Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла

Published: April 28, 2021 doi: 10.3791/62553
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2,3, 1,2
1Oncology Division, Genome Stability Laboratory, CHU de Québec Research Center, HDQ Pavilion, 2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Laval University Cancer Research Center, 3Oncology Division, CHU de Québec Research Center, CHUL Pavilion
* These authors contributed equally

Summary

В настоящем протоколе мы демонстрируем, как визуализировать двухцепочечную концевую резекцию ДНК во время фазы S/G2 клеточного цикла с использованием метода, основанного на иммунофлуоресценции.

Abstract

Изучение реакции на повреждение ДНК (DDR) является сложной и важной областью, которая стала только более важной из-за использования препаратов, нацеленных на DDR, для лечения рака. Этими мишенями являются поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARPs), которые инициируют различные формы репарации ДНК. Ингибирование этих ферментов с использованием ингибиторов PARP (PARPi) достигает синтетической летальности, придавая терапевтическую уязвимость гомологичным рекомбинационным (HR)-дефицитным клеткам из-за мутаций в раке молочной железы типа 1 (BRCA1), BRCA2 или партнере и локализаторе BRCA2 (PALB2).

Клетки, обработанные PARPi, накапливают двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Эти разрывы обрабатываются механизмом резекции конца ДНК, что приводит к образованию одноцепочечной (ss) ДНК и последующему восстановлению ДНК. В контексте дефицита BRCA1 оживление резекции ДНК посредством мутаций в ингибиторах резекции ДНК, таких как 53BP1 и DYNLL1, вызывает резистентность к PARPi. Поэтому возможность мониторинга резекции ДНК в целлюлозе имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и разработки новых стратегий преодоления резистентности к PARPi. Методы, основанные на иммунофлуоресценции (IF), позволяют контролировать глобальную резекцию ДНК после повреждения ДНК. Эта стратегия требует длинноимпульсной геномной маркировки ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU). После повреждения ДНК и резекции конца ДНК полученная одноцепочечная ДНК специфически обнаруживается анти-BrdU антителом в нативных условиях. Кроме того, резекция ДНК также может быть изучена с использованием маркеров клеточного цикла для дифференциации между различными фазами клеточного цикла. Клетки в фазе S/G2 позволяют изучать конечную резекцию в HR, тогда как клетки G1 могут быть использованы для изучения негомологичного конечного соединения (NHEJ). Подробный протокол для этого метода ПЧ в сочетании с дискриминацией клеточного цикла описан в этой статье.

Introduction

Модуляция факторов репарации ДНК является постоянно развивающимся методом терапии рака, особенно в опухолевых средах с дефицитом репарации ДНК DSB. Ингибирование специфических факторов репарации является одной из гениальных стратегий, используемых для сенсибилизации раковых клеток к агентам, повреждающим ДНК. Десятилетия исследований привели к выявлению различных мутаций генов репарации ДНК в качестве биомаркеров для выбора терапевтической стратегии1. Следовательно, область репарации ДНК стала центром разработки лекарств для обеспечения широкого спектра методов лечения, расширяя возможности концепции персонализированной медицины.

DSB ремонтируются двумя основными путями: NHEJ и HR2. Путь NHEJ подвержен ошибкам, быстро перевязывая два конца ДНК практически без конечной обработки ДНК и включая протеинкиназу (ДНК-PKcs), комплекс Ku70/80, белки 53BP1 и RIF13. Напротив, HR является верным механизмом, инициированным BRCA14. Важным шагом в восстановлении HR является процесс резекции конца ДНК, который представляет собой деградацию сломанных концов, приводящую к одноцепочечной (ss) ДНК с концами 3'-OH. BRCA1 облегчает набор нисходящих белков, которые образуют резектосому MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, которые участвуют в резекции ДНК от 5' до 3'5.

Начальная конечная резекция осуществляется через эндонуклеазную активность MRE11, что позволяет проводить дальнейшую обработку нуклеазами DNA2 и EXO1. Генерируемые свесы ssDNA быстро покрываются репликационным белком A (RPA), чтобы защитить их от дальнейшей обработки. Впоследствии BRCA2, PALB2 и BRCA1 участвуют в опосредовании смещения RPA и сборки нуклеофиламента RAD51, необходимого для механизма репарации, направленного на гомологию. Тонкий баланс между использованием NHEJ и HR необходим для оптимального поддержания геномной целостности. Выбор пути зависит от фазы клеточного цикла. HR предпочтительно используется во время фаз от S до G2, где резекция ДНК находится на самом высоком уровне, а сестринские хроматиды доступны для обеспечения надлежащего восстановления.

Поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP-1) является одним из самых ранних белков, рекрутированных в DSB. Он регулирует как резекционную активность, так и сборку последующих эффекторов, участвующих в NHEJ5,6. PARP-1 также необходим для восстановления одноцепочечного разрыва ДНК во время репликации7,8. Благодаря своей важной роли в восстановлении ДНК, ингибиторы PARP (PARPi) используются в качестве терапии рака. При нескольких раковых заболеваниях с дефицитом HR лечение PARPi приводит к синтетическому летальному ответу из-за неспособности клеток с дефицитом HR восстанавливать накопленный ущерб с помощью альтернативного пути9,10. В настоящее время существует четыре одобренных FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib и Talazoparib (также называемый BMN 673), которые используются для различных методов лечения рака молочной железы и яичников11. Тем не менее, устойчивость к PARPi распространена, и одна потенциальная причина возникает в результате повторного приобретения навыков HR12. Потеря или ингибирование PARP-1 в присутствии облучения дисрегулирует механизм резектосомы, что приводит к накоплению более длинных трактов сдНК13. Поэтому углубленное изучение резекции ДНК in vivo имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и последующей разработки новых стратегий лечения рака и преодоления резистентности к PARPi.

Существует несколько методов, используемых для обнаружения событий резекции ДНК5. Одним из таких методов является классический метод на основе ПЧ, позволяющий косвенно окрашивать и визуализировать резецированную ДНК после вызванного стрессом DSB с использованием антитела против RPA. Маркировка геномной ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU) и обнаружение только ssDNA является прямым измерением событий резекции ДНК. Он обходит мониторинг RPA, который участвует в нескольких клеточных процессах, таких как репликация ДНК. В способе, описанном здесь, клетки, инкубированные с BrdU в течение одного клеточного цикла, позволяют BrdU быть включенным в одну цепь реплицирующейся клеточной ДНК. После резекции окрашивание ПЧ проводят в условиях, допускающих обнаружение BrdU только в форме ssDNA, с использованием антитела против BrdU. Это антитело может получить доступ только к воздействию нуклеотидов BrdU и не будет обнаруживать те, которые интегрированы в двухцепочечную ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии резецированную ДНК можно визуализировать в виде пунктатных очагов BrdU/ssDNA. Ядерная интенсивность этих очагов может быть использована в качестве считывания для количественной оценки резекции после повреждения ДНК. В данной работе описаны пошаговые процессы данного метода, которые могут быть применены к большинству клеточных линий млекопитающих. Этот метод должен иметь широкую полезность как простой способ мониторинга резекции конца ДНК в целлюле, как доказательство концепции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточная культура, обработка и подготовка покровов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные покрытия, трансфекции и обработки, кроме облучения, должны проходить под стерильным капюшоном клеточной культуры.

  1. День 1
    1. В 6-луночной пластине поместите один крышку в каждую скважину для любого количества условий, сколько необходимо. Пластина ~ 150 000 клеток HeLa для трансфекции или медикаментозного лечения, по желанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При трансфекции рекомендуется делать обратную трансфекцию во время покрытия, или можно сделать прямую трансфекцию через несколько часов после покрытия, чтобы обеспечить соблюдение. Обратная трансфекция выполняется путем добавления трансфекционной смеси в крышку перед добавлением ячеек; таким образом, трансфекция начинается до того, как клетки начнут прилипать. Прямая трансфекция, напротив, представляет собой добавление трансфекционной смеси после сцепления с поверхностью обычно на следующий день. Однако это можно сделать в тот же день, при условии, что клеткам будет отведено достаточно времени, чтобы прилипнуть.
    2. Для этого метода используют 4 скважины: Скважина 1: контроль siRNA (называемый siCTRL); Хорошо 2: siRNA против PARP-1 (siPARP-1); Колодец 3: необработанный; Скважина 4: Клетки, подлежащие обработке 5 мкМ BMN673 за 1 ч до облучения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе все испытания проводились в облученных условиях (см. раздел 1.3).
    3. Инкубируйте клетки при 37 °C в 5% увлажненном инкубаторе CO2 в течение ночи, хотя протокол трансфекции допускает до 3 дней инкубации. Время инкубации до обработки BrdU будет зависеть от эффективности трансфекции siRNA. Если трансфекции нет, инкубации в течение 16 ч достаточно, чтобы обеспечить прилипание к покровному листу и некоторый рост клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия инкубатора могут быть изменены в зависимости от используемой клеточной линии.
  2. День 2
    1. Добавляют BrdU в конечной концентрации 10 мкМ в соответствующих культивирующих средах и инкубируют в течение 16 ч (один клеточный цикл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BrdU готовят в диметилсульфоксиде; используемый исходный раствор составляет 10 мМ и хранится в аликвотах при -20 °C.
  3. День 3
    1. Облучают пластины общей дозой рентгеновского облучения 5 Гр (варьируют дозу облучения в зависимости от типа облучателя, например, облучатели мелких животных против настольных облучателей). Смотрите Таблицу материалов для марки и модели используемого облучателя.
    2. Верните пластины в инкубатор, и отпустите клетки в течение 3 ч.
    3. В течение 3-часового инкубационного периода подготовьте два буфера, A и B, и 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы А и В и сахароза должны быть приготовлены свежими в день фиксации, используя свежий раствор сахарозы для предотвращения загрязнения.
      1. Подготовьте буфер А (Pre-Extract Buffer), согласно порядку (30 мл), описанному в таблице 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сахароза 1M должна быть приготовлена в день использования, чтобы предотвратить загрязнение.
      2. Подготовьте буфер B (Cytoskeleton Stripping Buffer) в соответствии с порядком, описанным в таблице 1 (30 мл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер В должен быть подготовлен в указанном порядке для предотвращения осаждения Tween-20 и раствора дезоксихолата натрия.
      3. Приготовьте 4% PFA, по 2 мл на условие (10 мл), под химическим капотом (таблица 1).

2. Предварительная экстракция и фиксация

ПРИМЕЧАНИЕ: Все предварительное извлечение и фиксацию выполняются с обшивками, оставшимися в тканевой культуральной пластине на льду или при 4 °C; крышка снимается только на последнем этапе монтажа (см. обсуждение).

  1. Предварительная экстракция
    1. Аспирируйте среду, тщательно промойте клетки дважды с 1x PBS и удалите PBS. Добавьте 2 мл предварительно экстракционного буфера А и немедленно инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы время инкубации в буфере А не увеличивалось. Расширенная инкубация в буферах предварительной экстракции приведет к увеличению количества отделенных клеток от крышки. В качестве альтернативы, вместо инкубации при 4°C, инкубация может быть выполнена на льду.
    2. Удалите буфер A через аспирацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте крышки после удаления буфера A. Перейдите к следующему шагу.
    3. Добавьте 2 мл цитоскелета Stripping Buffer B и немедленно инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин. Осторожно аспирируйте буфер B и тщательно промывайте клетки один раз с 1x PBS. Осторожно аспирируйте 1x PBS.
  2. Фиксация
    1. Зафиксируйте клетки, добавив 2 мл 4% PFA под химический капот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PFA токсичен и должен манипулироваться под химическим капотом.
    2. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 мин. Дважды вымойте крышки с 1x PBS и аспирируйте избыток.
    3. Накройте крышки 100% холодным метанолом и инкубируйте крышки при -20 °C в течение 5 мин. Дважды мойте с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Крышки могут храниться при 4 °C в 1x PBS и пластина, обернутая в алюминиевую фольгу, если это необходимо. Клетки не должны храниться более 5 дней до продолжения протокола IF.

3. Пермеабилизация

  1. Инкубируют клетки с 2 мл 1x PBS, содержащими 0,5% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 15 мин. Трижды вымойте крышки 2 мл 1x PBS.

4. Иммуноокрашивание

  1. Шаг блокировки
    1. Подготовьте достаточно свежего блокирующего буфера (3% BSA в 1x PBS), чтобы использовать 2 мл на крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные 5 мл блокирующего буфера для приготовления растворов антител.
    2. Добавьте в каждую лунку 2 мл блокирующего буфера и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Первичная инкубация антител
    1. Готовят раствор первичного антитела в свежем блокирующем буфере: BrdU RPN202 1:1000 и пролиферирующий клеточный ядерный антиген (PCNA) 1:500, 100 мкл на крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения антитела можно использовать меньший объем, 75-100 мкл для крышки 22 x 22 мм, 50-75 мкл для крышки 18 x 18 мм.
    2. На каждый лист крышки добавляют 100 мкл раствора первичного антитела. Накройте крышки квадратом парапленки с помощью пинцета и аккуратно расположите парапленку, чтобы не создавать пузырьков.
    3. Накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируйте первичное антитело в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    4. Снимите квадраты парапленки и трижды вымойте крышки 2 мл стерильного 1x PBS.
  3. Инкубация вторичных антител
    1. Готовят достаточное количество раствора вторичных антител в свежем блокирующем буфере: антимышечное 488 флуоресцентное вторичное А11011 (для BrdU) разведение 1:800 и анти-кролик 568 флуоресцентное вторичное А11011 (для PCNA) разведение 1:800.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые цвета могут быть изменены в соответствии с экспериментальными потребностями. Конкретную используемую марку можно найти в Таблице материалов.
    2. Добавьте на каждую крышку 100 мкл раствора вторичных антител, накройте крышки квадратом парапленки с помощью пинцета и аккуратно расположите парапленку без пузырьков.
    3. Инкубируют вторичное антитело при комнатной температуре в течение 1 ч с пластиной, покрытой алюминиевой фольгой.
    4. Трижды вымойте крышки 2 мл 1x PBS.
  4. Ядерное окрашивание
    1. Приготовьте объем 2 мл на крышку 1x PBS, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в конечной концентрации 1 мкг/мл (1:1000).
    2. Добавьте на каждую крышку 2 мл раствора DAPI. Инкубируйте крышки при комнатной температуре в течение 10 мин с пластиной, покрытой алюминиевой фольгой. Дважды вымойте крышки с 1x PBS.
    3. Накройте крышки 1x PBS и используйте либо иглу, либо тонкий пинцет, чтобы поднять крышку со дна колодца. Осторожно смойте лишнюю жидкость, осторожно постучав одним краем по бумажному полотенцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не уронить слайд или не позволить плоской поверхности с адгезионными ячейками коснуться бумаги.
    4. Установите крышки на слайды, используя 10-20 мкл монтажных носителей, специфичных для ПЧ.

5. Получение и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображений может быть выполнено на нескольких типах флуоресцентных микроскопов. Использовался эпифлуоресцентный микроскоп с масляным объективом 63x; смотрите Таблицу материалов для марки и модели. Z-стеки не требуются, хотя они могут быть полезны в зависимости от клеточной линии и уровня митохондриального окрашивания.

  1. Анализ изображений
    1. Для каждого изображения создайте несколько файлов tiff; объединить все плоскости, но сохранить цветовые каналы отдельно. Импортируйте эти файлы в Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) и анализируйте с помощью конвейера Speckle Counting (Дополнительное видео 1).
    2. Загрузите изображения (дополнительный рисунок S1A).
      1. Чтобы начать создание проекта, загрузите в программу конвейер подсчета пятен и изображения для анализа в предоставленной области.
      2. Используйте модуль NamesAndTypes, чтобы присвоить осмысленное имя каждому изображению, по которому другие модули будут ссылаться на него-C01: Представляя канал BrdU; C02: Представляет канал PCNA; C03: Представление канала DAPI.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти идентификаторы будут зависеть от микроскопа; в имени файла должен быть идентификатор для различения каналов.
    3. Определите, какой файл будет использоваться для идентификации ядер и назовите его (измените это имя по мере необходимости) (см. Дополнительный рисунок S1B и Дополнительный рисунок S1C).
      1. Выберите диаметр объекта от 50 до 300 пикселей, что является приемлемым диапазоном размеров для ядер, но измените значение в соответствии с ядрами на изображении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Может оказаться, что 50 является слишком большим значением и препятствует идентификации меньших ядер; аналогичным образом, 300 может позволить считать большие группы ядер 1.
      2. Отбрасывайте объекты за пределами диапазона диаметров, чтобы обеспечить подсчет только тех, которые соответствуют критериям.
      3. Отбрасывайте объекты, касающиеся границ, чтобы удалить ячейки, которые могут находиться в поле только частично.
      4. Примените пороговое значение в соответствии с конкретными изображениями. Обратите внимание на следующие параметры в качестве примера. Измените поправочный коэффициент порога в зависимости от того, насколько строгой будет стратегия пороговых значений. Другие параметры включают пороговую стратегию: Глобальная; пороговый метод: Otsu; два класса или три класса пороговое значение: два класса; шкала сглаживания порога: 1; пороговый коэффициент сглаживания: 1; нижняя и верхняя границы порога: 0,0 и 1,0; метод различения слипшихся объектов: Форма; и метод рисования разделительных линий между сгруппированными объектами: Propagate.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого параметра профилировщик ячеек предоставляет дополнительные определения и доступную возможность настройки переменной.
    4. Определите первичный объект для идентификации очагов (дополнительный рисунок S2A).
      1. Используйте следующие настройки: выберите входное изображение: Maskedgreen; назван основной объект, подлежащий идентификации: BrdUFoci; типичный диаметр объекта: 1-15; выбросить объект за пределы диапазона диаметров: Да; отбросить объект, коснущийся границы изображения : Нет; пороговая стратегия: адаптационная; пороговый метод: Otsu; два класса или три класса пороговое значение: три класса; шкала сглаживания порога: 1; пороговый коэффициент сглаживания: 3; и размер фильтра сглаживания: 4.
    5. Измерение интенсивности (дополнительный рисунок S2B).
      1. Выберите измеряемое изображение: OrigGreen.
      2. Нажмите Добавить другое изображение. Выберите измеряемое изображение: PCNA. Выберите объекты для измерения: Ядра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет использоваться для измерения интенсивности BrdU и PCNA - окончательных данных, которые будут отображены на графике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе анализ на основе бромодезоксиуридина (BrdU) использовался для количественного измерения резекционной реакции клеток HeLa на повреждение, вызванное облучением. Генерируемые следы ssDNA визуализируются как отдельные очаги после иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 1A). Затем идентифицированные очаги количественно оценивали и выражали как общую интегральную интенсивность окрашивания BrdU в ядрах (рисунок 1B, дополнительный рисунок S1, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3). Можно измерить число очагов или среднюю интенсивность фокусов, хотя это может быть менее надежным, чем общая ядерная интенсивность, в основном частично из-за переменного размера очагов BrdU.

Чтобы дифференцировать резекцию ближнего действия в результате NHEJ и дальнюю резекцию HR, совместное окрашивание проводили с использованием антитела против PCNA для идентификации клеток, проходящих через S-фазу (рисунок 1 и дополнительный рисунок S4). PCNA представляет собой зажим ДНК, который действует как фактор процессуальности для ДНК-полимеразы и необходим для репликации. PCNA занимает видное место в ядре и достигает максимальной экспрессии во время S-фазы клеточного цикла. Следовательно, в ранней S-фазе сигнал PCNA является низким и имеет гранулярное распределение. Напротив, в поздней S-фазе окрашивание PCNA довольно сильное (рисунок 1A). При первом анализе сигнала PCNA (S-фаза) ядра должны быть идентифицированы и измерена интенсивность PCNA.

Полученные значения затем строятся в виде диаграммы рассеяния, чтобы наилучшим образом определить интенсивность отсечения для различения pcNA-положительных и PCNA-отрицательных ядер (дополнительный рисунок S4A). Затем отрицательные результаты PCNA будут удалены из набора данных, чтобы можно было провести анализ на основе интенсивности BrdU из-за низкого сигнала BrdU независимо от состояния (дополнительный рисунок S4B). В этих экспериментальных условиях PCNA-отрицательные ядра имеют базальную интегральную интенсивность очагов BrdU 900 произвольных единиц (A.U.). Однако это значение достигает 1800 а.е. в PCNA-положительных ядрах (рисунок 1B). Это представляет собой 100% увеличение количества интегрированного сигнала очагов BrdU. Увеличение интенсивности BrdU может быть затем коррелировано с увеличением резекции ДНК, которая более выражена и эффективна, когда клетки проходят через фазы S и G2 и облучаются.

В этом протоколе, чтобы продемонстрировать увеличение резекции ДНК после облучения (5 Гр), активность PARP-1 модулировали либо через потерю PARP-1 с использованием состояния нокдауна siRNA, либо после мощного ингибирования PARP-1 с использованием Талазопариба (BMN673) (Рисунок 2 и Дополнительный рисунок S5). Количество резецированной ДНК в каждом состоянии затем количественно оценивалось после ПЧ (рисунок 2B). В невозмущенном состоянии (siCTRL) интегральная интенсивность очагов BrdU на ядро составляет приблизительно 1500 А.Е. в PCNA-положительных ядрах (рисунок 2A,B). После эффективного нокдауна PARP-1 с использованием siRNA (рисунок 2C) наблюдалось значительное увеличение интенсивности очагов BrdU примерно до 1900 г. н.э., что соответствует увеличению интенсивности на 26% (p ˂ 0,0001). Аналогично, после ингибирования ПАРП-1 с использованием BMN673 (конечная концентрация 5 мкМ) интенсивность очагов увеличивалась примерно с 1750 до 2500 А.Е., что соответствовало увеличению интенсивности очагов на 43% (p ˂ 0,0001). Таким образом, потеря PARP-1 дисрегулирует резекцию ДНК, как сообщалось ранее13.

Важно помнить, что BMN-673 одновременно ингибирует активность PARP-1 и захватывает ее в ДНК, и эффект этого лечения гораздо более вреден для клетки, что приводит к большему увеличению интенсивности BrdU, чем в клетках, обработанных siRNA. Небольшая разница в интенсивности необработанных и siCTRL демонстрирует, как любое лечение, такое как трансфекция siRNA, может повлиять на реакцию и выход анализа. Это может дополнительно продемонстрировать важность использования надлежащих элементов управления для каждого условия.

Figure 1
Рисунок 1: Образование фокусов BrdU более склонно происходить в PCNA-положительных клетках, чем в реплицирующихся клетках. (A) Репрезентативные изображения образования фокусов BrdU и окрашивания PCNA после облучения 5 Гр и высвобождения через 3 ч. Увеличенный квадрат с отмеченными фокусами BrdU присутствует в углу каждого изображения BrdU. Шкала баров = 5 мкм. (B) Количественная оценка ядерной интенсивности BrdU в необработанных (без BMN-673) клетках HeLa. Данные показывают среднее ± s.e.m ( U-test Манна-Уитни). Сокращения: BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; PCNA = пролиферирующий клеточный ядерный антиген; ИК = облучение; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; A.U. = произвольные единицы; s.e.m. = стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Нокдаун или ингибирование поли(АДФ-рибозы) полимеразы-1 приводит к увеличению образования фокусов BrdU в реплицирующихся клетках. (A) Репрезентативные изображения образования очагов BrdU и окрашивания PCNA в необработанных клетках HeLa, обработанных 5 мкМ BMN-673, siCTRL и siPARP-1, с последующим облучением 5 Гр и высвобождением через 3 ч. Увеличенный квадрат с отмеченными фокусами BrdU присутствует в углу каждого изображения BrdU. Шкала баров = 5 мкм. (B) Количественная оценка ядерной интенсивности BrdU в необработанных клетках HeLa, обработанных 5 мкМ BMN-673, siCTRL и siPARP-1 с последующим облучением 5 Гр, данные показывают среднее ± s.e.m ( U-тест Манна-Уитни). (C) Вестерн-блот для проверки нокдауна siRNA PARP-1. Антитело F1-23 PARP-1 распознает автомодифицированный PARP-1, что приводит к размазыванию полосы siCTRL и твердому виду каталитически ингибированного PARP-1 в образцах, обработанных BMN-673. Сокращения: PARP-1 = поли(АДФ-рибоза) полимераза 1; BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; PCNA = пролиферирующий клеточный ядерный антиген; ИК = облучение; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; A.U. = произвольные единицы; siCTRL = контроль siRNA; siPARP-1 = siRNA для сбивания PARP-1; s.e.m. = стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Буфер A (буфер предварительной экстракции) 30 мл
Реагент Том Конечная концентрация
Н2О 18 мл
ТРУБЫ (pH 7, 500 мМ) 600 мкл 10 мМ
НаКл (4 М) 750 мкл 100 мМ
MgCl2 (1 М) 90 мкл 3 мМ
ЭГТА (500 мМ) 60 мкл 1 мМ
Триция X-100 (10%) 1,5 мл 0.50%
Сахароза (1 М) 9 мл 300 мМ

Буфер B (буфер зачистки цитоскелета) 30 мл
Реагент Том Конечная концентрация
Н2О 25.035 мл
Tris pH 7,5 (1 М) 300 мкл 10 мМ
НаКл (4 М) 75 мкл 10 мМ
MgCl2 (1 М) 90 мкл 3 мМ
Tween20 (10%) 3 мл 1%
10% дезоксихолкат натрия 1,5 мл 0.50%

Реагент Том
16% ПФА 2,5 мл
ПБС 1x 7,5 мл

Таблица 1.

Дополнительный рисунок S1: Визуальное представление программного обеспечения Cell Profiler и спекл-счетного конвейера, часть 1. (A) Снимок экрана показывает окно, используемое для идентификации различных файлов каналов анализируемых изображений. На этих снимках показан интерфейс профилировщика ячеек. (B) Снимок экрана с меню «Идентификация основных объектов» для идентификации ядер. Выделенные значения являются обычно измененными значениями для наилучшей идентификации ядер. Сокращения: BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Визуальное представление программного обеспечения Cell Profiler и спекл-счетного конвейера, часть 2. (A) Снимок экрана с меню «Идентификация первичных объектов» для идентификации очагов BrdU в ядрах. (B) Снимок экрана меню «Измерение интенсивности объекта» для измерения ядерной интенсивности BrdU и PCNA. Сокращения: BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; PCNA = пролиферирующий клеточный ядерный антиген. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Визуальное представление программного обеспечения Cell Profiler и конвейера подсчета speckle, часть 3. (A) Представление идентификации ядер профилировщиком клеток после оптимизации. (B) Представление идентификации очагов BrdU. (C) Снимок экрана представляет собой увеличение на одну ячейку в начальном окне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Диаграмма рассеяния PCNA-положительных и PCNA-отрицательных клеток. (A) Пример точечной диаграммы PCNA, используемой для различения PCNA-положительных и PCNA-отрицательных клеток. Интенсивность PCNA от одного состояния была построена на графике, и было выявлено различие между двумя популяциями. Зеленый цвет выделяет PCNA-положительные клетки, красный представляет PCNA-отрицательные клетки. Это делается для каждого отдельного эксперимента и состояния. (B) количественная оценка ядерной интенсивности BrdU в PCNA-отрицательных необработанных клетках HeLa, обработанных 5 мкМ BMN-673, siCTRL и siPARP-1; данные показывают среднее ± s.e.m ( U-тест Манна-Уитни). Сокращения: PARP-1 = поли(АДФ-рибоза) полимераза 1; BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; ИК = облучение; PCNA = пролиферирующий клеточный ядерный антиген; A.U. = произвольные единицы; siCTRL = контроль siRNA; siPARP-1 = siRNA для сбивания PARP-1; s.e.m. = стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S5: Сигнал BrdU без облучения. (A) Репрезентативные изображения образования очагов BrdU и окрашивания PCNA без облучения. Шкала стержней = 5 мкм. Увеличенный квадрат с отмеченными фокусами BrdU присутствует в углу каждого изображения BrdU. (B) количественная оценка ядерной интенсивности BrdU в PCNA-положительных необработанных клетках Hela, обработанных 5 мкМ BMN-673, siCTRL и siPARP-1; данные показывают среднее ± s.e.m ( U-тест Манна-Уитни). (C) количественная оценка ядерной интенсивности BrdU в PCNA-отрицательных необработанных клетках HeLa, обработанных 5 мкМ BMN-673, siCTRL и siPARP-1; данные показывают среднее ± s.e.m ( U-тест Манна-Уитни). Сокращения: PARP-1 = поли(АДФ-рибоза) полимераза 1; BrdU = 5-бром-2'-дезоксиуридин; PCNA = пролиферирующий клеточный ядерный антиген; ИК = облучение; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; A.U. = произвольные единицы; siCTRL = контроль siRNA; siPARP-1 = siRNA для сбивания PARP-1; s.e.m. = стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Использование профилировщика клеток и конвейера подсчета пятен для анализа окрашивания BrdU для измерения резекции ДНК. В этом видео демонстрируется использование cell profiler и конвейера подсчета Speckle. Он показывает, как импортировать и анализировать изображения с помощью этого инструмента специально для этого протокола. Аббревиатура: BrdU =5-бром-2'-дезоксиуридин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описывается метод, который использует окрашивание ПЧ для измерения вариаций резекции ДНК в целлюлозе. В настоящее время стандартом для наблюдения за влиянием на резекцию ДНК является окрашивание RPA; однако это косвенный метод, на который может влиять репликация ДНК. Ранее был описан другой метод резекции ДНК на основе brdU для классификации резекции ДНК в Резекции BRdU-положительных и BrdU-отрицательных клеток. Этот метод позволил считать клетки, которые не подвергаются ЧСС, положительными из-за фонового или митохондриального окрашивания, что приводит к высокой интенсивности BrdU14,15,16. Основной новизной метода, описанного в данной работе, является добавление окрашивания PCNA, которое обеспечивает селективность для S и G2 фаз клеточного цикла, гарантируя, что результирующий сигнал BrdU обусловлен резекцией и, таким образом, гомологически направленным репарацией.

Критическим этапом в этом протоколе является предварительное извлечение; без этого фокусы BrdU не будут видны, а при неправильном выполнении клетки будут отделяться полностью. Неправильно подготовленные буферы приведут к неполной предварительной экстракции, такой как частичное удаление цитоскелета или повышенный фоновый сигнал. Очень важно соблюдать продолжительность инкубации с буферами предварительной экстракции, увеличение продолжительности в буферах может привести к отсоединению клеток от покровного листа. Важно отметить, что если этот протокол выполняется с плохо адгезивными клетками, предварительно обработайте крышки полилизином, чтобы уменьшить отслоение клеток во время предварительной экстракции. Впоследствии, без фиксации метанола, сигнал PCNA не будет виден.

Другой важной переменной в этом протоколе является блокирующий буфер: несовместимые блокирующие буферы приведут к потере сигнала BrdU. Например, 10% фетальная бычья сыворотка в 1x PBS блокирующий буфер будет функционировать, если не сочетается с фиксацией метанола; однако в сочетании с фиксацией метанола, как это требуется для окрашивания PCNA, сигнал BrdU значительно снижается. Возможно, с этим протоколом будут работать другие блокирующие агенты и методы; 3% BSA в 1x PBS обеспечили наилучшие результаты. Последним важным компонентом этого метода является использование источника повреждения ДНК; без этого ядерного сигнала BrdU практически не будет (дополнительный рисунок S5). Опыт показал, что облучение является отличным источником повреждений для этого метода. Однако, если нет доступа к облучателю, вместо него могут использоваться радиомиметические препараты, такие как неокарзиностатин.

Cell profiler является полезным и универсальным инструментом, который позволяет легко и последовательно анализировать изображения, полученные в этой технике. Настройки могут быть настроены как для размера идентифицированных объектов, так и для порога, при котором он это делает (Дополнительное видео 1). Поскольку ядерная интенсивность окрашивания BrdU является желаемым считыванием, ключевая настройка заключается в идентификации ядер из файлов DAPI. Анализ изображений из каждого условия должен выполняться отдельно, так как результаты получаются в виде одного csv-файла, содержащего номера ячеек и изображений, но не имена условий. Чтобы определить, подходят ли условия анализа, используйте функцию Запуска тестового режима и убедитесь, что значок глаза открыт в нужных шагах. Закройте этот значок при запуске фактического анализа, так как это приведет к появлению всплывающих окон и замедлению работы программы. В тестовом режиме Start пользователи могут перемещаться взад и вперед, изменяя настройки по мере необходимости, чтобы правильно идентифицировать сначала ядра, а затем фокусы BrdU.

Удовлетворившись полученной идентификацией, используйте одни и те же настройки для каждого условия в рамках одного и того же эксперимента; это может потребовать получения тестового изображения для каждого условия перед анализом всей партии, чтобы убедиться, что настройки соответствуют каждому условию. Важно отметить, что в зависимости от получения изображения параметры профилировщика cell могут различаться между пользователями и между версиями программного обеспечения. Следовательно, важно пройти этап тестирования, чтобы определить идеальные параметры для конкретных экспериментов. При подготовке к построению графика результатов должны быть идентифицированы PCNA (S-фаза)-положительные клетки. Для этого интенсивность PCNA измеряется таким же образом, как и интенсивность BrdU, и результирующие значения строятся в виде точечной диаграммы, чтобы наилучшим образом визуализировать значение интенсивности отсечения для PCNA-положительных клеток. Затем отрицательные результаты PCNA будут удалены из набора данных, чтобы обеспечить построение графика интенсивности BrdU. На предоставленных дополнительных рисунках показаны скриншоты из программы, выделяющие наиболее оптимизированные настройки (дополнительный рисунок S1, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3).

Возможной модификацией протокола является используемое антитело PCNA; были успешно протестированы два разных антитела PCNA, одно из которых перечислено здесь, а другое, которое больше не находится в производстве - моноклональное антитело для крыс (Bulldog Bio PCA16D10). Наконец, пользователи должны покрыть крышки парапленкой во время инкубации антител. Это не является строго необходимым, хотя значительно больший объем раствора антител потребовался бы, чтобы полностью покрыть покров без этого. Другой метод заключается в том, чтобы поместить лист парапленки, окружающий стеклянную пластину, поместить капли раствора антител на парапленку и аккуратно поместить покровную клеточную сторону вниз на каплю раствора антител. Затем эта стеклянная пластина может быть помещена во влажную камеру при 4 °C на ночь для первичной инкубации и в темноте при комнатной температуре для вторичной инкубации. Этот метод является полностью функциональным, хотя он значительно увеличивает время обработки обложек и, как следствие, увеличивает вероятность падения или поломки крышки.

Альтернативным методом измерения резекции является использование метода SMART для расчесывания ДНК; хотя этот метод обеспечивает очень четкие результаты, он намного сложнее, требует больше времени и дороже17. Метод SMART требует извлечения ДНК, не повреждая ее, с последующим растяжением этой ДНК на покровные листы, за которыми следует IF. Метод BrdU IF, для сравнения, является простым и экономически эффективным, не требуя больших инвестиций, чем стоимость антитела. Этот метод обеспечивает начальный способ измерения резекции, который является более точным, чем просто измерение образования RPA-очагов, что может быть связано с его влиянием на многие клеточные функции. Однако RPA фосфорилируется на специфических остатках во время резекции как часть реакции на повреждение ДНК.

Одномолекулярная визуализация недавно выявила фосфорилированный RPA (pRPA) в качестве регулятора отрицательной резекции18. Следовательно, в долгосрочной перспективе этот метод может быть сделан еще более точным путем соединения окрашивания PCNA/фосфорилированного RPA с визуализацией BrdU с использованием соответствующих антител и оптимизированных условий окрашивания. Однако представленный способ обеспечивает представление резекции, которая наблюдается независимо от белков, участвующих в процессе резекции, тем самым сводя на нет смещение, которое может возникнуть от изменений их сигнала в ответ на лечение. Этот метод обеспечивает не только метод определения того, участвует ли белок в резекции, но и определение того, связана ли гибель клеток в результате медикаментозного лечения с гипо/ гиперрезекцией. Эта информация может быть полезна для понимания не только механистических аспектов восстановления ДНК, но и биологического механизма, лежащего в основе гибели клеток, вызванной лекарственными средствами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Мари-Кристин Карон за выдающиеся технические консультации. Эта работа поддерживается финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. занимает исследовательскую кафедру Tier 1 Canada в области репарации ДНК и терапии рака. J.O'S является аспирантом FRQS, а S.Y.M является постдокторантом FRQS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit Molecular probes A11011 1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Molecular probes A11001 1:800
Anti PARP1 (F1-23) Homemade 1:2500
Anti PCNA (SY12-07) Novus NBP2-67390 1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A) Abcam Ab7291 1:100000
anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1:1000
Benchtop X-ray Irradiator Cell Rad
BMN673 MedChem Express HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU) Sigma B5002
BSA Sigma A7906
Cell profiler Broad Institute V 3.19 https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft Fisher scientific 13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen Life Technology D1306
DMEM high glucose Fisher scientific 10063542
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Fetal Bovine serum Gibco 12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 Fisher scientific 12 541B
Fluorescent microscope Leica DMI6000B 63x immersion objective
HeLa ATCC CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V VWR 51030408 37% CO2
MgCl2 BioShop Canada MAG520.500
NaCl BioShop Canada SOD002.10
Needle
PBS 1x Wisent Bio Products 311-010-CS
PFA 16% Cedarlane Labs 15710-S(EM)
PIPES Sigma-Aldrich P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen Life Technology P-36930
RNAiMAX Invitrogen 13778-075
siPARPi Dharmacon AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control Dharmacon UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate Sigma-Aldrich D6750-100G
Sucrose BioShop Canada SUC507.5
Tris-base BioShop Canada TRS001.5
Trition X-100 Millipore Sigma T8787-250ML
Tween20 Fisher scientific BP337500
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Tags

Биология Выпуск 170 Очаги BrdU Иммунофлуоресценция резекция конца ДНК гомологичная рекомбинация PARP-1 ингибиторы PARP резистентность к ингибитору PARP BMN673
Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, J., Mersaoui, S. Y.,… More

O'Sullivan, J., Mersaoui, S. Y., Poirier, G., Masson, J. Y. Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging. J. Vis. Exp. (170), e62553, doi:10.3791/62553 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter