Summary
マクロファージ由来の小細胞外小胞にPKH色素を標識し、髄腔内送達後の インビトロ および脊髄での取り込みを観察するプロトコルについて述べています。
Abstract
小細胞外小胞(sEV)は、全ての細胞によって分泌され、体液中に存在する50〜150nmの小胞である。sEVは、RNA、タンパク質、脂質などの生体分子をドナーからアクセプター細胞に移し、細胞間の主要なシグナル伝達メディエーターを作ります。中枢神経系(CNS)では、sEVは神経免疫相互作用を含む細胞間シグナル伝達を媒介することができる。sEV機能は 、in vitro と in vivoの両方のレシピエント細胞におけるラベル付きSEVの取り込み追跡によって研究することができます。本論文では、PKH膜色素を用いたRAW 264.7マクロファージ細胞のコンディション媒体からのsEVの標識について説明する。これは、Neuro-2a細胞と一次アストロサイトによって複数の時点で標識されたSEVの異なる濃度の取り込み を示しています。また、共焦点顕微鏡で可視化されたマウス脊髄ニューロン、アストロサイト、およびミクログリアでの脳内に送達されたsEVの取り込みも示されている。代表的な結果は、異なる細胞によるsEvの取り込みにおける時間依存的な変動を示し、脊髄へのsEv送達の成功を確認するのに役立つ。
Introduction
小細胞外小胞(sEV)は、50〜150nmのサイズ範囲を有するナノサイズの膜由来小胞である。それらはマルチ・シツル体(MVB)に由来し、MVBと原形質膜の融合時に細胞から放出される。sEVは、miRNA、mRNA、タンパク質、および生理活性脂質を含み、これらの分子は細胞間で細胞間通信の形で伝達される。sEVは、さまざまなエンドサイトー経路によってレシピエント細胞によって内部化することができ、そしてこのレシピエント細胞によるsEVの捕捉は、EVと標的細胞の両方の表面分子の認識によって媒介される1。
sEVは、アクセプター細胞の分子および表現型の変化を引き起こす能力、治療剤としての有用性、および貨物分子または薬理学的薬剤のキャリアとしての可能性のために関心を集めています。そのサイズが小さいため、sEvのイメージングとトラッキングは、特に 生体内 研究や臨床現場では困難です。したがって 、vitro および in vivo2でのバイオディストリビューションと追跡を支援するために、多くの方法が開発され、sEVを画像化しています。
sEV生体分布と標的細胞相互作用を研究する最も一般的な技術は、蛍光色素分子3、4、5、6、7でそれらを標識することを含む。EVは、最初は細胞を画像化するために一般的に使用された細胞膜色素で標識されました。これらの蛍光色素は、一般に、sEv上の目的とする脂質二重層またはタンパク質を染色する。いくつかの親油性染料は、DiR(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′、3'テトラメチル酸トリカルボシアニンヨウ化物)、DiL(1、 1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3',3'テトラメチル中カルボシアニン過塩素酸塩)およびDiD(1,1′ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン4-クロロベンゼンスルホナテン酸塩)8,9,10,11.
PKH67やPKH26などの他の親油性染料は、蛍光性の高い極性ヘッド基と、任意の脂質構造に容易に補間し、長期の色素保持および安定な蛍光12をもたらす長い脂肪族炭化水素尾を有する。PKH色素はまた、VIVO13でEV特性の研究を可能にするEVにラベルを付けることができます。他の多くの色素は、脂質標識染料14およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)15、16およびカルセインアセトキシメチル(AM)エステル17のような細胞透過性染料を含む、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いてエキソソームを観察するために使用されてきた。
CNSにおける異なる細胞間のsEV媒介性クロストークの研究は、神経炎症性および神経変性疾患の病因に関する重要な洞察を提供した。例えば、ニューロンからのsEVは、β-アミロイドペプチドおよびリン酸化タウタンパク質を広め、アルツハイマー病19の病因を助けることができる。さらに、赤血球由来のEVは、大量のα-シヌクレインを含み、血液脳関門を越え、パーキンソン病変20に寄与する。sEVが生理学的障壁21 を横断し、生体分子を標的細胞に移す能力は、治療薬をCNS22に送達するための便利なツールとなる。
脊髄内の無数のCNS細胞によるsEV取り込みの視覚化は、様々な細胞源からの外因的に投与されたSEvの治療上の利点の評価と共に、機械学的研究を可能にする。本論文では、マクロファージ由来のsEvにラベルを付け、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトによる腰椎脊髄における インビトロ および インビボで の取り込みを画像化し、可視化によるsEV送達を定性的に確認する方法論を説明する。
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Protocol
注:すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ドレクセル大学医学部の施設動物ケア&使用委員会によって承認されました。時限妊娠CD-1マウスは、アストロサイシン培養のために使用され、すべてのダムは含浸後15日後に受け取られた。12週齢のC57BL/6マウスを 生体内 取り込み実験に使用した。
1. RAW 264.7 マクロファージ細胞からのsEvの分離
- 10%のエキソソーム枯渇ウウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペンストレップ)を含むDMEMエキソソーム枯渇培地中の75cm2フラスコの培養生264.7細胞を24〜48時間培養する。
- 300 mL のコンディション中ミディアムと遠心分離機を 300 × g で 4 °C で 10 分間収集します。
- 上清と遠心分離機を2,000×gで20分間4°Cで回収します。
- 上清を遠心管に移し、遠心分離機を4°Cで12,000×gで35分間移動します。
- 上清を収集し、0.22 μmのシリンジフィルターを通してフィルターを取ります。
- 超遠心チューブと遠心分離機に、4°Cで110,000×gで80分間移します。
- 上清(エキソソーム枯渇培地)を保存し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の2mLでペレットを再懸濁し、遠心分離機を110,000×gで4°Cで1時間保存します。
- ナノ粒子追跡解析(NTA)および透過電子顕微鏡(TEM)またはウェスタンブロッティング用の放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを使用して、さらに特性評価のためにPBSの100 μLでペレットを再懸濁します。
2. SEVの特徴付け
- ナノ粒子追跡解析(NTA)
注:RAW 264.7細胞からの精製されたSEVのサイズ分布と粒子数/濃度をNTAで測定しました。- フィルター処理されたPBSでsEvを希釈して、最適な追跡のために視野ごとに20〜60個の小胞を得る。
- 一定の流量のシリンジポンプを使用して、希釈したサンプルをフローセルに導入します。
- 30 s の 3-5 ビデオを撮影します。シャッタースピードとゲインを設定し、カメラの設定を手動で絞り込んで、表示可能で追跡および解析できる小胞の最大数を設定します。
- 各記録間でサンプルを進めて、複製測定を行います。NTA取得後の設定を最適化し、サンプル間の設定を一定に保ちます。
- NTAソフトウェアを使用して各ビデオを分析し、小胞の平均サイズと濃度を取得します。
- 一貫性を保つ、同一のシステム設定ですべてのNTA測定を実行します。
- ウェスタンブロット
- メーカーの指示に従ってタンパク質アッセイキットを使用して、sEV、細胞ライゼ、エキソソーム枯渇培地中のタンパク質総量を定量化します。
- 細胞ライセート調製のために、生264.7細胞を75cm2フラスコで80〜90%コンフルエントになるまで培養する。0.25%のトリプシンで細胞を10〜15分間取り外し、培養培地でトリプシンを中和し、400×gで5分間回転させて細胞をペレット化します。新鮮な成長培地で細胞を再懸濁します。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、1×106細胞を別のチューブに移します。上記と同じ遠心分離条件を使用してPBSで細胞を2回洗浄し、最終的なスピンから細胞ペレットに50μLのリシスバッファー(プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたRIPAバッファー)を加えます。
- 細胞を渦を起させ、20分間氷の上に置きます。混合物を4°Cで30分間10,000×gで遠心分離し、上清(すなわち、ライセート)を新鮮なマイクロ遠心チューブに集め、使用するまで−80°Cに保ちます。
- エキソソームで枯渇した培地2 mLを、3 kDaカットオフ遠心フィルターを使用して100 μLに濃縮してから、タンパク質の量を定量化します。sevとリシスバッファーを1:1比、渦を30 sで混合し、氷上で15分間インキュベートしてタンパク質の量を定量化します。
- sEVのタンパク質(2 μg)、RAW 264.7細胞リセート、エキソソーム枯渇培地をサンプルバッファーを減らして混合します。
- 95°Cで5分間サンプルを変性させ、5分間氷の上に置き、10,000×gで2分間回転 させます。サンプルを12%トリスグリシンプロテインゲルにロードし、125 Vで45分間ゲルを実行します。
- 25Vで25時間、ポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜にタンパク質を移します。
- 転写後、ブロックバッファー( 材料表を参照)を使用して、PVDF膜を室温で1時間ブロックします。
- 一次抗体を一晩4°Cでシェーカーにインキュベートします。
注:使用された一次抗体は、抗CD81(1:1,000)、抗α-1,3/1,6-マンノシルトランスフェラーゼ(ALG-2)相互作用タンパク質X(Alix)(1:1,000)、抗カルネキシン(1:1,000)、抗グリセアルデヒド3-デアス水素(GAP)でした。 - ブロット3 x 15分を1xトリス緩衝生理食い、0.1%トゥイーン20(TBST)で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-わさびペルオキシダーゼ(HRP)またはロバ抗ウサギIgG-HRPコンジュゲート二次抗体(1:10,000)で室温でインキュベートします。
- ブロットを1x TBSTで3 x 15分洗い、HRP基質を使用してタンパク質を検出します。
- ウェスタンブロットイメージャーを使用して、強化された化学発光によってブロットを分析します。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)
- 0.1 Mリン酸緩衝液(PB)に2%パラホルムアルデヒド(PFA)でそれらを再懸濁させることによってsEVを修正します。2 x 15 s の渦。
- きれいなパラフィルムに10 μLのsEV懸濁液を置きます。カーボンコーティングされたフォームバーグリッドを、コーティングされた側がサスペンションに向けてドロップに浮かべる。乾燥した環境で20分間膜を吸収させます。
- PBの滴下にグリッド(膜側を下)を置き、3 x 2分間洗浄します。
- グリッドを5分間1%グルタルアルデヒドの50 μLに移します。
- 100 μLの蒸留水で8 x 2分間洗浄します。
- 2分間、1%のウラニル酢酸の滴にグリッドを配置することにより、サンプルを対比します。
- パラフィルムで覆われた氷皿に2%メチルセルロース溶液を2%のメチルセルロース溶液と0.2%の酢酸の50 μLでサンプルを埋め込みます。
- ステンレス鋼のループを使用してグリッドを保持し、フィルターペーパーで余分な流体を除去します。
- ループに残った状態で10分間グリッドをエアドライします。
- 透過型電子顕微鏡で80kVで観察します。
3. sEVのラベリング
- 20 μgのsEVを1 mLの希釈液バッファーまたは同じ量のPBSで1 mLの希釈して、希釈液バッファーの1 mLで色素制御を行います。
- PKH67またはPKH26染料3μLを1mLの希釈液バッファーで希釈し、ピペットで混合します。
- 希釈したSEVに希釈したPKH染料を加え、ピペットで混ぜます。暗い温度で5分間インキュベートします。染料コントロールの場合は、ステップ3.1から希釈したPBSと希釈した色素を混合します。
- PBSに1%のウシ血清アルブミン(BSA)の2mLを、色素とsEVミックスを用いたチューブに加え、色素を過剰に吸収するコントロールチューブに添加します。
- 遠心分離機は4°Cで110,000×gで1時間用いた。 上清を捨て、2mLのPBSでペレットを再懸濁し、遠心分離機を4°Cで110,000×gで1時間停止する。 PBSで洗浄を繰り返し、PBSの等容数でラベル付きのsEVまたは色素制御を再中断します。
- ブラッドフォード法により総タンパク質の量を定量化します。
4. 神経-2a細胞によるSEVの取り込み
- 12ウェルプレートに18mmのカバーリップを入れ、10ウェル×10個 のニューロ2a細胞を各ウェルに10%FBSと1%のペンストレップを含む完全なDMEM培地の合計1mLで10個のニューロ-2a細胞を入れます。
- 細胞の合流率が80〜90%の場合、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。線量と時間依存の取り込みのために1、4、24時間の各ウェルに1、5、または10μgの標識されたSEVを加えるか、等量の色素制御を加えます。
5. 主要な占星術文化
- 出生後4日に低体温症を誘発して4人の出生後の子犬を麻酔する。
- 氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含む60mmペトリ皿に脳を集め、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を補います。
- 両方の皮質葉を解剖し、髄液を取り除く。殺菌された刃でティッシュをミンチする。
- 組織をパパイン/デオキシリボヌクレアーゼI解離緩衝液を含む15mL円錐管に移し、37°Cで20分間インキュベートする。 5分ごとに旋回します。
注:4つのマウスコルチスの場合、HBSSの7.5 U/mLパパインの9 mLは、少なくとも30分間37°Cで活性化され、0.22 μmのシリンジフィルターを通して濾過され、デオキシリボヌクレアーゼIと混合して0.1mg/mLの最終濃度にします。 - 上清を吸引し、5 mLの完全なDMEMを加えて酵素活性を不活性化する。慎重に5 mLガラス血清ピペットと炎で磨かれたパスツールピペットで組織を解体するためにトリチュレート。
- 細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通し、4°Cで5分間250×gで遠心分離します。 培地を吸引し、完全なDMEMの10mLで細胞を75cm2フラスコに播種する。清澄培地は、めっき後4時間で新鮮なDMEM培地の15mLに交換してください。
- 14日間のインビトロの後、フラスコを軌道シェーカーに移し、ミクログリアとオリゴデンドロサイトを320rpmで6時間取り外します。
- 残りのアストロサイトを、細胞解離酵素(材料表)の5 mLを用いて、37°Cで10分間トリプシン化する。 5 mLの完全なDMEMを加えて酵素作用を不活性化し、4°Cで5分間250×gで細胞をペレット化します。
- 完全な DMEM でセルを再中断します。シード5×12mm #1.5のカバーリップに10個の4 個の細胞を24ウェルプレートに入れます。
6. アストロサイトによるSEVの取り込み
- アストロサイトが80-90%の合流率に達したら、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。
- ラベルなしのラベル付きのsEV、等量の色素制御、またはPBSを細胞に1μg加えます。sEV処理後1時間24時間染色用の細胞を使用してください。
7. 免疫蛍光
- 細胞をPBS 3xで洗い、室温で10分間PBで4%PFAで固定します。
- 固定細胞をPBで3 x 5分洗い、0.1%トリトンX-100をPBで10〜15分間透過させ、PB 3 x 5分で洗浄します。
- 室温で1時間PBで5%正常ヤギ血清(NGS)を有する細胞をブロックする。
- 一次抗体で細胞をインキュベートする:微小管関連タンパク質2(MAP2A、1:500)のニューロ-2a細胞またはグリア細動酸性タンパク質(GFAP、1:500)の一次アストロサイトの一次アストロサイトの新鮮な5%NGS/PBの一晩穏やかな揺れを伴う。
- PBで3 x 10分を洗浄し、5%NGSでフルオロフォア共役二次抗体(ヤギアンチマウスIgG1、アレクサフルオール594;またはヤギアンチマウスIgG H&L、アレクサフルーター488)を追加し、ロッカーの室温で2時間インキュベートします。
- 3 x 10分をPBで洗浄し、1 μg/mLの核染色4',6-ジミディノ-2フェニリンドール(DAPI)を室温で10分間インキュベートします。PBで細胞を再び3倍洗います。
- アンチフェードマウントメディアを使用して、カバーリップを#1スライドに取り付けます。暗闇の中で一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡でイメージングするまで4°Cで準備されたガラススライドを保管します。
8. インビボ の取り込み
- 5 μgの非標識または標識されたsEVを10 μLのPBSに再懸濁し、または等容積(10 μL)の色素制御(セクション3で作成)をC57BL/6マウスに注入します。
- sEvの6時間および18時間後に、ケタミンの100mg/kg体重および10mg/kg体重のキラジンの腹腔内注射によってマウスを深く麻酔する。
- 血液を洗い流すために0.9%生理食音でマウスの心内灌流を行い、続いて作りたての氷冷4%PFA/PBを行う。
- 脊髄を解剖し、4°Cで4%PFA/PBに24時間固定する。PB中の30%スクロースで24時間または組織が沈むまで4°Cで組織を凍結保護します。免疫組織化学まで4°Cで組織を保管してください。
9. 免疫検査
- O.C T化合物にL4-L5脊髄を埋め込む。完全に固まるまでドライアイスで凍結します。
- クライオスタットを使用して30μm(脊髄の断面)で組織を切り離し、PBを含む24ウェルプレートにセクションを集める。PBで0.3%トリトンでセクション3 x 5分を洗います。
- 5%NGSを有する非特異的結合部位を0.3%のトリトン/PBで2時間室温でブロックする。
- 希薄な一次抗体:抗MAP2A(1:500)、GFAP(1:1,000)、Iba1(1:2,000)、0.3%トリトン/PBで5%NGSを有し、シェーカー上の4°Cで一晩4°Cで切片をインキュベートする。
- セクション3 x 5分を0.3%トリトン/PBで洗浄し、二次抗体(ロバアンチラビットIgGアレクサフルオール488、1:500、またはヤギアンチマウスIgGアレクサフルオール488、1:500)を室温で2時間NGS/PBで2時間追加します。
- PBで3 x 5分洗浄し、DAPIの1μg/mLで室温で10分間インキュベートします。PBで3×5分のセクションを洗います。
- 細かい絵筆を光顕微鏡で、清潔な粘着スライド(材料表)に取り付けます。
- 取り付け媒体でカバースリップを濡らします。室温で暗闇の中で一晩硬化します。
- それぞれのレーザーを用いて共焦点顕微鏡の下での画像。
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Representative Results
遠心分離を介してRAW 264.7コンディショムドメディアからsEvを分離した後、NTAを使用して精製されたSEVの濃度およびサイズ分布を決定しました。RAW 264.7由来のsEVの平均平均サイズは140nmであり、ピーク粒子サイズは121.8nmであり、光散乱測定における最も検出可能な粒子が50〜150nmのエキソソームまたはsEvのサイズ範囲内に収まっていることを確認した(図1A)。細胞外小胞2018(MISEV2018)23の研究のための最小限の情報で示唆されているように、我々は、異なるEV集団から存在または除外されるべきタンパク質のセットを分析した。sEV、細胞ライセート、およびエキソ枯渇培地のウェスタンブロッティングは、sEV由来タンパク質サンプルにsEVマーカータンパク質アリックス、CD81、GAPDHが含まれていることを実証した。細胞ライセート分率を、sEVに存在しなかった小胞体含量タンパク質、カルネキシンで濃縮した。したがって、カルネキシンは細胞汚染の陰性マーカーとして役立った(図1B)。
次に、試験的に用量応答と時間経過実験を行い 、vitroでsEV取り込み実験を行いました。ニューロ2a細胞を1、4、24時間のPKH67標識sEVの単一の1μg用量でインキュベートし、その後、異なる濃度のsEV(1、5、および10μg)を1時間で調べた。NTAの結果は、平均1μgのタンパク質が〜1×109粒子 に等しいことを示した。並行して、PBS、非ラベル付きSEV、および色素単独制御も試験した。sEVの取り込みは1時間(図2A)と1、5、10μgのSEV(図2B)で起こったことを観察しました。5 μg および 10 μg の sEV (図2C)ポストインキュベーションの場合、蛍光は 4 時間で検出されました。次に、プライマリアストロサイトによるPKH26標識sEVの取り込みについて検討した(図3)。原発皮質アストロサイトにおけるsEV取り込みからの最大蛍光は24時間で起こった。非標識sEVsは蛍光を示さなかったので、sEV自己蛍光が偽陽性に有意に寄与しないことを示した(補足図S1A)。
次に、標識されたsEvをマウスに注入し、免疫細胞化学と共焦点顕微鏡を用いて脊髄内の異なる細胞によるsEVの送達と取り込み量を評価した。ニューロンマーカーとしてMAP2、アストロサイズマーカーとしてのGFAP、ミクログリアマーカーとしてのIBA1に染色した。ニューロン(図4)、アストロサイト(図5)、およびミクログリア細胞(図6)はすべてPKH26標識sEVを取り上げ、6時間の注射時に最大sEV蛍光が観察された。sEVは細胞マーカーと常に同局化したわけではありませんが、CNS細胞による差動の取り込みは見ませんでした。5 μgの未標識RAW 264.7 sEVまたは色素制御を有する内皮注射は有意な蛍光を示さなかった(補足図S1B)。蛍光シグナルは、sEvの注入後6時間および18時間の両方の髄膜で観察された(補足図S1C)。
図1: 精製されたRAW 264.7 sEVの特性評価(A)SEVのサイズと濃度をNanoSight NS300を用いて決定した。粒子はブラウン運動と拡散係数に基づいて追跡され、サイズが決定された。sev のサイズ分布は nm で示されています。sevの濃度は粒子/mLとして表された。(B) SEVマーカーALIX、GAPDH、およびCD81を用いた精製セブ、細胞リセート、エキソソーム枯渇培地に由来するタンパク質のウェスタンブロット。小胞体タンパク質マーカーであるカルネキシンは、sEV調製物における細胞汚染を監視する制御として機能する。(C) 透過型電子顕微鏡は、SEVの大きさと形態を実証した。スケール バー = 100 nm。略語: sEV = 小細胞外小胞;ALIX = アルファ-1,3/1,6-マンノシルトランスビシラーゼ (ALG-2)相互作用タンパク質 X;GAPDH = グリセアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素;CD81 = 分化 81 のクラスター。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ニューロ2a細胞によるRAW 264.7 sEVの取り込み(A)PKH67標識sEV(1μg)を培養したニューロ2a細胞に1、4、または24時間のsEV取り込みについて加え、共焦点顕微鏡で全ての時間ポイントで観察した。(B)PKH67標識sEV(1、5、または10μg)をニューロ-2a細胞に1時間添加した(C)PKH67標識sEV(5または10μg)を4時間細胞に添加し、4時間sEV取り込みについて、4時間のsEV取り込み全ての投薬群で観察した。PKH色素単独で処理した陰性対照群は、sEV染色を示さなかった(補足図S1)。ニューロ2a細胞をMAP2A(赤で示すアレクサ・フルオール594でプローブ)で免疫染色し、細胞核をDAPI(青色で示す)とPKH67(緑色で示す)でsEVで染色した。スケールバー= 50 μm略語: sEV = 小細胞外小胞;MAP2A = 微小管関連タンパク質 2A;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 一次マウス皮質アストロサイトによるPKH26標識RAW 264.7 sEVの取り込み 1 μgのsEVをPKH26色素で標識し、一次アストロサイト培地に添加した。sEvの取り込みは、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて1時間および24時間後に観察した。アストロサイトはGFAP(赤で示されたアレクサ・フルオール488でプローブ)で染色され、細胞核はDAPI(青色で示される)で対抗され、sEVは以前PKH26(緑色で示す)で染色された。スケールバー= 20 μm. PKH26染料単独は、sEV染色の負のコントロールとして役立った。略語: sEV = 小細胞外小胞;GFAP = グリア性フィブリル酸タンパク質;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:RAW 264.7 sEVinニューロンの取り込み PKH26標識sEVはマウスに内テカリーを注入した。6および18時間後、マウスを4%PFAで穿ファションし、脊髄を単離し、30μmで切除した。脊髄切片は細胞マーカー(赤で示されるアレクサ・フルオール488でプローブ)とDAPI核カウンターステイン(青色で示される)で免疫染色され、sEVは以前PKH26(緑色で示される)で標識されていた。脊髄切片は、MAP2Aがニューロンを可視化するために免疫染色された(赤色)。共焦点顕微鏡は、異なる時点でMAP2A陽性ニューロンのsEVを示す。負の対照、PKH26色素単独群は、sEV染色を示さなかった。スケールバー= 20 μm略語: sEV = 小細胞外小胞;PFA = パラホルムアルデヒド;MAP2A = 微小管関連タンパク質 2A;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: アストロサイトにおけるRAW 264.7 sEVの取り込みPKH26標識sEVはマウスに内テカリーを注入した。6および18時間後、マウスを4%PFAで穿ファションし、脊髄を単離し、30μmで切除した。脊髄切片は細胞マーカー(赤で示されるアレクサ・フルオール488でプローブ)とDAPI核カウンターステイン(青色で示される)で免疫染色され、sEVは以前PKH26(緑色で示される)で標識されていた。脊髄切片は、GFAPがアストロサイトを可視化するために免疫染色された(赤色)。共焦点顕微鏡は、異なる時点でGFAP陽性アストロサイトのsEVを示す。負の対照、PKH26色素単独群は、sEV染色を示さなかった。スケールバー= 20 μm略語: sEV = 小細胞外小胞;PFA = パラホルムアルデヒド;GFAP = グリア性フィブリル酸タンパク質;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: ミクログリアにおけるRAW 264.7 sEVの取り込み PKH26標識sEVはマウスに内テカリーを注入した。6および18時間後、マウスを4%PFAで穿ファションし、脊髄を単離し、30μmで切除した。脊髄切片は細胞マーカー(赤で示されるアレクサ・フルオール488でプローブ)とDAPI核カウンターステイン(青色で示される)で免疫染色され、sEVは以前PKH26(緑色で示される)で標識されていた。脊髄切片は、ミクログリア(赤色)を可視化するためにIBA1のために免疫染色した。共焦点顕微鏡は、異なる時点でIBA1陽性ミクログリアのsEvを示す。負の対照、PKH26色素単独群は、sEV染色を示さなかった。スケールバー= 20 μm略語: sEV = 小細胞外小胞;PFA = パラホルムアルデヒド;IBA1 =イオン化カルシウム結合アダプタ分子 1;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:一次マウス皮質アストロサイトおよび脊髄における標識RAW 264.7 sEvの取り込み。 (A) 一次マウス皮質アストロサイトによるPKH26標識RAW 264.7 sEvの取り込み制御。PBSまたはPBSの等しい量で再懸濁された非ラベル付きのsEVの1μgは、アストロサイトの培養培地と並行して添加した。PBSでは1時間で蛍光を観測し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた非標識制御を行った。アストロサイトはGFAP(赤で示されたアレクサ・フルオール488でプローブ)で染色され、核はDAPI(青)で対抗され、ラベルなしのsEVはPKH26標識sEVと同じAlexa Fluor 546チャネルの下で視覚化された。スケールバー = 50 μm(B) マウス脊髄によるPKH26ラベルRAW 264.7 sEVの取り込み制御5 μgの非標識 sEV または色素制御を、マウスにイントラテカリーを注入した。再び、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた非標識sEVまたは色素単独制御については、蛍光シグナルは認められなかった。アストロサイトはGFAP(赤で示されたアレクサ・フルオール488でプローブ)で染色され、核はDAPI(青)で対向し、ラベルなしのsEVはPKH26標識sEVと同じAlexa Fluor 546チャネルの下で視覚化された。スケールバー= 50 μm(C)代表的な画像は、マウス脊髄髄の6時間および18時間の髄腔内送達におけるRAW 264.7 sEVの存在を明らかにします。5 μgのsEVにPKH26色素(緑色で示される)を標識し、核はDAPI(青色で示す)で対数化した。アスタリスクは前脊髄動脈を示す。スケールバー= 50 μm略語: sEV = 小細胞外小胞;PBS = リン酸緩衝生理食塩分;GFAP = グリア性フィブリル酸タンパク質;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、PKH色素によるsEVの標識と脊髄におけるそれらの取り込みの視覚化を示した。PKHの親油性蛍光色素は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡による細胞の標識に広く用いられている3,5,6,12,24,25.比較的長い半減期と低い細胞毒性のために、PKH色素は、生体内およびインビトロ細胞追跡研究26、27の広い範囲に使用することができる。膜保持性と生化学的安定性に優れているが、sEVで精製されたリポタンパク質汚染物質を用いた蛍光プローブのインターカレーションは、sEVの内部化および機能研究の解釈を損なう可能性がある。したがって、sEVの精製および標識は、汚染物質を有する染料の持続性が生体内分布28の誤解釈につながる可能性があるため、プロトコルにおける重要なステップである。コントロールの含めることは、粒子の非特異的な標識とこれらの染料の長い半減期による偽陽性蛍光シグナルを避けるために重要です。
親油性染料の凝集およびミセル形成もまた、偽シグナルを生じ得る。色素単独制御を含め、初期の時点でEV取り込み量を可視化することで、自由または非結合色素の問題に取り組んだ。PKH標識に関して報告される重要な制限は、SEVのPKH26染料標識の間に多数のPKH26ナノ粒子が形成されるということです。このプロトコルには含まれていないが、PKH26ナノ粒子は、ショ糖勾配29によって除去することができることが報告されている。別の研究は、NTAによるsEVのサイズに対するPKHラベリングの効果を評価し、PKHラベル30に続くサイズの増加を報告した。それにもかかわらず、PKH色素は、SEVが横断した場所を示すために実用的で貴重なトレーサーとして機能します。この研究のもう一つの制限は、このプロトコルが、細胞内送達後の細胞取り込みの確認に焦点を当てているため、sEvを定量化しなかったことです。近年、PKHナノ粒子31の形成など、サイズを変えたり、人工物を生成したりすることなく、sEVの高感度蛍光イメージング用に新しいシアニンベースの膜プローブが開発されており、将来の標識研究を改善することは間違いありません。
マクロファージは神経炎症において重要な役割を果たすが、エキソソーム32を介して貨物を送達することによって神経保護機能も発揮する。我々の研究は、標識されたマクロファージ由来のSEVがニューロ2a細胞、一次アストロサイト、および髄内脳内投与後の腰椎において取り上げられることを示している。この結果は、培養33,34におけるNeuro-2a細胞によるsEVまたは細胞分裂の分解に起因する可能性のあるsEV信号強度の低下につながる可能性があることを示している。低スループットではあるが、脊髄の標識されたSEVを可視化するためのこのプロトコルは、sEVの取り込みが確認された初期検証研究に使用され、その後、sEvが内腹に送達した機能的影響を調査する前に行うことができる。いくつかのCNS細胞タイプで一般的に同様のsEV取り込みが観察されたように、取り込みプロセスは非選択的であるように見える。自己蛍光がイメージングの問題である場合、非標識sEVは、組織および培養物のイメージング中にsEV自己蛍光を否定するための追加制御として使用することができます。sEvの投与量および投与経路は、生体分布11のパターンに影響を与える可能性があるが、このプロトコルは、sEV取込の定量分析のために最適化されていない。sEvを調査するためにいくつかの異なるアプローチと様々なイメージング戦略が採用されており、これらはsEV2のin vivoトラッキングのために継続的に洗練され、最適化されています。
このプロトコルは、sEVの取り込み確認のための1つのアプローチに過ぎない。すべてのプロトコルと同様に、マルチモーダルアプローチを使用したクロス検証は有益です。具体的には、レシピエント細胞や組織への生体分子貨物輸送を調査することで、sEVの取り込みが確認できます。研究者が送達されたsEVのmiRNA組成を知っている場合、sEV転移を確認するための別のアプローチは、レシピエント細胞のmiRNA変化をチェックするか、または移されたmiRNAの標的遺伝子の発現レベルの変化を決定することです。PBS処理サンプルは、このアプローチの制御として使用できます。全体として、これらの結果は、マクロファージ由来のSEVが インビトロ および インビボのCNS細胞によって取り込まれるという概念を支持する。このプロトコルは、脊髄障害、疼痛、炎症におけるsEVの役割を調べ、治療用の小分子、RNA、およびタンパク質の送達のための細胞車両としてsEVを開発できるかどうかを判断するために使用できます。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
この研究は、NIH NINDS R01NS102836とペンシルベニア州保健省ユニバーサル研究強化(CURE)からの助成金によって支えられ、シーナ・K・アジットに授与されました。ブラッドリー・ナッシュ博士の原稿の批判的な読み取りに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
