Summary
No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.
Abstract
O estudo da resposta a danos no DNA (DDR) é um campo complexo e essencial, que só se tornou mais importante devido ao uso de medicamentos direcionados ao DDR para o tratamento do câncer. Estes alvos são poli (ADP-ribose) polimerases (PARPs), que iniciam várias formas de reparação de DNA. Inibir essas enzimas utilizando inibidores parp (PARPi) atinge a letalidade sintética conferindo uma vulnerabilidade terapêutica em células deficientes de recombinação homólogo (RH) devido a mutações no câncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2 ou parceiro e localizador do BRCA2 (PALB2).
As células tratadas com PARPi acumulam quebras de duplo fio de DNA (DSBs). Essas quebras são processadas pelo maquinário de ressecção final de DNA, levando à formação de DNA mono-encalhado (ss) e posterior reparação de DNA. Em um contexto deficiente brca1, revigorar a ressecção do DNA através de mutações em inibidores de ressecção de DNA, como 53BP1 e DYNLL1, causa resistência parpi. Portanto, ser capaz de monitorar a ressecção de DNA em celulose é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento de novas estratégias para superar a resistência do PARPi. As técnicas baseadas em imunofluorescência (IF) permitem o monitoramento da ressecção global de DNA após danos no DNA. Esta estratégia requer rotulagem de DNA genômico de pulso longo com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU). Após danos no DNA e ressecção da extremidade do DNA, o DNA de uma única cadeia resultante é especificamente detectado por um anticorpo anti-BrdU em condições nativas. Além disso, a ressecção de DNA também pode ser estudada usando marcadores de ciclo celular para diferenciar entre várias fases do ciclo celular. As células da fase S/G2 permitem o estudo da ressecção final dentro do RH, enquanto as células G1 podem ser usadas para estudar a junção final não homólogo (NHEJ). Um protocolo detalhado para este método IF acoplado à discriminação do ciclo celular é descrito neste artigo.
Introduction
Modulação de fatores de reparação de DNA é um método em constante evolução para a terapia do câncer, particularmente em ambientes tumorais deficientes de reparação de DNA DSB. A inibição de fatores de reparação específicos é uma das estratégias engenhosas usadas para sensibilizar as células cancerígenas para agentes prejudiciais ao DNA. Décadas de pesquisa levaram à identificação de várias mutações de genes de reparação de DNA como biomarcadores para escolhas de estratégia terapêutica1. Consequentemente, o campo de reparação de DNA tornou-se um centro de desenvolvimento de medicamentos para garantir uma ampla gama de tratamentos, capacitando o conceito de medicina personalizada.
Os DSBs são reparados por duas vias principais: NHEJ e HR2. A via NHEJ é propensa a erros, ligando rapidamente as duas extremidades de DNA com pouco ou nenhum processamento final de DNA e envolvendo a quinase proteica (DNA-PKcs), o complexo Ku70/80, 53BP1 e RIF1 proteins3. Em contrapartida, o RH é um mecanismo fiel iniciado pelo BRCA14. Um passo essencial na reparação do RH é o processo de ressecção do DNA-end, que é a degradação das extremidades quebradas levando ao DNA de um único fio (ss) com extremidades de 3'-OH. O BRCA1 facilita o recrutamento das proteínas a jusante que formam o resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que estão envolvidos na ressecção de DNA de 5' a 3'5.
A ressecção final inicial é realizada através da atividade endonuclease do MRE11, permitindo um processamento adicional pelos núcleos DNA2 e EXO1. As ssDNA ssDNA geradas são rapidamente revestidas por Proteína de Replicação A (RPA) para protegê-los de mais processamento. Posteriormente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 se engajam para mediar o deslocamento do RPA e a montagem do nucleofilamento RAD51 necessário para o mecanismo de reparação direcionado à ímologia. Um bom equilíbrio entre o uso de NHEJ e RH é necessário para a manutenção ideal da integridade genômica. A escolha do caminho depende da fase do ciclo celular. O RH é usado preferencialmente durante as fases S e G2, onde a ressecção de DNA está no mais alto nível, e as cromátides irmãs estão disponíveis para garantir o reparo adequado.
Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1) é uma das primeiras proteínas recrutadas para o DSB. Regula tanto a atividade de ressecção quanto a montagem de efeitos a jusante envolvidos no NHEJ5,6. PARP-1 também é necessário para o reparo de quebra de um único fio de DNA durante a replicação7,8. Devido ao seu importante papel na reparação do DNA, os inibidores PARP (PARPi) são usados como terapias contra o câncer. Em vários cânceres deficientes de RH, o tratamento PARPi leva a uma resposta letal sintética devido à incapacidade das células deficientes de RH para reparar o dano acumulado através de uma via alternativa9,10. Atualmente existem quatro PARPi aprovados pela FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (também chamado de BMN 673), que são usados para vários tratamentos de câncer de mama e ovário11. No entanto, a resistência parpi é comum, e uma causa potencial surge através da reaquisição da proficiência em RH12. A perda ou inibição do PARP-1 na presença de irradiação desregula o maquinário resectoso, levando ao acúmulo de tratos SSDNA mais longos13. Portanto, um estudo aprofundado da ressecção de DNA in vivo é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento subsequente de novas estratégias para tratar o câncer e superar a resistência do PARPi.
Existem vários métodos empregados para detectar eventos de ressecção de DNA5. Um desses métodos é a técnica clássica baseada em IF que permite a coloração indireta e visualização do DNA ressecado após dSB induzido pelo estresse usando um anticorpo anti-RPA. Rotular DNA genômico com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) e detectar apenas ssDNA é uma medição direta de eventos de ressecção de DNA. Contorna o monitoramento do RPA, que está envolvido em múltiplos processos celulares, como a replicação de DNA. No método descrito aqui, as células incubadas com BrdU para um único ciclo celular permitem que BrdU seja incorporada em um fio do DNA celular replicante. Após a ressecção, a coloração if é realizada em condições que permitem a detecção de BrdU apenas na forma ssDNA, com o uso de um anticorpo anti-BrdU. Este anticorpo só pode acessar nucleotídeos brdu expostos e não detectará aqueles integrados em DNA de dupla cadeia. Utilizando microscopia de fluorescência, o DNA ressecado pode ser visualizado na forma de focos de BrdU/ssDNA pontuados. A intensidade nuclear desses focos pode ser usada como leitura para quantificar a ressecção após danos no DNA. Este artigo descreve passo a passo os processos deste método, que podem ser aplicados à maioria das linhas celulares de mamíferos. Este método deve ser de ampla utilidade como uma forma simples de monitorar a ressecção final do DNA no celulose, como prova de conceito.
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Protocol
1. Cultura celular, tratamentos e preparação de clipes
NOTA: Todos os revestimentos celulares, transfecções e tratamentos, além da irradiação, devem ocorrer sob uma capa de cultura celular estéril.
- Dia 1º
- Em uma placa de 6 poços, coloque uma única mancha de cobertura em cada poço para quantas condições for necessário. Placa ~150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso, conforme desejado.
NOTA: Se transfetar, recomenda-se fazer uma transfecção reversa no momento do revestimento, ou é possível fazer uma transfecção para a frente várias horas após o revestimento para permitir a adesão. Uma transfecção reversa é realizada adicionando a mistura de transfecção ao deslizamento antes que as células sejam adicionadas; assim, a transfecção começa antes que as células comecem a aderir. Uma transfecção para a frente, em contraste, é a adição da mistura de transfecção pós-adesão à superfície geralmente no dia seguinte. No entanto, é possível fazer isso no mesmo dia, desde que seja dado tempo suficiente para as células aderirem. - Para este método, utilize 4 poços: Bem 1: controle siRNA (denominado siCTRL); Bem 2: siRNA contra PARP-1 (siPARP-1); Bem 3: não tratado; Bem 4: Células a serem tratadas com 5 μM BMN673 1 h antes da irradiação.
NOTA: Neste protocolo, todos os testes foram realizados em condições irradiadas (ver seção 1.3). - Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 de 5% durante a noite, embora o protocolo de transfecção permita até 3 dias de incubação. O tempo de incubação antes do tratamento da BrdU dependerá da eficiência de transfecção do siRNA. Se não houver transfecção, a incubação por 16 h é suficiente para permitir a adesão ao deslizamento de cobertura e algum crescimento celular.
NOTA: As condições da incubadora podem ser alteradas de acordo com a linha celular utilizada.
- Em uma placa de 6 poços, coloque uma única mancha de cobertura em cada poço para quantas condições for necessário. Placa ~150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso, conforme desejado.
- Dia 2.
- Adicione BrdU em uma concentração final de 10 μM na mídia de cultivo apropriada, e incubar por 16 h (um ciclo celular).
NOTA: A solução brdU é preparada em dimetilsulfoxida; a solução de estoque utilizada é de 10 mM e é armazenada em alíquotas a -20 °C.
- Adicione BrdU em uma concentração final de 10 μM na mídia de cultivo apropriada, e incubar por 16 h (um ciclo celular).
- Dia 3.
- Irradie as placas com uma dose total de 5 Giros de irradiação de raios-X (varie a dose de irradiação dependendo do tipo irradiador, por exemplo, pequenos irradiadores animais vs. irradiadores benchtop). Veja a Tabela de Materiais para a marca e modelo de irradiador utilizado.
- Devolva as placas à incubadora e solte as células por 3h.
- Durante o período de incubação de 3 h, prepare os dois buffers, A e B, e 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Os buffers A e B e a sacarose devem ser preparados frescos no dia da fixação, utilizando solução de sacarose fresca para evitar contaminação.- Prepare o buffer A (Buffer pré-extração), de acordo com a ordem (30 mL) descrita na Tabela 1.
NOTA: A sacarose 1M deve ser preparada no dia do uso para evitar contaminação. - Prepare o buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) de acordo com a ordem descrita na Tabela 1 (30 mL).
NOTA: O buffer B deve ser preparado na ordem citada para evitar a precipitação da solução de desoxicolato de Tween-20 e desoxicolato de sódio. - Prepare 4% PFA, 2 mL por condição (10 mL), sob uma capa química (Tabela 1).
- Prepare o buffer A (Buffer pré-extração), de acordo com a ordem (30 mL) descrita na Tabela 1.
2. Pré-extração e fixação
NOTA: Toda a pré-extração e fixação são realizadas com as tampas remanescentes na placa de cultura tecidual no gelo ou a 4 °C; o deslizamento de cobertura só é levantado na última etapa de montagem (ver discussão).
- Pré-extração
- Aspire o meio, lave cuidadosamente as células duas vezes com 1x PBS e remova o PBS. Adicione 2 mL de Tampão A pré-extração e incuba imediatamente a 4 °C por 10 min.
NOTA: É importante que o tempo de incubação no buffer A não seja estendido. A incubação estendida nos buffers de pré-extração resultará em um aumento do número de células separadas do deslizamento de cobertura. Alternativamente, em vez de incubação a 4°C, a incubação pode ser feita no gelo. - Remova o Buffer A através da aspiração.
NOTA: Não lave as tampas após a remoção do buffer A. Vá para a próxima etapa. - Adicione 2 mL de Citoesqueleto Descascando tampão B e incubar imediatamente a 4 °C por 10 min. Aspire cuidadosamente o Buffer B e lave cuidadosamente as células uma vez com 1x PBS. Aspire cuidadosamente o 1x PBS.
- Aspire o meio, lave cuidadosamente as células duas vezes com 1x PBS e remova o PBS. Adicione 2 mL de Tampão A pré-extração e incuba imediatamente a 4 °C por 10 min.
- Fixação
- Conserte as células adicionando 2 mL de 4% pfa sob a capa química.
NOTA: O PFA é tóxico e deve ser manipulado sob uma capa química. - Incubar as células à temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS e aspire o excesso.
- Cubra as tampas com metanol 100% frio e incubar as tampas a -20 °C por 5 min. Lave duas vezes com 1x PBS.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As tampas podem ser armazenadas a 4 °C em 1x PBS e a placa envolta em papel alumínio, se necessário. As células não devem ser mantidas mais de 5 dias antes de continuar o protocolo IF.
- Conserte as células adicionando 2 mL de 4% pfa sob a capa química.
3. Permeabilização
- Incubar as células com 2 mL de 1x PBS contendo Triton X-100 de 0,5% à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.
4. Imunostaining
- Etapa de bloqueio
- Prepare um buffer de bloqueio fresco suficiente (3% BSA em 1x PBS) para usar 2 mL por tampa.
NOTA: Prepare um buffer extra de 5mL para fazer as soluções de anticorpos. - Adicione 2 mL de tampão de bloqueio a cada poço e incubar à temperatura ambiente por 1h.
- Prepare um buffer de bloqueio fresco suficiente (3% BSA em 1x PBS) para usar 2 mL por tampa.
- Incubação primária de anticorpos
- Prepare a solução primária de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: BrdU RPN202 1:1000 e proliferante de antígeno nuclear celular (PCNA) 1:500, 100 μL por deslizamento de cobertura.
NOTA: Para preservar o anticorpo, pode-se utilizar um volume menor, 75-100 μL para um deslizamento de cobertura de 22 x 22 mm, 50-75 μL para uma mancha de cobertura de 18 x 18 mm. - Em cada deslizamento de cobertura, adicione 100 μL de solução de anticorpos primários. Cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças, e posicione cuidadosamente o parafilm para não criar bolhas.
- Cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
- Remova os quadrados de parafilm e lave as tampas três vezes com 2 mL de PBS 1x estéril.
- Prepare a solução primária de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: BrdU RPN202 1:1000 e proliferante de antígeno nuclear celular (PCNA) 1:500, 100 μL por deslizamento de cobertura.
- Incubação secundária de anticorpos
- Prepare solução secundária suficiente de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: diluição secundária anti-mouse 488 fluorescente A11011 (para BrdU) 1:800 e diluição anti-coelho 568 fluorescente secundária A11011 (para PCNA) diluição 1:800.
NOTA: As cores utilizadas podem ser alteradas para atender às necessidades experimentais. A marca específica utilizada pode ser encontrada na Tabela de Materiais. - Adicione em cada tampalip 100 μL de solução de anticorpos secundários, cubra as tampas com um quadrado de parafilm usando pinças e posicione cuidadosamente o parafilm sem bolhas.
- Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por 1h com a placa coberta de papel alumínio.
- Lave as tampas três vezes com 2 mL de 1x PBS.
- Prepare solução secundária suficiente de anticorpos em tampão de bloqueio fresco: diluição secundária anti-mouse 488 fluorescente A11011 (para BrdU) 1:800 e diluição anti-coelho 568 fluorescente secundária A11011 (para PCNA) diluição 1:800.
- Coloração nuclear
- Prepare um volume de 2 mL por deslizamento de cobertura de 1x PBS contendo 4',6-diamidino-2-fenilômicos (DAPI) em uma concentração final de 1 μg/mL (1:1000).
- Adicione em cada tampalip 2 mL da solução DAPI. Incubar as tampas à temperatura ambiente por 10 minutos com a placa coberta de papel alumínio. Lave as tampas duas vezes com 1x PBS.
- Cubra as tampas com 1x PBS e use uma agulha ou uma pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel.
NOTA: Tenha cuidado para não soltar o slide ou permitir que a superfície plana com as células aderentes toque no papel. - Monte as tampas em slides usando 10-20 μL de mídia de montagem específica if.
5. Aquisição e análise de imagens
NOTA: A aquisição de imagens pode ser feita em vários tipos de microscópios fluorescentes. Utilizou-se um microscópio de epifluorescência com um objetivo de óleo de 63x; ver a Tabela de Materiais para a marca e modelo. Pilhas Z não são necessárias, embora possam ser de uso dependendo da linha celular e nível de coloração mitocondrial.
- Análise de imagem
- Para cada imagem, crie vários arquivos de tiff; mesclar todos os planos, mas mantenha os canais de cores separados. Importe esses arquivos para o Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) e analise usando o pipeline de contagem de manchas (Vídeo Suplementar 1).
- Upload das imagens (Figura Suplementar S1A).
- Para começar a criar o projeto, carregue o pipeline de contagem de manchas para dentro do programa e as imagens a serem analisadas na área fornecida.
- Use o módulo NamesAndTypes para atribuir um nome significativo a cada imagem pela qual outros módulos se referirão a ela-C01: Representando canal brdU; C02: Representando o Canal PCNA; C03: Representando o Canal DAPI.
NOTA: Estes identificadores dependerão do microscópio; deve haver um identificador no nome do arquivo para distinguir entre os canais.
- Identifique qual arquivo será usado para identificar os núcleos e nomeá-lo (altere este nome conforme necessário) (ver Figura Suplementar S1B e Figura Suplementar S1C).
- Selecione o diâmetro do objeto entre unidades de 50 a 300 pixels, que é a faixa de tamanho aceitável para núcleos, mas altere o valor para se encaixar nos núcleos da imagem.
NOTA: Pode ser que 50 seja um valor muito grande e impeça a identificação de núcleos menores; da mesma forma, 300 podem permitir que grandes agrupamentos de núcleos sejam contados como 1. - Descarte objetos fora da faixa de diâmetro para garantir que apenas aqueles que correspondem aos critérios serão contados.
- Descarte objetos que toquem bordas para remover células que podem estar apenas parcialmente no campo.
- Aplique o limiar para se encaixar nas imagens específicas. Observe as seguintes configurações como exemplo. Alterar o fator de correção de limiar com base no quão rigorosa será a estratégia de limiar. Outras configurações incluem estratégia limiar: Global; método de limiar: Otsu; duas classes ou três classe limiar: Duas classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 1; limites inferiores e superiores no limiar: 0,0 e 1,0; método para distinguir objetos desajeitados: Forma; e método para desenhar linhas divisórias entre objetos agrupados: Propagar.
NOTA: Para cada parâmetro, o profiler de células fornece definições complementares e possibilidade disponível para a configuração variável.
- Selecione o diâmetro do objeto entre unidades de 50 a 300 pixels, que é a faixa de tamanho aceitável para núcleos, mas altere o valor para se encaixar nos núcleos da imagem.
- Identificar o objeto primário para identificar os focos (Figura Suplementar S2A).
- Use as seguintes configurações: selecione a imagem de entrada: Maskedgreen; chamado de objeto primário a ser identificado: BrdUFoci; diâmetro típico do objeto: 1-15; descartar o objeto fora da faixa de diâmetro: Sim; descartar o objeto tocando a borda da imagem: Não; estratégia limiar: Adaptativo; método de limiar: Otsu; duas classes ou três de classe limiar: três classes; escala de alisamento de limiares: 1; fator de alisamento do limiar: 3; e tamanho do filtro de alisamento: 4.
- Intensidade de medida (Figura Suplementar S2B).
- Selecione a imagem a ser medida: OrigGreen.
- Clique em Adicionar outra imagem. Selecione a imagem a ser medida: PCNA. Selecione objetos para medir: Núcleos.
NOTA: Este será usado para medir a intensidade de BrdU e PCNA - os dados finais que serão gráficos.
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Representative Results
Neste protocolo, o ensaio baseado em bromodeoxyuridina (BrdU) foi usado para medir quantitativamente a resposta de ressecção das células HeLa para danos induzidos por irradiação. As faixas de SSDNA geradas são visualizadas como focos distintos após a coloração da imunofluorescência (Figura 1A). Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração da BRDU nos núcleos (Figura 1B, Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3). É possível medir o número de focos ou intensidade média de focos, embora isso possa ser menos confiável do que a intensidade nuclear total, em parte para o tamanho variável dos focos brdU.
Para diferenciar entre a ressecção de curto alcance como resultado do NHEJ e da ressecção de longo alcance do RH, a co-coloração foi realizada utilizando um anticorpo anti-PCNA para identificar células que passam pela fase S (Figura 1 e Figura Suplementar S4). PCNA constitui o grampo de DNA que atua como fator de processividade para polimerase de DNA e é essencial para a replicação. O PCNA é proeminente no núcleo e atinge a expressão máxima durante a fase S do ciclo celular. Assim, no início da fase S, o sinal PCNA é baixo e tem uma distribuição granular. Em contraste, no final da fase S, a coloração do PCNA é bastante forte (Figura 1A). Ao analisar pela primeira vez o sinal PCNA (fase S), os núcleos devem ser identificados e a intensidade PCNA medida.
Os valores resultantes são então plotados como um gráfico de dispersão para determinar melhor a intensidade de corte para discriminar entre os núcleos PCNA positivo e PCNA-negativo (Figura Suplementar S4A). Os resultados PCNA-negativos serão então removidos do conjunto de dados para permitir a análise baseada em intensidade de BrdU devido ao sinal de BrdU baixo, independentemente da condição (Figura Suplementar S4B). Nessas condições experimentais, os núcleos PCNA-negativo abrigam uma intensidade basal integrada de focos de BrdU de 900 unidades arbitrárias (A.U.). No entanto, esse valor chega a 1800 A.U. em núcleos pcna-positivos (Figura 1B). Isso representa um aumento de 100% na quantidade do sinal integrado dos focos de BRdU. O aumento da intensidade de BrdU pode ser então correlacionado a um aumento na ressecção de DNA, que é mais pronunciado e eficiente quando as células passam por fases S e G2 e são irradiadas.
Neste protocolo, para demonstrar um aumento na ressecção de DNA após a irradiação (5 Gy), a atividade PARP-1 foi modulada através da perda de PARP-1 usando uma condição de knockdown siRNA ou após potente inibição de PARP-1 usando Talazoparib (BMN673) (Figura 2 e Figura Suplementar S5). As quantidades de DNA ressecado em cada condição foram então quantificadas após IF (Figura 2B). Em condições não perturbadas (siCTRL), a intensidade integrada de focos de BrdU por núcleo é de aproximadamente 1500 A.U. nos núcleos pcna-positivo (Figura 2A,B). Após um knockdown eficiente de PARP-1 usando um siRNA (Figura 2C), observou-se um aumento significativo na intensidade dos focos brdU para aproximadamente 1900 A.U., o que corresponde a um aumento de 26% na intensidade (p ˂ 0,0001). Da mesma forma, após a inibição do PARP-1 usando BMN673 (concentração final de 5 μM), a intensidade dos focos aumentou de aproximadamente 1750 para 2500 A.U. correspondendo a um aumento de 43% da intensidade dos focos (p ˂ 0,0001). Assim, a perda de PARP-1 desregula a ressecção de DNA, conforme relatado anteriormente13.
É importante lembrar que o BMN-673 inibe tanto a atividade do PARP-1 quanto a prende no DNA, e o efeito deste tratamento é muito mais prejudicial para a célula, resultando no aumento maior da intensidade do BrdU do que nas células tratadas com siRNA. A pequena diferença nas intensidades não tratadas e siCTRL demonstra como qualquer tratamento, como a transfecção do siRNA, pode afetar a resposta e a saída de um ensaio. Pode demonstrar ainda a importância de usar os controles adequados para cada condição.
Figura 1: A formação de focos brdU é mais propensa a ocorrer em células positivas do PCNA do que em células replicantes. (A) Imagens representativas da formação de focos brdU e coloração PCNA após irradiação de 5 Giros e liberação de 3h. Um quadrado com zoom mostrando focos brdU marcados está presente no canto de cada imagem da BrdU. Barras de escala = 5 μm. (B) Quantificação da intensidade nuclear de BrdU em células HeLa não tratadas (sem BMN-673). Os dados mostram a média ± s.e.m (teste U de Mann-Whitney). Abreviaturas: BrdU = 5-bromo-2'-desoxyuridina; PCNA = célula proliferando antígeno nuclear; IR = irradiação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; A.U. = unidades arbitrárias; s.e.m. = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Poli (ADP-ribose) polimerase-1 knockdown ou inibição resulta em aumento da formação de focos de BrdU em células replicantes. (A) Imagens representativas da formação de focos brdU e coloração PCNA em células HeLa não tratadas, tratadas com 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1, seguidas por irradiação gy 5 e liberação de 3 h. Um quadrado com zoom mostrando focos brdU marcados está presente no canto de cada imagem da BrdU. Barras de escala = 5 μm. (B) Quantificação da intensidade nuclear de BrdU em células HeLa não tratadas, tratadas com 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1 seguidas de irradiação 5 Gy, os dados mostram a média ± s.e.m (teste U mann-whitney). (C) Mancha ocidental para validar o knockdown siRNA de PARP-1. O anticorpo F1-23 PARP-1 reconhece PARP-1 automodificado, resultando no aparecimento manchado da banda siCTRL e na aparência sólida do PARP-1 catalyticamente inibido em amostras tratadas com BMN-673. Abreviaturas: PARP-1 = poli (ADP-ribose) polimerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-desoxyuridina; PCNA = célula proliferando antígeno nuclear; IR = irradiação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; A.U. = unidades arbitrárias; siCTRL = controle siRNA; siPARP-1 = siRNA para derrubar PARP-1; s.e.m. = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer A (Buffer pré-extração) 30 mL | ||
| Reagente | Volume | Concentração Final |
| H2O | 18 mL | |
| PIPES (pH 7.500 mM) | 600 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| EGTA (500 mM) | 60 μL | 1 mM |
| Trition X-100 (10%) | 1,5 mL | 0.50% |
| Sacarose (1 M) | 9 mL | 300 mM |
| Buffer B (Tampão de descascamento de citoesqueleto) 30 mL | ||
| Reagente | Volume | Concentração Final |
| H2O | 25.035 mL | |
| Tris pH 7.5 (1 M) | 300 μL | 10 mM |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 mM |
| MgCl2 (1 M) | 90 μL | 3 mM |
| Tween20 (10%) | 3 mL | 1% |
| Desoxicoscólcate de sódio 10% | 1,5 mL | 0.50% |
| Reagente | Volume |
| 16% PFA | 2,5 mL |
| PBS 1x | 7,5 mL |
Mesa 1.
Figura Suplementar S1: Representação visual do Software De Perfil celular e da especificação da parte 1 do pipeline. (A) A captura de tela mostra a janela usada para identificar os diferentes arquivos de canais das imagens a serem analisadas. Essas fotos mostram a interface do profiler de células. (B) Captura de tela do menu Identificar Objetos Primários para identificar os Núcleos. Os valores destacados são os valores comumente alterados para melhor identificar núcleos. Abreviaturas: BrdU = 5-bromo-2'-desoxyuridina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S2: Representação visual do Software De Perfil celular e da especificação da parte 2 do pipeline. (A) Captura de tela do menu Identificar Objetos Primários para identificar os focos brdU dentro dos núcleos. (B) Captura de tela do menu Measure Object Intensity para medir a intensidade nuclear de BrdU e PCNA. Abreviaturas: BrdU = 5-bromo-2'-desoxyuridina; PCNA = célula proliferando antígeno nuclear. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S3: Representação visual do Software de Profiler celular e speckle contando pipeline parte 3. (A) Representação dos núcleos de identificação por profiler celular após otimização. (B) Representação da identificação de focos da BRDU. (C) Captura de tela é um zoom-in em uma célula dentro da janela inicial. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura Suplementar S4: Dispersar o enredo de células PCNA positivas e PCNA-negativas. (A) Um exemplo de um gráfico de dispersão PCNA usado para distinguir PCNA positivo das células PCNA-negativas. A intensidade do PCNA a partir de uma única condição foi traçada e a distinção entre as duas populações identificadas. O verde destaca as células positivas do PCNA, o vermelho representa as células PCNA-negativas. Isso é feito para cada experimento e condição individual. (B) Quantificação da intensidade nuclear de BrdU em células HeLa não tratadas PCNA-negativo, tratadas com 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1; os dados mostram a média ± s.e.m (Teste U de Mann-Whitney). Abreviaturas: PARP-1 = poli (ADP-ribose) polimerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-desoxyuridina; IR = irradiação; PCNA = célula proliferando antígeno nuclear; A.U. = unidades arbitrárias; siCTRL = controle siRNA; siPARP-1 = siRNA para derrubar PARP-1; s.e.m. = erro padrão da média. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S5: Sinal brdU sem irradiação. (A) Imagens representativas da formação de focos brdU e coloração PCNA sem irradiação. Barras de escala = 5 μm. Um quadrado com zoom mostrando focos brdU marcados está presente no canto de cada imagem da BrdU. (B) Quantificação da intensidade nuclear de BrdU em células hela não tratadas pcna-positivas, tratadas com 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1; os dados mostram a média ± s.e.m (Teste U de Mann-Whitney). (C) Quantificação da intensidade nuclear de BrdU em células HeLa não tratadas PCNA-negativa, tratadas com 5 μM BMN-673, siCTRL e siPARP-1; os dados mostram a média ± s.e.m (Teste U de Mann-Whitney). Abreviaturas: PARP-1 = poli (ADP-ribose) polimerase 1; BrdU = 5-bromo-2′-desoxyuridina; PCNA = célula proliferando antígeno nuclear; IR = irradiação; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; A.U. = unidades arbitrárias; siCTRL = controle siRNA; siPARP-1 = siRNA para derrubar PARP-1; s.e.m. = erro padrão da média. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Vídeo suplementar 1: Uso de Cell Profiler e o pipeline de contagem de manchas para analisar a coloração de BrdU para a medição da ressecção de DNA. Este vídeo demonstra o uso do Cell Profiler e do pipeline de contagem speckle. Ele mostra como importar e analisar imagens com esta ferramenta especificamente para este protocolo. Abreviação: BrdU =5-bromo-2'-desoxyuridina. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Este artigo descreve um método que faz uso da coloração IF para medir variações na ressecção de DNA no celulose. O padrão atual para observar um efeito na ressecção do DNA é através da coloração de RPA; no entanto, este é um método indireto que pode ser influenciado pela replicação do DNA. Anteriormente, outra técnica de SEC baseada em incorporação de DNA baseada em BrdU foi descrita para classificar as intensidades resultantes em células brdU-positivas e brdU-negativos. Esse método permitiu que as células que não estão submetidas ao RH fossem contadas como positivas devido a antecedentes ou manchas mitocondriais, resultando em alta intensidade de R$ 14,15,16. A principal novidade do método descrito neste artigo é a adição da coloração PCNA, que permite a seletividade para as fases S e G2 do ciclo celular, garantindo que o sinal de BrdU resultante seja devido à ressecção e, portanto, ao reparo direcionado à mente.
O passo crítico neste protocolo é a pré-extração; sem isso, os focos brdU não serão visíveis, e se feito incorretamente, as células se desprenderão completamente. Buffers preparados incorretamente resultarão em pré-extração incompleta, como remoção citoesquelélal parcial ou aumento do sinal de fundo. É muito importante respeitar a duração da incubação com os buffers de pré-extração, o aumento da duração nos buffers pode resultar na desvinculação das células do deslizamento de cobertura. É importante ressaltar que, se este protocolo for realizado com células pouco aderentes, pré-trate os deslizamentos com polilise para reduzir o descolamento celular durante a pré-extração. Posteriormente, sem fixação de metanol, o sinal PCNA não será visível.
Outra variável importante neste protocolo é o buffer de bloqueio: buffers de bloqueio incompatíveis resultarão em perda de sinal de BrdU. Por exemplo, 10% de soro bovino fetal no buffer de bloqueio pbs 1x funcionará quando não combinado com fixação de metanol; no entanto, quando combinado com a fixação de metanol conforme necessário para a coloração pcna, o sinal brdU é consideravelmente reduzido. É possível que outros agentes e métodos de bloqueio trabalhem com este protocolo; 3% BSA em 1x PBS forneceu os melhores resultados. Um componente essencial final para esta técnica é o uso de uma fonte de dano de DNA; sem isso, haverá pouco ou nenhum sinal nuclear de BrdU (Figura Suplementar S5). A experiência mostrou que a irradiação é uma excelente fonte de dano para este método. No entanto, se não houver acesso a um irradiador, drogas radiomiéticas como a neocarzinostatina podem ser usadas em seu lugar.
O profiler celular é uma ferramenta útil e versátil que permite uma análise fácil e consistente das imagens produzidas nesta técnica. As configurações podem ser personalizadas tanto para o tamanho dos objetos identificados quanto para o limiar em que o faz (Vídeo Suplementar 1). Como a intensidade nuclear da mancha brdu é a leitura desejada, a personalização chave está na identificação dos núcleos a partir dos arquivos DAPI. A análise das imagens de cada condição deve ser feita separadamente, pois os resultados são obtidos na forma de um único arquivo csv contendo números de células e imagens, mas não nomes de condições. Para determinar se as condições de análise são apropriadas, use o recurso de modo de teste Iniciar e certifique-se de que o ícone dos olhos esteja aberto nas etapas desejadas. Feche este ícone ao executar a análise real, pois resultará em janelas pop-up e diminuirá a velocidade do programa. No modo de teste Iniciar, os usuários podem ir e voltar, alterando as configurações conforme necessário para identificar adequadamente primeiro os núcleos e, em seguida, os focos brdU.
Uma vez satisfeito com a identificação resultante, use as mesmas configurações para cada condição dentro do mesmo experimento; isso pode exigir a aquisição de uma imagem de teste para cada condição antes de analisar todo o lote para garantir que as configurações cumpram cada condição. É importante notar que, dependendo da aquisição de imagens, pode haver variabilidade nas configurações do perfil de celular entre os usuários e entre as versões do software. Por isso, é essencial passar pela fase de testes para determinar os parâmetros ideais para experimentos específicos. Ao se preparar para gráfico dos resultados, devem ser identificadas as células positivas do PCNA (fase S). Para isso, a intensidade do PCNA é medida, da mesma forma que a intensidade do BrdU, e os valores resultantes traçados como um gráfico de dispersão para melhor visualizar o valor de intensidade de corte para células positivas do PCNA. Os resultados PCNA-negativos serão então removidos do conjunto de dados para permitir o gráfico de intensidade brdU. Os números suplementares fornecidos mostram capturas de tela do programa destacando as configurações mais otimizadas (Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3).
Uma possível modificação no protocolo é o anticorpo PCNA utilizado; dois anticorpos PCNA diferentes foram testados com sucesso, um listado aqui e outro que não está mais na produção de um anticorpo monoclonal de rato (Bulldog Bio PCA16D10). Finalmente, os usuários devem cobrir as tampas com parafilm durante a incubação de anticorpos. Não é estritamente necessário, embora um volume significativamente maior de solução de anticorpos seria necessário para cobrir o deslizamento de cobertura inteiramente sem isso. Outro método é colocar uma folha de parafilm ao redor de uma placa de vidro, colocar gotas da solução de anticorpos no parafilme e colocar cuidadosamente o deslizamento de camadas lado a lado para baixo na gota de solução de anticorpos. Esta placa de vidro pode então ser colocada em uma câmara úmida a 4 °C durante a noite para incubação primária e no escuro à temperatura ambiente para incubação secundária. Este método é completamente funcional, embora aumente significativamente o tempo de manuseio das tampas e, como resultado, aumenta a probabilidade de cair ou quebrar o deslizamento.
Um método alternativo para medir a ressecção é através do uso do método SMART de combinação de DNA; embora essa técnica forneça resultados muito claros, é muito mais complicada, requer mais tempo, e é mais cara17. O método SMART requer a extração do DNA sem danificá-lo, seguido de esticar este DNA em tampas a serem seguidas por um IF. O método BRdU IF, em comparação, é simples e econômico, não exigindo um investimento maior do que o custo do anticorpo. Este método fornece uma maneira inicial de medir a ressecção que é mais precisa do que simplesmente medir a formação de focos RPA, que podem estar relacionados aos seus efeitos em muitas funções celulares. No entanto, o RPA é fosforylatado em resíduos específicos durante a ressecção como parte da resposta de danos de DNA.
A imagem de molécula única revelou recentemente rpa fosfoilada (pRPA) como um regulador de ressecção negativa18. Assim, a longo prazo, esse método poderia ser ainda mais preciso, acoplando a coloração de RPA PCNA/fosforilada com imagens de BrdU com o uso de anticorpos adequados e condições otimizadas de coloração. No entanto, o método apresentado fornece uma representação de ressecção que é observada independentemente das proteínas envolvidas no processo de ressecção, negando viés que pode ocorrer a partir de alterações em seu sinal em resposta ao tratamento. Esta técnica fornece não apenas um método para determinar se uma proteína está envolvida na ressecção, mas também para determinar se a morte celular resultante do tratamento medicamentoso está relacionada à hipo/hiper-ressecção. Essas informações podem ser benéficas na compreensão não apenas dos aspectos mecanicistas da reparação do DNA, mas também do mecanismo biológico subjacente à morte celular induzida por drogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Marie-Christine Caron por um excelente conselho técnico. Este trabalho é apoiado por financiamento do Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. possui uma cadeira de pesquisa nível 1 no Canadá em reparação de DNA e terapêutica do câncer. J.O'S é um estudante de doutorado da FRQS, e S.Y.M é um pós-doutorando da FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
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