Summary
본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
DNA 손상 반응(DDR)의 연구는 복잡하고 필수적인 분야이며, 이는 암 치료를 위한 DDR 표적 약물의 사용으로 인해 더욱 중요해졌습니다. 이러한 표적은 다양한 형태의 DNA 수리를 시작하는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP)입니다. PARP 억제제(PARPi)를 사용하여 이러한 효소를 억제하는 것은 유방암 유형 1(BRCA1), BRCA2 또는 BRCA2(PALB2)의 파트너 및 국소화로 인한 동종 재조합(HR)-결핍세포에 대한 치료적 취약성을 부여하여 합성 치사를 달성한다.
PARPi로 처리된 세포는 DNA 이중 가닥 휴식(DSBs)을 축적한다. 이러한 휴식은 DNA 끝 절제 기계에 의해 처리되며, 단일 좌초 (ss) DNA 및 후속 DNA 수리의 형성으로 이어진다. BRCA1 결핍 맥락에서, DNA 절제술 억제제의 돌연변이를 통해 DNA 절제술을 통해 DNA 절제술을 재활성화, 와 같은 53BP1 및 DYNLL1, PARPi 저항을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 셀룰로에서 DNA 절제술을 모니터링할 수 있는 것은 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 개발에 매우 중요합니다. 면역 형광 (IF) 기반 기술은 DNA 손상 후 글로벌 DNA 절제술의 모니터링을 허용합니다. 이 전략은 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)와 긴 펄스 게놈 DNA 라벨을 필요로합니다. DNA 손상 및 DNA 끝 절제술에 이어, 생성된 단일 좌초 DNA는 네이티브 조건하에서 항 BrdU 항체에 의해 구체적으로 검출된다. 더욱이, DNA 절제술은 세포 주기 마커를 사용하여 세포 주기의 다양한 단계를 구별하는 연구될 수 있다. S/G2 상에 있는 세포는 G1 세포가 비 동형 종결합 (NHEJ)를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 반면, HR 내의 끝 절제술의 연구를 허용합니다. 세포 주기 차별과 결합된 이 IF 방법에 대한 자세한 프로토콜은 이 논문에 설명되어 있습니다.
Introduction
DNA 수리 인자의 변조는 암 치료를 위한 끊임없이 진화하는 방법, 특히 DNA DSB 복구 결핍 종양 환경에서. 특정 수리 요인의 억제는 DNA 손상 에이전트에 암세포를 민감하게 하는 데 사용 되는 독창적인 전략 중 하나입니다. 연구의 수십 년 치료 전략 선택에 대 한 바이오 마커로 DNA 복구 유전자의 다양 한 돌연변이의 식별으로 주도 1. 결과적으로 DNA 수리 분야는 다양한 치료법을 보장하기 위한 약물 개발의 허브가 되어 개인화된 의학 개념을 강화합니다.
DSB는 NHEJ와 HR2의 두 가지 주요 경로에 의해 수리됩니다. NHEJ 통로는 오류가 발생하기 쉽고, 두 DNA 끝을 DNA 최종 처리가 거의 또는 전혀 없이 빠르게 결합하고 단백질 키나아제(DNA-PKcs), Ku70/80 복합체, 53BP1 및 RIF1 단백질3와 관련이 있습니다. 대조적으로, HR은 BRCA14에 의해 시작된 충실한 기계장치입니다. HR 수리의 필수적인 단계는 DNA-말 절제 과정으로, 이는 3'-OH 끝이 있는 단면(ss) DNA로 이어지는 깨진 끝의 저하입니다. BRCA1은 5'에서 3'DNA 절제술5에 관여하는 절제된 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1을 형성하는 다운스트림 단백질의 모집을 용이하게 합니다.
초기 말절제는 MRE11의 엔도나클레스 활성을 통해 달성되어 DNA2 및 EXO1 뉴클레아제에 의한 추가 처리를 가능하게 한다. 생성된 ssDNA 오버행은 복제 단백질 A(RPA)에 의해 신속하게 코팅되어 추가 처리로부터 보호합니다. 그 후, BRCA2, PALB2 및 BRCA1은 상동성 지향 수리 메커니즘에 필요한 RPA의 변위와 RAD51 핵필라멘트의 조립을 중재하기 위해 관여한다. 유전체 무결성의 최적 유지 보수를 위해서는 NHEJ와 HR의 사용 사이의 미세한 균형이 필요합니다. 통로 선택은 세포 주기 단계에 달려 있습니다. HR은 DNA 절제술이 최고 수준에 있는 것을 내다의 S에서 G2 단계 도중 우대적으로 이용되고, 자매 크로마티드는 적당한 수리를 지키기 위하여 유효합니다.
폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1(PARP-1)은 DSB에 채용된 초기 단백질 중 하나입니다. 그것은 NHEJ5,6에 관련 된 하류 효과의 절제술 활동 및 조립을 모두 조절. PARP-1은 복제 7,8 동안 DNA 단일 좌초 휴식 수리에도 필요합니다. DNA 수리에 있는 그것의 중요한 역할 때문에, PARP 억제제 (PARPi)는 암 치료로 이용됩니다. 몇몇 HR 결핍암에서, PARPi 처리는 대체 통로를 통해 축적된 손상을 복구하기 위하여 HR 결핍세포의 무능력 때문에 합성 치명적인 반응으로 이끌어 냅니다9,10. 현재 4개의 FDA 승인 PARPi가 있습니다: 올라파리브, 루카파립, 니리파립, 탈라조파립(BMN 673이라고도 함) 등 다양한 유방암 및 난소암 치료에 사용됩니다11. 그러나 PARPi 저항은 일반적이며, HR 능력의 재수집을 통해 하나의 잠재적 인 원인이 발생12. 조사 의 존재에 PARP-1의 손실 또는 억제는 방부성 기계를 조절, 더 긴 ssDNA 기관13의 축적으로 이어지는. 따라서 생체 내 DNA 절제술에 대한 심층 연구는 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 암을 치료하고 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 후속 개발에 매우 중요합니다.
DNA 절제술 이벤트를 검출하기 위하여 채택된 몇몇 방법이 있었습니다5. 이러한 방법 중 하나는 반대로 RPA 항체를 이용하여 스트레스 유도 DSB 후 절제된 DNA의 간접 염색 및 시각화를 허용하는 고전적인 IF 기반 기술이다. 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)로 게놈 DNA를 표시하고 ssDNA만 검출하는 것은 DNA 절제술 이벤트의 직접적인 측정입니다. 그것은 DNA 복제와 같은 다중 세포 프로세스에 관여하는 RPA의 감시를 우회합니다. 여기서 설명된 방법에서, 단일 세포 주기를 위해 BrdU와 함께 배양된 세포는 BrdU가 복제 세포 DNA의 한 가닥으로 통합될 수 있게 한다. 다음 절제술, IF 염색은 BrdU가 ssDNA 형태로만 검출할 수 있도록 하는 조건하에서 수행되며, 반대로 BrdU 항체를 사용한다. 이 항체는 노출된 BrdU 뉴클레오티드에만 접근할 수 있으며 이중 좌초 된 DNA에 통합 된 것을 감지하지 않습니다. 형광 현미경 검사를 사용하여, 절제된 DNA는 BrdU/ssDNA foci를 천시테이트의 형태로 시각화할 수 있습니다. 이러한 포시의 핵 강도는 DNA 손상 에 따라 절제술을 정량화하기 위한 판독선으로 사용될 수 있다. 이 논문은 대부분의 포유류 세포주에 적용될 수 있는 이 방법의 과정을 단계별로 설명합니다. 이 방법은 개념의 증거로 셀룰로에서 DNA 끝 절제술을 모니터링하는 간단한 방법으로 광범위한 유틸리티가어야합니다.
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Protocol
1. 세포 배양, 치료 및 커버 슬립 준비
참고: 모든 세포 도금, 경질 및 치료는 조사 외에도 멸균 세포 배양 후드 에서 이루어져야 합니다.
- 1일차
- 6웰 플레이트에 필요한 만큼의 조건에 대해 각각 하나의 커버슬립을 배치합니다. 플레이트 ~150,000 Fefection 또는 약물 치료를 위한 HeLa 세포, 원하는대로.
참고: 횡단하는 경우 도금 시 역경을 하는 것이 좋습니다. 역성 형질은 세포가 추가되기 전에 커버슬립에 형질 전환 믹스를 추가하여 수행됩니다. 따라서 세포가 준수되기 전에 전환이 시작됩니다. 반대로, 전방 형질은 일반적으로 다음 날에 표면에 대한 경피 혼합 후 준수의 첨가이다. 그러나, 세포가 부착할 수 있는 충분한 시간이 주어지면 같은 날에 이 작업을 수행할 수 있다. - 이 방법에 대 한, 사용 4 우물: 음 1: siRNA 제어 (siCTRL 이라고); 음 2: PARP-1에 대한 siRNA (siPARP-1); 음 3: 치료되지 않은; 음 4: 조사 전에 5 μM BMN673 1 h로 처리되는 세포.
참고: 이 프로토콜에서는 모든 테스트가 조사된 조건하에서 수행되었습니다(섹션 1.3 참조). - 형질 프로토콜은 최대 3 일 동안 배양 할 수 있지만, 하룻밤 동안 5 % CO2 가습 인큐베이터에서 37 °C에서 세포를 배양한다. BrdU 처리의 앞에 잠복기 시간은 siRNA 경질 효율에 달려 있습니다. 형질이 없는 경우, 16h의 배큐베이션은 커버슬립및 일부 세포 성장을 준수하기에 충분합니다.
참고: 인큐베이터 조건은 사용되는 세포주에 따라 변경될 수 있다.
- 6웰 플레이트에 필요한 만큼의 조건에 대해 각각 하나의 커버슬립을 배치합니다. 플레이트 ~150,000 Fefection 또는 약물 치료를 위한 HeLa 세포, 원하는대로.
- 2일차
- 적절한 배양 매체에 10 μM의 최종 농도에서 BrdU를 추가하고 16h (1 세포 주기)에 대한 배양한다.
참고: BrdU 용액은 디메틸설프리산화물로 제조됩니다. 사용되는 스톡 용액은 10mM이며 -20 °C의 알리쿼트에 저장됩니다.
- 적절한 배양 매체에 10 μM의 최종 농도에서 BrdU를 추가하고 16h (1 세포 주기)에 대한 배양한다.
- 3일차
- 총 5개의 X선 조사 용량으로 플레이트를 조사합니다(예를 들어, 작은 동물 조사자 대 벤치탑 조사자 대 조사유형에 따라 조사용량이 다릅니다). 사용되는 조사기의 브랜드 및 모델에 대한 재료의 표를 참조하십시오.
- 플레이트를 인큐베이터로 반환하고 세포를 3시간 동안 방출합니다.
- 3h 인큐베이션 기간 동안, 1x 인산염 완충식식염(PBS)에서 두 개의 버퍼, A 및 B 및 4% 파라포름데히드(PFA)를 준비한다.
참고: 버퍼 A와 B와 자당은 오염을 방지하기 위해 신선한 자당 솔루션을 사용하여 고정의 날을 신선하게 준비해야합니다.- 표 1에 설명된 순서(30mL)에 따라 버퍼 A(사전 추출 버퍼)를 준비한다.
참고: 1M 자당은 오염을 방지하기 위해 사용 당일을 준비해야 합니다. - 표 1(30mL)에 기재된 순서에 따라 버퍼 B(사이토켈레톤 스트리핑 버퍼)를 준비한다.
참고: 완충B는 Tween-20 및 탈옥염 염액의 침전을 방지하기 위해 인용된 순서로 준비되어야 합니다. - 4% PFA, 조건당 2mL(10mL), 화학적 후드(표 1)를 준비한다.
- 표 1에 설명된 순서(30mL)에 따라 버퍼 A(사전 추출 버퍼)를 준비한다.
2. 사전 추출 및 고정
참고: 모든 사전 추출 및 고정은 얼음 또는 4°C에서 조직 배양 판에 남아 있는 커버립으로 수행됩니다. 커버슬립은 장착의 마지막 단계에서만 해제됩니다(토론 참조).
- 사전 추출
- 배지를 흡인하고, 1x PBS로 셀을 두 번 조심스럽게 세척하고 PBS를 제거합니다. 2mL의 사전 추출 버퍼 A를 추가하고 즉시 4 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
참고: 버퍼 A의 인큐베이션 시간이 연장되지 않는 것이 중요합니다. 사전 추출 버퍼에서 확장된 배큐어는 커버슬립에서 분리된 셀의 수가 증가합니다. 또는 4°C에서 인큐베이션 대신 얼음에서 인큐베이션을 수행할 수 있습니다. - 포부를 통해 버퍼 A를 제거합니다.
참고: 버퍼 A를 제거한 후 커버립을 세척하지 마십시오. - 사이토스켈레톤 스트리핑 버퍼 B 2mL을 넣고 즉시 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 조심스럽게 버퍼 B를 흡인하고, 조심스럽게 1배 PBS로 한 번 세포를 씻으세요. 1x PBS를 조심스럽게 흡인합니다.
- 배지를 흡인하고, 1x PBS로 셀을 두 번 조심스럽게 세척하고 PBS를 제거합니다. 2mL의 사전 추출 버퍼 A를 추가하고 즉시 4 °C에서 10 분 동안 배양합니다.
- 고정
- 화학 후드 아래에 4 % PFA의 2 mL을 추가하여 세포를 고정하십시오.
참고: PFA는 독성이 있으며 화학 적 후드에서 조작해야합니다. - 20 분 동안 실온에서 세포를 배양. 커버립을 1x PBS로 두 번 씻고 초과를 흡인시합니다.
- 커버립을 100% 차가운 메탄올로 덮고 커버립을 -20°C에서 5분 동안 배양합니다. 1x PBS로 두 번 씻으시면 됩니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 커버립은 1x PBS에 4°C로 보관할 수 있으며 필요한 경우 알루미늄 호일로 감싼 플레이트를 저장할 수 있습니다. 셀은 IF 프로토콜을 계속하기 전에 5일 이상 보관해서는 안 됩니다.
- 화학 후드 아래에 4 % PFA의 2 mL을 추가하여 세포를 고정하십시오.
3. 투과성
- 15 분 동안 실온에서 0.5 % 트리톤 X-100을 포함하는 1 x PBS의 2 mL로 세포를 배양합니다. 1x PBS 2mL로 커버립을 세 번 씻으시다.
4. 면역 염색
- 차단 단계
- 커버슬립당 2mL를 사용할 수 있는 신선한 블로킹 버퍼(1x PBS3%의 BSA)를 충분히 준비합니다.
참고: 항체 솔루션을 만들기 위해 5mL의 블로킹 버퍼를 추가로 준비합니다. - 각 웰에 블로킹 버퍼 2mL을 추가하고 실온에서 1h로 배양합니다.
- 커버슬립당 2mL를 사용할 수 있는 신선한 블로킹 버퍼(1x PBS3%의 BSA)를 충분히 준비합니다.
- 1차 항체 배양
- 새로운 차단 버퍼에서 1차 항체 용액을 준비하십시오: BrdU RPN202 1:1000 및 증식 세포 핵 항원(PCNA) 1:500, 커버슬립 당 100 μL.
참고: 항체를 보존하기 위해 더 작은 부피를 사용할 수 있으며, 22 x 22mm 커버슬립의 경우 75-100 μL, 18 x 18mm 커버슬립의 경우 50-75 μL을 사용할 수 있습니다. - 각 커버슬립에 1차 항체 용액의 100 μL을 추가합니다. 핀셋을 사용하여 파라필름 사각형으로 커버립을 덮고 파라필름을 조심스럽게 배치하여 거품을 만들지 않도록 합니다.
- 알루미늄 호일로 플레이트를 덮고 가습 챔버에서 4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항체를 배양한다.
- 파라필름 사각형을 제거하고, 멸균 1x PBS2mL로 커버립을 세 번 세척합니다.
- 새로운 차단 버퍼에서 1차 항체 용액을 준비하십시오: BrdU RPN202 1:1000 및 증식 세포 핵 항원(PCNA) 1:500, 커버슬립 당 100 μL.
- 이차 항체 배양
- 신선한 차단 버퍼에 충분한 이차 항체 용액을 준비하십시오: 안티 마우스 488 형광 이차 A11011 (BrdU용) 희석 1:800 및 항 토끼 568 형광 이차 A11011 (PCNA용) 희석 1:800.
참고: 사용되는 색상은 실험적 요구에 맞게 변경할 수 있습니다. 사용된 특정 브랜드는 재료 표에서 찾을 수 있습니다. - 이차 항체 용액의 각 커버슬립 100 μL에 추가하고, 핀셋을 사용하여 파라필름 사각형으로 커버커버를 덮고, 거품없이 파라필름을 조심스럽게 배치합니다.
- 알루미늄 호일로 덮인 플레이트와 함께 실온에서 1시간 동안 이차 항체를 배양합니다.
- 1x PBS 2mL로 커버립을 세 번 씻으시다.
- 신선한 차단 버퍼에 충분한 이차 항체 용액을 준비하십시오: 안티 마우스 488 형광 이차 A11011 (BrdU용) 희석 1:800 및 항 토끼 568 형광 이차 A11011 (PCNA용) 희석 1:800.
- 핵 염색
- 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)을 함유한 1x PBS의 커버슬립당 2mL의 부피를 1μg/mL(1:1000)의 최종 농도로 준비한다.
- DAPI 솔루션의 각 커버슬립 2mL에 추가합니다. 알루미늄 호일로 덮인 플레이트와 함께 실온에서 10분 동안 커버립을 배양합니다. 1x PBS로 커버립을 두 번 씻으시다.
- 커버립을 1x PBS로 덮고 바늘이나 미세 핀셋을 사용하여 우물 바닥에서 커버슬립을 들어 올립니다. 종이 타월에 한 가장자리를 부드럽게 눌러 여분의 액체를 조심스럽게 떨어 냅니다.
참고: 슬라이드를 떨어뜨리거나 부착 셀이 있는 평평한 표면이 용지를 만지지 않도록 주의하십시오. - IF 별 장착 매체의 10-20 μL을 사용하여 슬라이드에 커버립을 장착합니다.
5. 이미지 수집 및 분석
참고: 화상 수집은 형광 현미경의 몇몇 모형에서 행해질 수 있습니다. 63배 오일 목표를 가진 피형성 현미경이 사용되었습니다. 브랜드 및 모델 의 재료 표를 참조하십시오. Z-스택은 세포주 및 미토콘드리아 염색 수준에 따라 사용될 수 있지만 필요하지 않습니다.
- 이미지 분석
- 각 이미지에 대해 여러 개의 티프 파일을 만듭니다. 모든 평면을 병합하지만 색상 채널을 분리합니다. 이러한 파일을 셀 프로파일러(브로드 인스티튜트 https://cellprofiler.org/home)로 가져오고 반점 카운팅 파이프라인(추가 비디오 1)을 사용하여 분석합니다.
- 이미지를 업로드합니다(추가 그림 S1A).
- 프로젝트를 만들기 시작하려면 스펙클 계산 파이프라인을 프로그램에 로드하고 제공된 영역에서 분석할 이미지를 로드합니다.
- NameAndType 모듈을 사용하여 다른 모듈이 C01을 참조하는 각 이미지에 의미 있는 이름을 할당합니다. C02: PCNA 채널을 대표합니다. C03: DAPI 채널을 나타냅니다.
참고: 이러한 식별자는 현미경에 따라 달라집니다. 채널을 구분하려면 파일 이름에 식별자가 있어야 합니다.
- 핵을 식별하고 이름을 지정하는 데 사용할 파일을 식별합니다(필요에 따라 이 이름 변경) ( 보충 도서 S1B 및 보충 도서 S1C 참조).
- 50~300픽셀 단위 사이의 물체의 직경을 선택했는데, 이는 핵에 대한 수용 가능한 크기 범위이지만, 이미지에서 핵에 맞게 값을 변경한다.
참고: 50이 너무 큰 값이고 더 작은 핵이 식별되는 것을 방지할 수 있습니다. 마찬가지로, 300은 핵의 큰 그룹이 1로 계산될 수 있다. - 조건과 일치하는 개체만 계산되도록 직경 범위 외부의 객체를 폐기합니다.
- 테두리에 닿는 오브젝트를 삭제하여 필드에 부분적으로만 있을 수 있는 셀을 제거합니다.
- 임계값을 적용하여 특정 이미지에 맞게 합니다. 다음 설정을 예로 들 수 있습니다. 임계값 설정 전략이 얼마나 엄격한지에 따라 임계값 보정 계수를 변경합니다. 다른 설정에는 임계값 전략이 포함됩니다. 임계값 문턱 방법 : 오쓰; 두 클래스 또는 세 개의 클래스 임계값: 두 클래스; 임계값 스무딩 배율: 1; 임계값 스무딩 계수: 1; 임계값에 대한 하부 및 상한: 0.0 및 1.0; 응집된 객체를 구별하는 방법: 모양; 그리고 덩어리가 있는 객체 사이에 분할선을 그리는 방법: 전파.
참고: 각 매개 변수에 대해 셀 프로파일러는 변수 설정에 대한 상호 보완적인 정의와 사용 가능한 가능성을 제공합니다.
- 50~300픽셀 단위 사이의 물체의 직경을 선택했는데, 이는 핵에 대한 수용 가능한 크기 범위이지만, 이미지에서 핵에 맞게 값을 변경한다.
- foci를 식별하기 위해 기본 개체를 식별합니다(추가 그림 S2A).
- 다음 설정을 사용합니다: 입력 이미지를 선택합니다: 마스크그린; 식별할 기본 개체의 이름을 지정: BrdUFoci; 개체의 일반적인 직경: 1-15; 직경 범위 외부의 객체를 폐기합니다. 이미지의 테두리를 터치하는 개체를 삭제 : 아니요; 임계값 전략: 적응; 임계값 문턱 방법 : 오쓰; 두 클래스 또는 세 개의 클래스 임계값: 세 클래스; 임계값 스무딩 배율: 1; 임계값 스무딩 계수: 3; 스무딩 필터의 크기 : 4.
- 측정 강도(추가 도면 S2B).
- 측정할 이미지를 선택합니다: OrigGreen.
- 다른 이미지 추가를 클릭합니다. 측정할 이미지를 선택합니다: PCNA. 측정할 개체 선택: 핵.
참고: 이 데이터는 그래프로 작성될 BrdU 및 PCNA 강도-최종 데이터를 측정하는 데 사용됩니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서, 브로모톡시리딘(BrdU)-기반 분석체는 조사 유도손상에 대한 HeLa 세포의 절제 반응을 정량적으로 측정하는 데 사용되었다. 생성된 ssDNA 트랙은 면역 형광 염색 후 뚜렷한 초점으로 시각화됩니다 (도 1A). 확인된 포시는 핵에서 BrdU 염색의 총 통합 강도로 정량화되고 발현되었다(도 1B, 보충 도도 S1, 보충 도S2, 및 보충 도 S3). 이는 총 핵 강도보다 신뢰성이 낮지만, 부분적으로 BrdU foci의 가변 크기로 포시 수 또는 평균 초점 강도를 측정할 수 있다.
NHEJ와 HR의 장거리 절제술의 결과로 단거리 절제술을 구별하기 위해, 공동 염색은 항 PCNA 항체를 사용하여 S-phase를 통과하는 세포를 식별하도록 수행하였다(도 1 및 보충 도 S4). PCNA는 DNA 폴리머라제의 공정성 인자로 작용하며 복제에 필수적인 DNA 클램프를 구성합니다. PCNA는 핵에서 두드러지며 세포 주기의 S-phase 동안 최대 발현에 도달한다. 따라서 초기 S-phase에서는 PCNA 신호가 낮고 세분화된 분포가 있습니다. 대조적으로, 늦은 S-단계에서, PCNA 염색은 아주 강하다 (그림 1A). PCNA(S-phase) 신호를 처음 분석할 때 핵을 식별하고 PCNA 강도를 측정해야 합니다.
결과 값은 PCNA 양성 및 PCNA-음의 핵(보충 도S4A)을 구별하기 위해 컷오프 강도를 가장 잘 결정하기 위해 분산 플롯으로 플롯됩니다. 그런 다음 조건에 관계없이 낮은 BrdU 신호(보충 도 S4B)로 인해 BrdU 강도 기반 분석을 허용하기 위해 PCNA-음수 결과가 데이터 집합에서 제거됩니다. 이러한 실험 조건에서, PCNA-음의 핵은 900 임의 단위(A.U.)의 BrdU 초점의 기저 통합 강도를 항구한다. 그러나, 이 값은 PCNA 양성 핵에서 1800 A.U.에 도달합니다 (도 1B). 이는 BrdU foci의 통합 신호의 양이 100% 증가했음을 나타냅니다. BrdU 강도의 증가는 세포가 S와 G2 단계를 통과하고 조사될 때 더 두드러지고 능률적인 DNA 절제술의 증가와 상관될 수 있습니다.
본 프로토콜에서, 조사 후 DNA 절제술의 증가를 입증하기 위해 (5 Gy), PARP-1 활성은 siRNA 녹다운 상태를 사용하여 PARP-1의 손실을 통해 또는 탈라조파립 (BMN673)을 사용하여 PARP-1의 강력한 억제 후 (도 2 및 보충 도면 S5)를 조절하였다. 각 조건에서 절제된 DNA의 양은 IF(그림 2B)후에 정량화되었다. 흔들리지 않는 상태(siCTRL)에서 핵당 BrdU foci의 통합 강도는 PCNA 양성 핵에서 약 1500 A.U.입니다(도 2A, B). siRNA(그림 2C)를 사용하여 PARP-1의 효율적인 낙폭 후, BrdU foci의 강도가 약 1900A.U.로 크게 증가하여 강도가 26% 증가한 것으로 관찰되었으며(p ˂ 0.0001). 유사하게, BMN673(5 μM 최종 농도)를 이용한 PARP-1의 억제 후, 포시 강도는 약 1750에서 2500A.U.로 증가하여 포시 강도의 43% 증가에 상응하는 (p ˂ 0.0001). 따라서, PARP-1 의 손실은 이전에 보고된 바와 같이 DNA 절제술을 조절합니다13.
BMN-673 모두 PARP-1의 활성을 억제하고 DNA에 트랩하는 것이 중요하며,이 치료의 효과는 세포에 훨씬 더 해롭고 siRNA 처리 된 세포보다 BrdU 강도의 더 큰 증가를 초래한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 치료되지 않은 및 siCTRL 강도의 약간의 차이는 siRNA 전환과 같은 모든 치료가 분석의 반응 및 출력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 보여줍니다. 그것은 또한 각 조건에 대 한 적절 한 컨트롤을 사용 하 여의 중요성을 보여줄 수 있습니다.
도 1: BrdU foci 형성은 복제 세포보다 PCNA 양성 세포에서 발생하기 쉽습니다. (A) BrdU foci 형성 및 PCNA 염색의 대표적인 이미지는 5 Gy 조사 및 3 h 방출 에 따른 다이조사 및 3h 방출에 따른 다이스터포형성이다. 표시된 BrdU foci가 각 BrdU 이미지의 모서리에 표시되는 확대된 사각형이 있습니다. 스케일 바 = 5 μm. (B) 치료되지 않은 (BMN-673 없이) HeLa 세포에서 BrdU 핵 강도의 정량화. 데이터는 평균 ± s.e.m(Mann-Whitney U-test)를 보여줍니다. 약어: BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; PCNA = 세포 핵 항원 확산; IR = 조사; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌; A.U. = 임의 단위; s.e.m. = 평균의 표준 오류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제-1 녹다운 또는 억제결과 복제 세포에서 BrdU foci 형성 증가. (A) 치료되지 않은 HeLa 세포에서 BRdU 포시 형성 및 PCNA 염색의 대표적인 이미지, 5 μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1로 치료된 5μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1이 5년 제1자 및 siPARP-1을 수행하였다. 표시된 BrdU foci가 각 BrdU 이미지의 모서리에 표시되는 확대된 사각형이 있습니다. 스케일 바 = 5 μm. (B) 처리되지 않은 HeLa 세포에서 BrdU 핵 강도의 정량화, 5 μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1로 처리된 다음 5 Gy 조사, 데이터는 평균 ± s.e.m(Mann-Whitney U-test)를 나타낸다. (C) PARP-1의 siRNA 넉다운을 검증하기 위해 서양 블롯. F1-23 PARP-1 항체는 BMN-673 처리된 샘플에서 siCTRL 대역의 얼룩모양과 촉매 억제 PARP-1의 고체 외관을 초래하는 자동 변형PARP-1을 인식한다. 약어: PARP-1 = 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1; BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; PCNA = 세포 핵 항원 확산; IR = 조사; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌; A.U. = 임의 단위; siCTRL = siRNA 제어; siPARP-1 = siRNA는 PARP-1을 노크; s.e.m. = 평균의 표준 오류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 A(추출 전 버퍼) 30mL | ||
| 시약 | 음량 | 최종 농도 |
| H2O | 18 mL | |
| 파이프(pH 7, 500mM) | 600 μL | 10mM |
| 나클 (4M) | 750 μL | 100mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500mMM) | 60 μL | 1 mM |
| 트라이션 X-100 (10%) | 1.5 mL | 0.50% |
| 수크로오스 (1M) | 9 mL | 300 mM |
| 버퍼 B(사이토스켈레톤 스트리핑 버퍼) 30mL | ||
| 시약 | 음량 | 최종 농도 |
| H2O | 25.035 mL | |
| 트라이 pH 7.5 (1M) | 300 μL | 10mM |
| 나클 (4M) | 75 μL | 10mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| 트웬20 (10%) | 3 mL | 1% |
| 10% 디옥시콜카테 나트륨 | 1.5 mL | 0.50% |
| 시약 | 음량 |
| PFA 16% | 2.5 mL |
| PBS 1x | 7.5 mL |
표 1.
보충 도서 S1: 셀 프로파일러 소프트웨어 및 반점 계수 파이프라인 부품 1의 시각적 표현. (A) 스크린샷은 분석할 이미지의 다른 채널 파일을 식별하는 데 사용되는 창을 보여 주며 있습니다. 이 샷은 셀 프로파일러 인터페이스를 보여 줍니다. (b) 핵을 식별하기 위해 기본 개체 식별 메뉴의 스크린샷. 강조 표시된 값은 핵을 가장 잘 식별하기 위해 일반적으로 변경된 값입니다. 약어: BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S2: 셀 프로파일러 소프트웨어 및 반점 계수 파이프라인 파트 2의 시각적 표현. (A) 핵 내의 BrdU foci를 식별하기 위해 기본 개체 식별 메뉴의 스크린샷. (B) BrdU 및 PCNA 핵 강도를 측정하기 위한 측정 개체 강도 메뉴의 스크린샷. 약어: BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; PCNA = 세포 핵 항원 확산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S3: 셀 프로파일러 소프트웨어 및 반점 계수 파이프라인 파트 3의 시각적 표현. (A) 최적화 후 세포 프로파일러에 의한 핵 식별의 표현. (B) BrdU foci 식별의 표현. (C) 스크린샷은 초기 창 내의 한 셀에 확대/축소됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S4: PCNA 양성 및 PCNA 음성 세포의 분산 플롯. (A) PCNA-음수 세포로부터 PCNA 양성을 구별하는 데 사용되는 PCNA 산란 플롯의 예. 단일 조건에서 PCNA 강도플롯 하 고 확인 된 두 인구 사이 구별. 녹색은 PCNA 양성 세포를 강조, 빨간색은 PCNA 음성 세포를 나타냅니다. 이것은 각 개별 실험 및 조건에 대해 수행됩니다. (b) PCNA-음성 처리되지 않은 HeLa 세포에서 BrdU 핵 강도의 정량화, 5 μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1로 처리; 데이터는 평균 ± s.e.m (Mann-Whitney U-test)를 보여줍니다. 약어: PARP-1 = 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1; BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; IR = 조사; PCNA = 세포 핵 항원 확산; A.U. = 임의 단위; siCTRL = siRNA 제어; siPARP-1 = siRNA는 PARP-1을 노크; s.e.m. = 평균의 표준 오류. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 도도 S5: 조사 없이 BrdU 신호. (A) 조사 없이 BrdU 초점 형성 및 PCNA 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 5 μm. 표시된 BrdU foci가 각 BrdU 이미지의 모서리에 표시되는 확대된 사각형이 있습니다. (B) PCNA 양성 치료 헬라 세포에서 BrdU 핵 강도의 정량화, 5 μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1로 처리; 데이터는 평균 ± s.e.m (Mann-Whitney U-test)를 보여줍니다. (C) PCNA-음성 처리되지 않은 HeLa 세포에서 BrdU 핵 강도의 정량화, 5 μM BMN-673, siCTRL 및 siPARP-1로 처리; 데이터는 평균 ± s.e.m(Mann-Whitney U-test)를 보여줍니다. 약어: PARP-1 = 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1; BrdU = 5-브로모-2′-데옥시리딘; PCNA = 세포 핵 항원 확산; IR = 조사; DAPI = 4',6-디아미드노-2-페닐린돌; A.U. = 임의 단위; siCTRL = siRNA 제어; siPARP-1 = siRNA는 PARP-1을 노크; s.e.m. = 평균의 표준 오류. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 비디오 1: 세포 프로파일러와 반점 카운팅 파이프라인을 사용하여 DNA 절제술의 측정을 위해 BrdU 염색을 분석합니다. 이 비디오는 셀 프로파일러와 반점 계수 파이프라인의 사용을 보여줍니다. 이 프로토콜을 위해 특별히 이 도구를 사용하여 이미지를 가져오고 분석하는 방법을 보여 드립니다. 약어: BrdU =5-브로모-2′-데옥시리딘. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 셀룰로의 DNA 절제술의 변이를 측정하기 위해 IF 염색을 사용하는 방법을 설명합니다. DNA 절제술에 대한 효과를 관찰하기위한 현재 표준은 RPA 염색을 통해; 그러나, 이것은 DNA 복제에 의해 영향을 받을 수 있는 간접적인 방법입니다. 이전에는 BrdU-정산 DNA 절제술 IF 기술이 BrdU 양성 및 BrdU-음성 세포의 결과로 발생하는 강도를 분류하기 위해 설명되었습니다. 이 방법은 HR을 거치지 않는 세포가 높은 BrdU 강도14,15,16의 결과로 배경 또는 미토콘드리아 염색으로 인해 양성으로 계산될 수 있도록 허용하였다. 본 논문에 기재된 방법의 1차 참신은 PCNA 염색의 첨가이며, 이는 세포 주기의 S 및 G2 단계에 대한 선택성을 허용하여, 결과 BrdU 신호가 절제에 기인하고 따라서, homology 지향 수리에 기인한다는 것을 보장한다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 사전 추출입니다. 이없이, BrdU foci 표시되지 않습니다, 잘못 완료되면, 세포는 완전히 분리됩니다. 잘못 준비된 버퍼는 부분 사이토셀레탈 제거 또는 백그라운드 신호 증가와 같은 불완전한 사전 추출을 초래합니다. 사전 추출 버퍼를 사용하여 배양 기간을 존중하는 것이 매우 중요하며 버퍼의 지속 시간이 증가하면 커버슬립에서 분리되는 셀이 발생할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜이 가난한 부착 된 세포로 수행되는 경우, 사전 추출 하는 동안 세포 분리를 줄이기 위해 폴리리신으로 커버립을 미리 처리. 그 후 메탄올 고정없이 PCNA 신호가 표시되지 않습니다.
이 프로토콜의 또 다른 중요한 변수는 차단 버퍼입니다: 호환되지 않는 차단 버퍼는 BrdU 신호의 손실을 초래할 것입니다. 예를 들어, 1x PBS 차단 버퍼에서 10% 태아 소 혈청이 메탄올 고정과 결합되지 않을 때 작동합니다. 그러나 PCNA 염색에 필요한 메탄올 고정과 결합하면 BrdU 신호가 상당히 감소됩니다. 다른 차단 에이전트 및 메서드가 이 프로토콜에서 작동할 수 있습니다. PBS 1x에서 3% BSA가 최상의 결과를 제공했습니다. 이 기술에 대한 최종 필수 구성 요소는 DNA 손상 원의 사용입니다. 이없이, 거의 또는 더 핵 BrdU 신호가없을 것입니다 (보충 그림 S5). 경험에 따르면 조사는 이 방법에 대한 훌륭한 손상 원인입니다. 그러나, 조사에 접근할 수 없는 경우에, neocarzinostatin와 같은 방사선 제약은 대신 이용될 수 있습니다.
셀 프로파일러는 이 기술에서 생성된 이미지를 쉽고 일관되게 분석할 수 있는 유용하고 다재다능한 도구입니다. 설정은 식별된 개체의 크기와 개체가 그렇게 하는 임계값 모두에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다(추가 비디오 1). BrdU 염색의 핵 강도가 원하는 판독기이기 때문에, 키 커스터마이징은 DAPI 파일로부터 핵을 식별하는 것이다. 각 조건에서 이미지의 분석은 결과 셀과 이미지 번호를 포함하는 단일 CSV 파일의 형태로 얻어지지만 조건 이름은 수행해야 합니다. 분석 조건이 적절한지 확인하려면 시작 테스트 모드 기능을 사용하고 원하는 단계에서 눈 아이콘이 열려 있는지 확인합니다. 실제 분석을 실행할 때 이 아이콘을 닫으면 팝업 창이 생성되고 프로그램이 느려집니다. 시작 테스트 모드에서 사용자는 앞뒤로 이동하여 먼저 핵을 제대로 식별한 다음 BrdU foci를 올바르게 식별하는 데 필요한 설정을 변경할 수 있습니다.
결과 식별에 만족하면 동일한 실험 내에서 각 조건에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 이렇게 하려면 설정이 각 조건을 준수하는지 확인하기 위해 전체 배치를 분석하기 전에 각 조건에 대한 테스트 이미지를 수집해야 할 수 있습니다. 이미지 수집에 따라 사용자와 소프트웨어 버전 간에 셀 프로파일러 설정에 변동성이 있을 수 있습니다. 따라서 특정 실험에 이상적인 매개 변수를 결정하기 위해 테스트 단계를 통과하는 것이 필수적입니다. 결과를 그래프로 분석할 준비를 할 때 PCNA(S 상)-양수 셀을 식별해야 합니다. 이를 위해 PCNA 강도는 BrdU 강도와 동일한 방식으로 측정되며, 생성된 값은 PCNA 양성 셀에 대한 컷오프 강도 값을 가장 잘 시각화하기 위해 분산 플롯으로 플롯됩니다. 그런 다음 PCNA 음수 결과가 데이터 집합에서 제거되어 BrdU 강도 그래프를 허용합니다. 제공된 보충 수치는 가장 최적화된 설정을 강조하는 프로그램의 스크린샷을 보여줍니다(보충 그림 S1, 보충 도면 S2 및 보충 도면 S3).
프로토콜에 대한 가능한 수정은 사용되는 PCNA 항체이다; 두 개의 다른 PCNA 항체가 성공적으로 테스트되었고, 하나는 여기에 나열된 것과 더 이상 생산-쥐 단일 클론 항체(불독 바이오 PCA16D10)에 더 이상 존재하지 않는다. 마지막으로, 사용자는 항체 인큐베이션 중에 파라필름으로 커버립을 커버해야합니다. 항체 용액의 상당히 큰 양이이없이 완전히 커버 슬립을 커버해야하지만, 엄격하게 필요하지 않습니다. 또 다른 방법은 유리판을 둘러싼 파라필름 시트를 놓고, 항체 용액의 방울을 파라필름에 배치하고, 커버슬립 셀 측을 항체 용액의 낙하에 조심스럽게 놓는 것이다. 이 유리 플레이트는 1 차 잠복을 위해 밤새 4 °C의 습한 챔버와 이차 배양을위한 실온에서 어둠 속에서 배치 할 수 있습니다. 이 방법은 커버립을 처리하는 시간을 크게 증가시키지만 완전히 작동하며, 그 결과 커버슬립이 떨어지거나 파손될 확률이 높아진다.
절제술을 측정하는 다른 방법은 DNA 빗질 SMART 방법의 사용을 통해; 이 기술은 매우 명확한 결과를 제공하지만 훨씬 더 복잡하고 시간이 더 필요하며 더 비싸지 않습니다17. SMART 방법은 DNA를 손상시키지 않고 추출해야 하며, 이 DNA를 커버립에 스트레칭하여 IF가 따라야 합니다. BrdU IF 방법은, 비교하여, 간단하고 비용 효과적이며, 항체의 비용 보다는 더 중대한 투자를 요구하지 않습니다. 이 방법은 단순히 RPA 포시 형성을 측정하는 것보다 더 정확한 절제를 측정하는 초기 방법을 제공합니다, 이는 많은 세포 기능에 미치는 영향과 관련 될 수있다. 그러나, RPA는 DNA 손상 반응의 한 부분으로 절제 도중 특정 잔류물에 인광된다.
단일 분자 화상 진찰은 최근에 음성 절제술 레귤레이터로 인광 RPA (pRPA)를 밝혔습니다. 따라서 장기적으로, 이 방법은 적절한 항체및 최적화된 염색 조건의 사용과 함께 BRdU 화상 진찰과 PCNA/인광 RPA 염색을 결합하여 더욱 정밀하게 만들 수 있었습니다. 그러나, 제시된 방법은 절제 과정에 관여하는 단백질으로부터 독립적으로 관찰되는 절제의 표현을 제공하므로 치료에 반응하여 신호의 변화로부터 발생할 수 있는 편견을 부정한다. 이 기술은 단백질이 절제에 관여하는지 확인하는 방법뿐만 아니라 약물 치료로 인한 세포 사멸이 저체/하이퍼 절제술과 관련이 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다. 이 정보는 DNA 수리의 기계성 측면뿐만 아니라 약물 유발 세포 사멸의 기초의 생물학적 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 뛰어난 기술 적 조언에 대한 마리 크리스틴 카론 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 J.Y.M (CIHR FDN-388879)의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 받고 있습니다. J.-Y.M. DNA 수리 및 암 치료제에서 1단계 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다. J.O'S는 FRQS 박사 과정 학생 펠로우이며, S.Y.M박사 후 펠로우입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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