Summary
在本方案中，我们展示了如何使用基于免疫荧光的方法在细胞周期的S / G2阶段可视化DNA双链末端切除。
Abstract
DNA损伤反应（DDR）的研究是一个复杂而重要的领域，由于使用DDR靶向药物进行癌症治疗，这一领域变得更加重要。这些靶标是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs），其启动各种形式的DNA修复。使用PARP抑制剂（PARPi）抑制这些酶，通过在乳腺癌1型（BRCA1），BRCA2或BRCA2（PALB2）的伴侣和定位剂的突变中赋予同源重组（HR）缺陷细胞的治疗脆弱性来实现合成致死性。
用PARPi处理的细胞积累DNA双链断裂（DSBs）。这些断裂由DNA末端切除机制处理，导致单链（ss）DNA的形成和随后的DNA修复。在BRCA1缺乏的情况下，通过DNA切除抑制剂（如53BP1和DYNLL1）的突变重新激活DNA切除，会导致PARPi耐药性。因此，能够监测 纤维素中的 DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径和开发克服PARPi耐药性的新策略至关重要。基于免疫荧光（IF）的技术允许在DNA损伤后监测整体DNA切除。该策略需要使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）进行长脉冲基因组DNA标记。在DNA损伤和DNA末端切除术之后，产生的单链DNA在天然条件下被抗BrdU抗体特异性检测。此外，还可以使用细胞周期标记物研究DNA切除，以区分细胞周期的各个阶段。S / G2期的细胞允许研究HR内的末端切除术，而G1细胞可用于研究非同源末端连接（NHEJ）。本文描述了这种IF方法耦合到细胞周期判别的详细方案。
Introduction
DNA修复因子的调节是癌症治疗的一种不断发展的方法，特别是在DNA DSB修复缺陷的肿瘤环境中。抑制特定修复因子是用于使癌细胞对DNA损伤剂敏感的巧妙策略之一。数十年的研究导致鉴定出DNA修复基因的各种突变作为治疗策略选择的生物标志物1。因此，DNA修复领域已成为药物开发的中心，以确保广泛的治疗，从而增强个性化医疗概念。
DSB通过两种主要途径进行修复：NHEJ和HR2。NHEJ途径容易出错，快速连接两个DNA末端，几乎没有DNA末端处理，涉及蛋白激酶（DNA-PKcs），Ku70 / 80复合物，53BP1和RIF1蛋白3。相比之下，HR是由BRCA14发起的忠实机制。HR修复的一个重要步骤是DNA末端切除过程，该过程是断裂末端的降解，导致具有3'-OH末端的单链（ss）DNA。BRCA1 促进下游蛋白的募集，这些蛋白形成分离体 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1，这些蛋白参与 5' 至 3' DNA 切除5。
初始末端切除是通过MRE11的内切酶活性完成的，允许DNA2和EXO1核酸酶进一步处理。生成的ssDNA悬垂被复制蛋白A（RPA）快速包被，以保护它们免受进一步处理。随后，BRCA2，PALB2和BRCA1接合以介导RPA的位移和同源定向修复机制所需的RAD51核纤维的组装。NHEJ和HR的使用之间的良好平衡对于基因组完整性的最佳维护是必要的。通路的选择取决于细胞周期阶段。HR优先用于S至G2阶段，其中DNA切除处于最高水平，并且姐妹染色单体可用于确保适当的修复。
聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）是最早招募到DSB的蛋白质之一。它调节切除活性和NHEJ5，6中涉及的下游效应器的组装。在复制过程中，DNA单链断裂修复也需要PARP-17，8。由于其在DNA修复中的重要作用，PARP抑制剂（PARPi）被用作癌症疗法。在几种HR缺陷癌症中，PARPi治疗导致合成致死反应，因为HR缺陷细胞无法通过替代途径修复累积的损伤9，10。目前有四种FDA批准的PARPi：Olaparib，Rucaparib，Niriparib和Talazoparib（也称为BMN 673），用于各种乳腺癌和卵巢癌治疗11。然而，PARPi 耐药性很常见，一个潜在的原因就是通过重新获得 HR 熟练度12 而产生的。在存在辐照的情况下，PARP-1的丢失或抑制会使切除体机制失调，导致更长的ssDNA束积累13。因此，深入研究体内DNA切除对于更清楚地了解DNA修复途径以及随后开发治疗癌症和克服PARPi耐药性的新策略至关重要。
已经有几种方法用于检测DNA切除事件5。其中一种方法是基于IF的经典技术，允许使用抗RPA抗体在应激诱导的DSB后对切除的DNA进行间接染色和可视化。用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记基因组DNA并仅检测ssDNA是对DNA切除事件的直接测量。它规避了RPA的监测，RPA涉及DNA复制等多个细胞过程。在这里描述的方法中，与BrdU一起孵育的细胞进行单个细胞周期允许BrdU掺入复制细胞DNA的一条链中。切除后，在允许仅以ssDNA形式检测BrdU的条件下进行IF染色，并使用抗BrdU抗体。这种抗体只能进入暴露的BrdU核苷酸，不会检测到那些整合到双链DNA中的核苷酸。使用荧光显微镜，切除的DNA可以以点状BrdU / ssDNA病灶的形式可视化。这些病灶的核强度可用作量化DNA损伤后切除的读数。本文逐步描述了该方法的过程，该方法可以应用于大多数哺乳动物细胞系。这种方法应该具有广泛的实用性，作为监测 纤维素中DNA末端切除的简单方法，作为概念证明。
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Protocol
1. 细胞培养、处理和盖玻片制备
注意：除照射外，所有细胞接种、转染和治疗均应在无菌细胞培养罩下进行。
- 第 1 天
- 在6孔板中，在每个孔中放置一个盖玻片，以根据需要满足多种条件。根据需要将约 150，000 个 HeLa 细胞用于转染或药物治疗。
注意：如果转染，建议在接种时进行反向转染，或者可以在接种后数小时进行正向转染以允许粘附。反向转染是通过在加入细胞之前将转染混合物添加到盖玻片中来完成的;因此，转染在细胞开始粘附之前开始。相比之下，正向转染是通常在第二天粘附到表面后添加转染混合物。但是，可以在同一天执行此操作，前提是给予足够的时间让细胞粘附。 - 对于这种方法，使用4孔：孔1：siRNA对照（称为siCTRL）;孔2：针对PARP-1（siPARP-1）的siRNA;井3：未经处理;孔4：在照射前1小时用5μM BMN673处理细胞。
注意：在该协议中，所有测试都是在辐照条件下进行的（见第1.3节）。 - 将细胞在37°C下在5%CO 2 加湿的培养箱中孵育过夜，尽管转染方案允许长达3天的孵育。BrdU处理前的孵育时间取决于siRNA转染效率。如果没有转染，孵育16小时足以允许粘附在盖玻片和一些细胞生长上。
注意：培养箱条件可根据所使用的细胞系进行更改。
- 在6孔板中，在每个孔中放置一个盖玻片，以根据需要满足多种条件。根据需要将约 150，000 个 HeLa 细胞用于转染或药物治疗。
- 第 2 天
- 在适当的培养基中以终浓度为10μM加入BrdU，并孵育16小时（一个细胞周期）。
注意：BrdU溶液用二甲基亚砜制备;使用的储备溶液为10mM，并在-20°C下以等分试样储存。
- 在适当的培养基中以终浓度为10μM加入BrdU，并孵育16小时（一个细胞周期）。
- 第 3 天
- 用总剂量为5 Gy的X射线照射照射板（根据照射器类型改变照射剂量，例如，小动物照射器与台式照射器）。请参阅 材料表 ，了解所用辐照器的品牌和型号。
- 将板返回培养箱，并释放细胞3小时。
- 在3小时的孵育期间，在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备两种缓冲液A和B以及4%多聚甲醛（PFA）。
注意：缓冲液A和B以及蔗糖应在固定当天新鲜制备，使用新鲜的蔗糖溶液以防止污染。- 按照 表1中描述的顺序（30 mL）准备缓冲液A（预提取缓冲液）。
注意：1M蔗糖应在使用当天制备，以防止污染。 - 根据 表1 （30 mL）中描述的顺序制备缓冲液B（细胞骨架剥离缓冲液）。
注意：缓冲液B必须按引用顺序制备，以防止吐温-20和脱氧胆酸钠溶液沉淀。 - 在化学罩下准备4%PFA，每种条件2毫升（10毫升），（表1）。
- 按照 表1中描述的顺序（30 mL）准备缓冲液A（预提取缓冲液）。
2. 预提取和固定
注意：所有预提取和固定均使用留在冰上或4°C的组织培养板中的盖玻片进行;盖玻片仅在安装的最后一步被抬起（参见讨论）。
- 预提取
- 吸出培养基，用1x PBS仔细洗涤细胞两次，然后取出PBS。加入2 mL预提取缓冲液A，并立即在4°C孵育10分钟。
注意：重要的是，缓冲液A中的孵育时间不会延长。在预提取缓冲液中长时间孵育将导致从盖玻片中分离的细胞数量增加。或者，可以在冰上进行孵育，而不是在4°C下孵育。 - 通过抽吸去除缓冲液 A。
注：取出缓冲液 A 后，请勿清洗盖玻片，请继续执行下一步。 - 加入2mL细胞骨架剥离缓冲液B，并立即在4°C孵育10分钟。小心地吸出缓冲液B，并用1x PBS小心地洗涤细胞一次。小心地吸出 1 个 PBS。
- 吸出培养基，用1x PBS仔细洗涤细胞两次，然后取出PBS。加入2 mL预提取缓冲液A，并立即在4°C孵育10分钟。
- 固定
- 通过在化学罩下加入2 mL 4%PFA来固定细胞。
注意：PFA是有毒的，必须在化学罩下进行操作。 - 将细胞在室温下孵育20分钟。用1x PBS清洗盖玻片两次，并吸出多余的。
- 用100%冷甲醇覆盖盖玻片，并将盖玻片在-20°C孵育5分钟。用 1 个 PBS 清洗两次。
注意：协议可以在此处暂停。盖玻片可以在4°C下储存在1x PBS中，如有必要，板可以用铝箔包裹。在继续IF方案之前，细胞不应保持超过5天。
- 通过在化学罩下加入2 mL 4%PFA来固定细胞。
3. 渗透
- 用2mL含有0.5%Triton X-100的1x PBS在室温下孵育细胞15分钟。用2 mL 1x PBS清洗盖玻片三次。
4. 免疫染色
- 阻止步骤
- 准备足够的新鲜封闭缓冲液（3% BSA，1x PBS）以使用每片2 mL。
注意：准备额外的5mL封闭缓冲液以制造抗体溶液。 - 向每个孔中加入2mL封闭缓冲液，并在室温下孵育1小时。
- 准备足够的新鲜封闭缓冲液（3% BSA，1x PBS）以使用每片2 mL。
- 一抗孵育
- 在新鲜的封闭缓冲液中制备一抗溶液：BrdU RPN202 1：1000和增殖细胞核抗原（PCNA）1：500，每个盖玻片100μL。
注意：为了保存抗体，可以使用较小的体积，22 x 22 mm盖玻片为75-100μL，18 x 18 mm盖玻片为50-75μL。 - 在每个盖玻片上，加入100μL一抗溶液。使用镊子用正方形的parafilm覆盖盖玻片，并仔细放置parafilm以免产生气泡。
- 用铝箔覆盖板，并将一抗在4°C下在加湿室中孵育过夜。
- 取出石膏板，并用2 mL无菌1x PBS清洗盖玻片三次。
- 在新鲜的封闭缓冲液中制备一抗溶液：BrdU RPN202 1：1000和增殖细胞核抗原（PCNA）1：500，每个盖玻片100μL。
- 二抗孵育
- 在新鲜封闭缓冲液中制备足够的二抗溶液：抗小鼠488荧光次级A11011（用于BrdU）稀释1：800和抗兔568荧光二次A11011（用于PCNA）稀释1：800。
注意：使用的颜色可以更改以满足实验需求。使用的具体品牌可以在 材料表中找到。 - 在每个盖玻片上加入100μL二抗溶液，用镊子用正方形的副胶片盖住盖玻片，并小心地放置无气泡的副胶片。
- 将二抗在室温下孵育1小时，并用铝箔覆盖的板。
- 用2 mL 1x PBS清洗盖玻片三次。
- 在新鲜封闭缓冲液中制备足够的二抗溶液：抗小鼠488荧光次级A11011（用于BrdU）稀释1：800和抗兔568荧光二次A11011（用于PCNA）稀释1：800。
- 核染色
- 准备一份2毫升的1x PBS，含有4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），终浓度为1μg/mL（1：1000）。
- 在每个盖玻片上加入 2 mL DAPI 溶液。将盖玻片在室温下孵育10分钟，并用铝箔覆盖的板。用 1x PBS 清洗盖玻片两次。
- 用1x PBS盖住盖玻片，并使用针头或细镊子从井底抬起盖玻片。通过在纸巾上轻轻敲击一个边缘，小心地吸干多余的液体。
注：注意不要掉落载玻片或让带有贴壁细胞的平坦表面接触纸张。 - 使用10-20 μL中频专用安装介质将盖玻片安装在载玻片上。
5. 图像采集和分析
注：图像采集可以在几种类型的荧光显微镜上进行。使用带有63x油物镜的落射荧光显微镜;请参阅材料 表 ，了解品牌和型号。Z-stack不是必需的，尽管它们可能有用，具体取决于细胞系和线粒体染色的水平。
- 图像分析
- 对于每个图像，创建多个tiff文件;合并所有平面，但保持颜色通道分开。将这些文件导入细胞探查器（The Broad Institute https://cellprofiler.org/home）并使用斑点计数管道进行分析（补充视频 1）。
- 上传图片（附图S1A）。
- 要开始创建项目，请将斑点计数管道加载到程序中，并在提供的区域中加载要分析的图像。
- 使用 NamesAndTypes 模块为每个图像分配一个有意义的名称，其他模块将通过该名称引用它-C01：表示BrdU通道;C02：代表PCNA频道;C03：表示 DAPI 通道。
注意：这些标识符将取决于显微镜;文件名中应该有一个标识符来区分通道。
- 确定将用于识别原子核的文件并对其进行命名（根据需要更改此名称）（请参阅 补充图S1B 和 补充图S1C）。
- 选择介于 50 到 300 个像素单位之间的对象直径，这是原子核的可接受大小范围，但更改该值以适合图像中的原子核。
注意：可能是50的值太大，并且阻止了较小的细胞核被识别;同样，300可能允许将大群的原子核计为1。 - 丢弃直径范围之外的物体，以确保仅计算符合条件的物体。
- 丢弃接触边框的对象，以移除可能仅部分位于字段中的单元格。
- 应用阈值以适合特定图像。请注意以下设置作为示例。根据阈值策略的严格程度更改阈值校正因子。其他设置包括阈值策略：全局;阈值方法：大津;两类或三类阈值：两类;阈值平滑刻度：1;阈值平滑系数：1;阈值的下限和上限：0.0 和 1.0;区分聚集物体的方法：形状;以及在聚集的对象之间绘制分界线的方法：传播。
注意：对于每个参数，单元探查器为变量设置提供了补充定义和可用的可能性。
- 选择介于 50 到 300 个像素单位之间的对象直径，这是原子核的可接受大小范围，但更改该值以适合图像中的原子核。
- 确定主要对象以识别焦点（附图S2A）。
- 使用以下设置：选择输入图像：蒙版绿色;命名要识别的主要对象：BrdUFoci;物体的典型直径：1-15;丢弃直径范围之外的物体：是;丢弃接触图像边框的物体 ： 否;阈值策略：适应性;阈值方法：大津;二类或三类阈值：三类;阈值平滑刻度：1;阈值平滑系数：3;平滑过滤器的尺寸：4。
- 测量强度（附图S2B）。
- 选择要测量的图像：OrigGreen。
- 点击 添加其他图片。选择要测量的图像：PCNA。选择要测量的对象：原子核。
注：这将用于测量BrdU和PCNA强度 - 将绘制的最终数据。
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Representative Results
在该协议中，基于溴脱氧尿苷（BrdU）的测定用于定量测量HeLa细胞对照射诱导的损伤的切除反应。生成的ssDNA轨迹在免疫荧光染色后被可视化为不同的病灶（图1A）。然后将确定的病灶量化并表示为细胞核中BrdU染色的总综合强度（图1B，补充图S1，补充图S2 和 补充图S3）。可以测量病灶数或平均病灶强度，尽管这可能不如总核强度可靠，这在很大程度上取决于BrdU病灶的可变大小。
为了区分NHEJ引起的短程切除和HR的远程切除，使用抗PCNA抗体进行共染色以鉴定通过S期的细胞（图1 和 补充图S4）。PCNA构成DNA钳夹，作为DNA聚合酶的合成因子，对复制至关重要。PCNA在细胞核中突出，并在细胞周期的S期达到最大表达。因此，在早期S相中，PCNA信号较低且具有粒度分布。相比之下，在晚期S相，PCNA染色非常强烈（图1A）。首次分析PCNA（S相）信号时，必须识别细胞核并测量PCNA强度。
然后将结果值绘制为散点图，以最好地确定区分PCNA阳性和PCNA阴性细胞核的临界强度（补充图S4A）。然后，PCNA阴性结果将从数据集中删除，以便进行基于BrdU强度的分析，因为无论条件如何，BrdU信号都很低（补充图S4B）。在这些实验条件下，PCNA阴性核具有900个任意单位（A.U.）的BrdU病灶的基础综合强度。然而，该值在PCNA阳性细胞核中达到1800 A.U.（图1B）。这表示BrdU病灶的集成信号量增加了100%。然后，BrdU强度的增加可能与DNA切除的增加相关，当细胞经历S和G2相并被照射时，DNA切除更明显，更有效。
在该协议中，为了证明辐照后DNA切除的增加（5 Gy），通过使用siRNA敲低条件通过PARP-1的损失或使用Talazoparib（BMN673）有效抑制PARP-1来调节PARP-1活性（图2 和 补充图S5）。然后在IF后定量每种条件下切除的DNA的量（图2B）。在无扰动条件（siCTRL）下，PCNA阳性核中每个细胞核的BrdU病灶的综合强度约为1500 A.U.（图2A，B）。在使用siRNA有效敲低PARP-1后（图2C），观察到BrdU病灶的强度显着增加至约1900 A.U.，这相当于强度增加26%（p˂0.0001）。同样，在使用BMN673（5μM终浓度）抑制PARP-1后，病灶的强度从大约1750 A.U增加到2500 A.U.，对应于病灶强度增加43%（p˂0.0001）。因此，如前所述，PARP-1的缺失会使DNA切除失调13。
重要的是要记住，BMN-673既抑制PARP-1的活性又将其捕获在DNA中，并且这种处理的效果对细胞的危害更大，导致BrdU强度的增加比siRNA处理的细胞更大。未处理和siCTRL强度的微小差异表明任何处理（例如siRNA转染）都可能影响测定的反应和输出。它可以进一步证明对每个条件使用适当控件的重要性。
图1：BrdU病灶形成在PCNA阳性细胞中比在复制细胞中更容易发生。 （A）5 Gy照射和3小时释放后BrdU病灶形成和PCNA染色的代表性图像。每个 BrdU 图像的角落中都存在一个放大的正方形，显示标记的 BrdU 焦点。比例尺= 5μm.（B）未处理（不含BMN-673）HeLa细胞中BrdU核强度的定量。数据显示均值± s.e.m（曼惠特尼 U-检验）。缩写： BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;PCNA =增殖细胞核抗原;红外 = 辐照;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;A.U. = 任意单位;s.e.m. = 均值的标准误差。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：聚（ADP-核糖）聚合酶-1敲低或抑制导致复制细胞中BrdU病灶形成增加。 （A）未处理的HeLa细胞中BrdU病灶形成和PCNA染色的代表性图像，用5μM BMN-673，siCTRL和siPARP-1处理，然后5 Gy照射和3小时释放。每个 BrdU 图像的角落中都存在一个放大的正方形，显示标记的 BrdU 焦点。（B）定量表在未经处理的HeLa细胞中，用5μM BMN-673，siCTRL和siPARP-1处理，然后进行5 Gy照射，数据显示平均±s.e.m（Mann-Whitney U-test）。（C）蛋白质印迹以验证 PARP-1的siRNA敲低。F1-23 PARP-1抗体可识别自修饰的PARP-1，导致siCTRL条带的涂片外观和BMN-673处理样品中催化抑制的PARP-1的固体外观。缩写： PARP-1 = 聚（ADP-核糖）聚合酶 1;BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;PCNA =增殖细胞核抗原;红外 = 辐照;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;A.U. = 任意单位;siCTRL = siRNA 对照;siPARP-1 = siRNA 敲低 PARP-1;s.e.m. = 均值的标准误差。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 缓冲液 A（预萃取缓冲液）30 mL | ||
| 试剂 | 卷 | 最终浓度 |
| 氢氧化氢 | 18 毫升 | |
| 管道 （pH 7， 500 mM） | 600 μL | 10 毫米 |
| 氯化钠 （4 M） | 750 μL | 100 平方米 |
| 氯化镁2 （1 M） | 90 μL | 3 毫米 |
| 埃格塔 （500 米M） | 60 μL | 1 毫米 |
| Trition X-100 （10%） | 1.5 毫升 | 0.50% |
| 蔗糖（1 M） | 9 毫升 | 300 平方米 |
| 缓冲液B（细胞骨架剥离缓冲液）30 mL | ||
| 试剂 | 卷 | 最终浓度 |
| 氢氧化氢 | 25.035 毫升 | |
| 三分位数 pH 值 7.5 （1 M） | 300 μL | 10 毫米 |
| 氯化钠 （4 M） | 75 μL | 10 毫米 |
| 氯化镁2 （1 M） | 90 μL | 3 毫米 |
| 吐温20 （10%） | 3 毫升 | 1% |
| 10%脱氧胆酸钠 | 1.5 毫升 | 0.50% |
| 试剂 | 卷 |
| 16% PFA | 2.5 毫升 |
| 公共广播公司 1x | 7.5 毫升 |
表 1.
补充图S1：细胞轮廓仪软件和斑点计数管道的可视化表示（第1部分）。 （A）屏幕截图显示了用于识别要分析的图像的不同通道文件的窗口。这些镜头显示了细胞分析器界面。（B） 用于识别原子核的"识别主要对象"菜单的屏幕截图。突出显示的值是最常改变的值，以最好地识别细胞核。缩写： BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：细胞轮廓仪软件和斑点计数管道的可视化表示第2部分。 （A） 识别主要对象菜单的屏幕截图，用于识别细胞核内的 BrdU 病灶。（B）测量对象强度菜单的屏幕截图，用于测量BrdU和PCNA核强度。缩写： BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;PCNA = 增殖细胞核抗原。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：细胞轮廓仪软件和斑点计数管道的可视化表示（第3部分）。 （A）优化后通过细胞轮廓仪表示细胞核鉴定。（B） 表示 BrdU 病灶标识。（C）屏幕截图是对初始窗口中一个单元格的放大。 请点击此处下载此文件。
补充图S4：PCNA阳性和PCNA阴性细胞的散点图。 （A） 用于区分 PCNA 阳性细胞和 PCNA 阴性细胞的 PCNA 散点图示例。绘制了单一病症的PCNA强度图，并确定了两个人群之间的区别。绿色突出显示PCNA阳性细胞，红色代表PCNA阴性细胞。这是针对每个单独的实验和条件完成的。（B）定量PCNA阴性未经处理的HeLa细胞中的BrdU核强度，用5μM BMN-673，siCTRL和siPARP-1处理;数据显示均值± s.e.m（曼惠特尼 U-检验）。缩写： PARP-1 = 聚（ADP-核糖）聚合酶 1;BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;红外 = 辐照;PCNA =增殖细胞核抗原;A.U. = 任意单位;siCTRL = siRNA 对照;siPARP-1 = siRNA 敲低 PARP-1;s.e.m. = 均值的标准误差。 请点击此处下载此文件。
补充图S5：BrdU信号无辐照。 （A）BrdU病灶形成和PCNA染色的代表性图像，无需照射。比例尺 = 5 μm。每个 BrdU 图像的角落中都存在一个放大的正方形，显示标记的 BrdU 焦点。（B）定量PCNA阳性未经处理的Hela细胞中的BrdU核强度，用5μM BMN-673，siCTRL和siPARP-1处理;数据显示均值± s.e.m（曼惠特尼 U-检验）。（C）定量PCNA阴性未经处理的HeLa细胞中的BrdU核强度，用5μM BMN-673，siCTRL和siPARP-1处理;数据显示均值± s.e.m（曼惠特尼 U检验）。缩写： PARP-1 = 聚（ADP-核糖）聚合酶 1;BrdU = 5-溴-2′-脱氧尿苷;PCNA =增殖细胞核抗原;红外 = 辐照;DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;A.U. = 任意单位;siCTRL = siRNA 对照;siPARP-1 = siRNA 敲低 PARP-1;s.e.m. = 均值的标准误差。 请点击此处下载此文件。
补充视频1：使用细胞轮廓仪和斑点计数管道分析BrdU染色以测量DNA切除。 本视频演示了细胞轮廓仪和斑点计数管道的使用。它演示了如何使用此工具专门针对此协议导入和分析图像。缩写：BrdU =5-溴-2′-脱氧尿苷。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
本文描述了一种利用IF染色来测量 纤维素中DNA切除变异的方法。目前观察对DNA切除的影响的标准是通过RPA染色;然而，这是一种可能受DNA复制影响的间接方法。此前，已经描述了另一种基于BrdU掺入的DNA切除IF技术，用于对BrdU阳性和BrdU阴性细胞中产生的强度进行分类。该方法允许由于背景或线粒体染色而未进行HR的细胞被计为阳性，从而导致高BrdU强度14，15，16。本文中描述的方法的主要新颖之处在于添加了PCNA染色，这允许对细胞周期的S和G2相具有选择性，确保产生的BrdU信号是由于切除，从而归因于同源定向修复。
该协议中的关键步骤是预提取;没有这个，BrdU病灶将不可见，如果操作不正确，细胞将完全分离。制备错误的缓冲液将导致预提取不完整，例如部分细胞骨架去除或背景信号增加。尊重使用预提取缓冲液孵育的持续时间非常重要，缓冲液中持续时间的增加会导致细胞从盖玻片中分离。重要的是，如果该协议是用贴壁不良的细胞进行的，则用聚赖氨酸预处理盖玻片以减少预提取期间的细胞脱离。随后，如果没有甲醇固定，PCNA信号将不可见。
该协议中的另一个重要变量是阻塞缓冲器：不兼容的阻塞缓冲器将导致BrdU信号丢失。例如，1x PBS封闭缓冲液中的10%胎牛血清在不与甲醇固定结合使用时将起作用;然而，当与PCNA染色所需的甲醇固定相结合时，BrdU信号会大大降低。其他阻塞代理和方法可能与此协议一起使用;1 倍 PBS 中 3% 的 BSA 提供了最佳效果。该技术的最后一个基本组成部分是使用DNA损伤源;没有这个，将几乎没有核BrdU信号（补充图S5）。经验表明，辐照是这种方法极好的损坏源。然而，如果无法获得辐照器，则可以使用放射性药物，例如新卡嗪抑素。
细胞轮廓仪是一种有用且通用的工具，可以对该技术产生的图像进行简单一致的分析。可以根据所识别对象的大小及其执行此操作的阈值来自定义设置（补充视频 1）。由于BrdU染色的核强度是所需的读数，因此关键的定制是从DAPI文件中识别细胞核。必须单独分析每个条件的图像，因为结果是以单个csv文件的形式获得的，该文件包含单元格和图像编号，而不是条件名称。要确定分析条件是否合适，请使用 "启动测试模式" 功能，并确保在所需步骤中眼睛图标已打开。运行实际分析时关闭此图标，因为它将导致弹出窗口并减慢程序速度。在 "启动测试"模式下，用户可以来回切换，根据需要更改设置，以便首先正确识别细胞核，然后正确识别 BrdU 病灶。
一旦对结果鉴定感到满意，就对同一实验中的每个条件使用相同的设置;这可能需要在分析整个批次之前为每个条件采集测试图像，以确保设置符合每个条件。需要注意的是，根据图像采集的不同，用户之间和软件版本之间的Cell探查器设置可能存在差异。因此，必须通过测试阶段来确定特定实验的理想参数。在准备绘制结果图时，必须鉴定PCNA（S期）阳性细胞。为此，以与BrdU强度相同的方式测量PCNA强度，并将结果值绘制为散点图，以最好地可视化PCNA阳性细胞的临界强度值。然后，PCNA阴性结果将从数据集中删除，以允许BrdU强度绘制。提供的补充图显示了程序的屏幕截图，突出显示了最优化的设置（补充图 S1、补充图 S2 和 补充图 S3）。
对方案的可能修改是使用的PCNA抗体;成功测试了两种不同的PCNA抗体，其中一种在此处列出，另一种已不再生产 - 大鼠单克隆抗体（Bulldog Bio PCA16D10）。最后，在抗体孵育期间，用户应用副膜覆盖盖玻片。这并不是绝对必要的，尽管在没有这个的情况下，需要更大体积的抗体溶液来完全覆盖盖玻片。另一种方法是在玻璃板周围放置一片片伴膜，将抗体溶液滴剂滴到副膜上，然后小心地将盖玻片细胞侧向下放置到抗体溶液滴上。然后，该玻璃板可以放置在4°C的潮湿室中过夜以进行一次孵育，并在室温下在黑暗中进行二次孵育。这种方法是完全有效的，尽管它确实显着增加了处理盖玻片的时间，因此增加了掉落或破坏盖玻片的可能性。
测量切除的另一种方法是使用DNA梳理SMART方法;虽然这种技术提供了非常清晰的结果，但它要复杂得多，需要更多的时间，而且更昂贵17。SMART方法要求在不破坏DNA的情况下提取DNA，然后将该DNA拉伸到盖玻片上，然后进行IF。相比之下，BrdU IF方法既简单又具有成本效益，不需要比抗体成本更多的投资。这种方法提供了一种测量切除术的初始方法，比简单地测量RPA病灶的形成更准确，这可能与其对许多细胞功能的影响有关。然而，作为DNA损伤反应的一部分，RPA在切除过程中在特定残基上磷酸化。
单分子成像最近显示磷酸化RPA（pRPA）是阴性切除调节因子18。因此，从长远来看，通过将PCNA /磷酸化RPA染色与BrdU成像相结合，并使用适当的抗体和优化的染色条件，这种方法可以变得更加精确。然而，所提出的方法提供了独立于切除过程中涉及的蛋白质观察切除的表示，从而否定了响应治疗的信号变化可能产生的偏倚。该技术不仅提供了一种确定蛋白质是否参与切除的方法，而且还提供了确定药物治疗引起的细胞死亡是否与切除减退/过度切除有关的方法。这些信息不仅有助于理解DNA修复的机制方面，还有助于理解药物诱导的细胞死亡背后的生物学机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Marie-Christine Caron出色的技术建议。这项工作得到了加拿大卫生研究院J.Y.M（CIHR FDN-388879）的资助。J.-Y.M.在DNA修复和癌症治疗方面拥有加拿大一级研究主席。J.O'S是FRQS博士生研究员，S.Y.M是FRQS博士后研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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