (171), e62537, doi:10.3791/62537 (2021).

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