Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

सेल चक्र भेदभाव इमेजिंग के साथ युग्मित BrdU-डीएनए लेबलिंग का उपयोग कर वैश्विक डीएनए डबल स्ट्रैंड एंड लकीर का आकलन

Published: April 28, 2021 doi: 10.3791/62553
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2,3, 1,2
1Oncology Division, Genome Stability Laboratory, CHU de Québec Research Center, HDQ Pavilion, 2Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Laval University Cancer Research Center, 3Oncology Division, CHU de Québec Research Center, CHUL Pavilion
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विधि का उपयोग करके सेल चक्र के एस / जी 2 चरण के दौरान डीएनए डबल-स्ट्रैंड एंड लकीर की कल्पना कैसे करें।

Abstract

डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का अध्ययन एक जटिल और आवश्यक क्षेत्र है, जो केवल कैंसर के उपचार के लिए डीडीआर-लक्ष्यीकरण दवाओं के उपयोग के कारण अधिक महत्वपूर्ण हो गया है। ये लक्ष्य पॉली (एडीपी-राइबोस) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) हैं, जो डीएनए मरम्मत के विभिन्न रूपों को शुरू करते हैं। PARP inhibitors (PARPi) का उपयोग करके इन एंजाइमों को बाधित करना सजातीय पुनर्संयोजन (एचआर) में एक चिकित्सीय भेद्यता प्रदान करके सिंथेटिक घातकता प्राप्त करता है - स्तन कैंसर टाइप 1 (BRCA1), BRCA2, या BRCA2 (PALB2) के साथी और स्थानीयकरण में उत्परिवर्तन के कारण कोशिकाओं की कमी।

PARPi के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSBs) जमा करती हैं। इन ब्रेकों को डीएनए एंड लकीर मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है, जिससे एकल-फंसे हुए (एसएस) डीएनए और बाद में डीएनए मरम्मत का गठन होता है। एक BRCA1-कमी वाले संदर्भ में, डीएनए लकीर अवरोधकों में उत्परिवर्तन के माध्यम से डीएनए लकीर को पुनर्जीवित करना, जैसे कि 53BP1 और DYNLL1, PARPi प्रतिरोध का कारण बनता है। इसलिए, सेल्युलो में डीएनए लकीर की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। Immunofluorescence (IF) -आधारित तकनीकें डीएनए क्षति के बाद वैश्विक डीएनए लकीर की निगरानी के लिए अनुमति देती हैं। इस रणनीति के लिए 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू) के साथ लंबी नाड़ी जीनोमिक डीएनए लेबलिंग की आवश्यकता होती है। डीएनए क्षति और डीएनए अंत लकीर के बाद, परिणामी एकल-फंसे हुए डीएनए को विशेष रूप से देशी परिस्थितियों में एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। इसके अलावा, कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के बीच अंतर करने के लिए सेल चक्र मार्करों का उपयोग करके डीएनए लकीर का भी अध्ययन किया जा सकता है। एस / जी 2 चरण में कोशिकाएं एचआर के भीतर अंत लकीर के अध्ययन की अनुमति देती हैं, जबकि जी 1 कोशिकाओं का उपयोग गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस IF विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सेल चक्र भेदभाव के लिए युग्मित इस पेपर में वर्णित है।

Introduction

डीएनए मरम्मत कारकों का मॉडुलन कैंसर थेरेपी के लिए एक कभी-विकसित विधि है, विशेष रूप से डीएनए डीएसबी मरम्मत-कमी वाले ट्यूमर वातावरण में। विशिष्ट मरम्मत कारकों का निषेध डीएनए-हानिकारक एजेंटों के लिए कैंसर कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सरल रणनीतियों में से एक है। अनुसंधान के दशकों ने चिकित्सीय रणनीति विकल्पों के लिए बायोमार्कर के रूप में डीएनए मरम्मत जीन के विभिन्न उत्परिवर्तनों की पहचान की। नतीजतन, डीएनए मरम्मत क्षेत्र व्यक्तिगत चिकित्सा अवधारणा को सशक्त बनाने के लिए उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला सुनिश्चित करने के लिए दवा के विकास के लिए एक केंद्र बन गया है।

डीएसबी की मरम्मत दो मुख्य मार्गों द्वारा की जाती है: एनएचईजे और एचआर 2। एनएचईजे मार्ग त्रुटि-प्रवण है, तेजी से दो डीएनए सिरों को बिना किसी डीएनए अंत-प्रसंस्करण के साथ लिगेटिंग करता है और इसमें प्रोटीन किनेज (डीएनए-पीकेसी), Ku70/80 कॉम्प्लेक्स, 53BP1 और RIF1 प्रोटीन 3 शामिल होते हैं। इसके विपरीत, एचआर बीआरसीए 14 द्वारा शुरू किया गया एक वफादार तंत्र है। एचआर मरम्मत में एक आवश्यक कदम डीएनए-एंड लकीर प्रक्रिया है, जो टूटे हुए सिरों की गिरावट है जो 3'-OH सिरों के साथ एकल-फंसे (एसएस) डीएनए के लिए अग्रणी है। BRCA1 डाउनस्ट्रीम प्रोटीन की भर्ती की सुविधा प्रदान करता है जो resectosome MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 बनाते हैं, जो 5 'से 3' डीएनए लकीर 5 में शामिल होते हैं।

प्रारंभिक अंत-लकीर को MRE11 की एंडोन्यूक्लिएज गतिविधि के माध्यम से पूरा किया जाता है, जिससे DNA2 और EXO1 न्यूक्लिएज द्वारा आगे के प्रसंस्करण की अनुमति मिलती है। उत्पन्न ssDNA overhangs जल्दी से प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) द्वारा लेपित कर रहे हैं उन्हें आगे प्रसंस्करण से बचाने के लिए. इसके बाद, BRCA2, PALB2, और BRCA1 आरपीए के विस्थापन और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत तंत्र के लिए आवश्यक RAD51 न्यूक्लियोफिलामेंट की असेंबली की मध्यस्थता करने के लिए संलग्न हैं। जीनोमिक अखंडता के इष्टतम रखरखाव के लिए एनएचईजे और एचआर के उपयोग के बीच एक ठीक संतुलन आवश्यक है। मार्ग विकल्प सेल चक्र चरण पर निर्भर करता है। एचआर का उपयोग एस से जी 2 चरणों के दौरान प्राथमिकता से किया जाता है जिसमें डीएनए लकीर उच्चतम स्तर पर होती है, और उचित मरम्मत सुनिश्चित करने के लिए बहन क्रोमैटिड उपलब्ध होते हैं।

पॉली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1 (PARP-1) DSB में भर्ती किए गए शुरुआती प्रोटीनों में से एक है। यह लकीर गतिविधि और NHEJ5,6 में शामिल डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की असेंबली दोनों को नियंत्रित करता है। PARP-1 भी प्रतिकृति 7,8 के दौरान डीएनए एकल फंसे हुए ब्रेक मरम्मत के लिए आवश्यक है। डीएनए मरम्मत में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, PARP अवरोधकों (PARPi) का उपयोग कैंसर उपचार के रूप में किया जाता है। कई एचआर-कमी वाले कैंसर में, PARPi उपचार एक वैकल्पिक मार्ग 9,10 के माध्यम से संचित क्षति की मरम्मत के लिए एचआर-कमी वाली कोशिकाओं की अक्षमता के कारण एक सिंथेटिक घातक प्रतिक्रिया की ओर जाता है। वर्तमान में चार एफडीए द्वारा अनुमोदित PARPi हैं: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, और Talazoparib (जिसे BMN 673 भी कहा जाता है), जिनका उपयोग विभिन्न स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर के उपचार के लिए किया जाता है। हालांकि, PARPi प्रतिरोध आम है, और एक संभावित कारण मानव संसाधन प्रवीणता 12 की पुन: अधिग्रहण के माध्यम से उत्पन्न होता है। विकिरण की उपस्थिति में PARP-1 का नुकसान या निषेध resectosome मशीनरी को डिस्रेगुलेट करता है, जिससे लंबे समय तक ssDNA tracts13 का संचय होता है। इसलिए, विवो में डीएनए लकीर का एक गहन अध्ययन डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और कैंसर के इलाज के लिए नई रणनीतियों के बाद के विकास और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।

डीएनए लकीर की घटनाओं का पता लगाने के लिए कई तरीकों को नियोजित किया गया है5। ऐसी ही एक विधि शास्त्रीय आईएफ-आधारित तकनीक है जो एंटी-आरपीए एंटीबॉडी का उपयोग करके तनाव-प्रेरित डीएसबी के बाद अप्रत्यक्ष धुंधला और उच्छेदित डीएनए के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देती है। 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) के साथ जीनोमिक डीएनए लेबलिंग और केवल ssDNA का पता लगाना डीएनए लकीर की घटनाओं का एक सीधा माप है। यह आरपीए की निगरानी को दरकिनार करता है, जो डीएनए प्रतिकृति जैसे कई सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है। यहां वर्णित विधि में, एक एकल सेल चक्र के लिए बीआरडीयू के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाएं बीआरडीयू को प्रतिकृति सेलुलर डीएनए के एक स्ट्रैंड में शामिल करने की अनुमति देती हैं। लकीर के बाद, IF धुंधला उन परिस्थितियों के तहत किया जाता है जिनमें BrdU का पता लगाने की अनुमति केवल ssDNA रूप में होती है, जिसमें एंटी-BrdU एंटीबॉडी के उपयोग के साथ। यह एंटीबॉडी केवल उजागर बीआरडीयू न्यूक्लियोटाइड्स तक पहुंच सकती है और डबल-फंसे डीएनए में एकीकृत लोगों का पता नहीं लगाएगी। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, उच्छेदित डीएनए को पंक्टेट बीआरडीयू / एसएसडीएनए फोकी के रूप में देखा जा सकता है। डीएनए क्षति के बाद लकीर को मापने के लिए इन फोकी की परमाणु तीव्रता का उपयोग रीडआउट के रूप में किया जा सकता है। यह पेपर इस विधि की प्रक्रियाओं को चरण-दर-चरण वर्णन करता है, जिसे अधिकांश स्तनधारी सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है। यह विधि अवधारणा के प्रमाण के रूप में सेल्युलो में डीएनए अंत लकीर की निगरानी के एक सरल तरीके के रूप में व्यापक उपयोगिता की होनी चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति, उपचार, और coverslip तैयारी

नोट: सभी सेल चढ़ाना, transfections, और उपचार, विकिरण से अलग, एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत जगह ले जाना चाहिए.

  1. दिन 1
    1. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में, आवश्यकतानुसार कई स्थितियों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एक एकल कवरस्लिप रखें। प्लेट ~ 150,000 हेला कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक या दवा उपचार के लिए, जैसा कि वांछित है।
      नोट: यदि transfecting, यह चढ़ाना के समय में एक रिवर्स अभिकर्मक करने के लिए अनुशंसित है, या यह एक आगे अभिकर्मक करने के लिए पालन के लिए अनुमति देने के लिए चढ़ाना कई घंटे के बाद संभव है। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले कवरस्लिप में अभिकर्मक मिश्रण को जोड़कर एक रिवर्स अभिकर्मक पूरा किया जाता है; इस प्रकार, कोशिकाओं का पालन शुरू करने से पहले अभिकर्मक शुरू होता है। इसके विपरीत, एक आगे का अभिकर्मक, आमतौर पर अगले दिन सतह के पालन के बाद अभिकर्मक मिश्रण का अतिरिक्त है। हालांकि, एक ही दिन में ऐसा करना संभव है, बशर्ते कोशिकाओं का पालन करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाए।
    2. इस विधि के लिए, 4 कुओं का उपयोग करें: अच्छी तरह से 1: siRNA नियंत्रण (siCTRL कहा जाता है); खैर 2: PARP-1 (siPARP-1) के खिलाफ siRNA; खैर 3: अनुपचारित; खैर 4: कोशिकाओं को विकिरण से पहले 5 μM BMN673 1 h के साथ इलाज किया जाना है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, सभी परीक्षण विकिरणित परिस्थितियों के तहत आयोजित किए गए थे (अनुभाग 1.3 देखें)।
    3. 5% CO2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करें, हालांकि अभिकर्मक प्रोटोकॉल इनक्यूबेशन के 3 दिनों तक की अनुमति देता है। BrdU उपचार से पहले इनक्यूबेशन समय siRNA अभिकर्मक दक्षता पर निर्भर करेगा। यदि कोई अभिकर्मक नहीं है, तो 16 घंटे के लिए इनक्यूबेशन कवरस्लिप और कुछ सेल विकास के पालन के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त है।
      नोट:: इनक्यूबेटर शर्तों का उपयोग किया गया कक्ष पंक्ति के अनुसार परिवर्तित किया जा सकता है।
  2. दिन 2
    1. उपयुक्त culturing मीडिया में 10 μM की अंतिम एकाग्रता पर BrdU जोड़ें, और 16 ज (एक सेल चक्र) के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: BrdU समाधान dimethylsulfoxide में तैयार किया जाता है; उपयोग किया जाने वाला स्टॉक समाधान 10 mM है और इसे -20 °C पर एलीकोट में संग्रहीत किया जाता है।
  3. दिन 3
    1. एक्स-रे विकिरण के 5 Gy की कुल खुराक के साथ प्लेटों को विकिरणित करें (विकिरण की खुराक को विकिरण के प्रकार के आधार पर अलग-अलग करें, उदाहरण के लिए, छोटे पशु विकिरणकर्ता बनाम बेंचटॉप इरेडिएटर्स)। ब्रांड और irradiator के मॉडल के लिए सामग्री की तालिका का उपयोग किया देखें.
    2. प्लेटों को इनक्यूबेटर पर वापस करें, और कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए छोड़ दें।
    3. 3 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, दो बफर, ए और बी, और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) को 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) में तैयार करें।
      नोट: बफ़र्स ए और बी और सुक्रोज को संदूषण को रोकने के लिए ताजा सुक्रोज समाधान का उपयोग करके, निर्धारण के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
      1. तालिका 1 में वर्णित क्रम (30 mL) के अनुसार, बफ़र A (पूर्व-निष्कर्षण बफ़र) तैयार करें.
        नोट: संदूषण को रोकने के लिए उपयोग के दिन 1M सुक्रोज तैयार किया जाना चाहिए।
      2. तालिका 1 (30 मिलीलीटर) में वर्णित क्रम के अनुसार बफर बी (साइटोस्केलेटन स्ट्रिपिंग बफर) तैयार करें।
        नोट: बफ़र बी Tween-20 और सोडियम deoxycholate समाधान की वर्षा को रोकने के लिए उद्धृत क्रम में तैयार किया जाना चाहिए।
      3. एक रासायनिक हुड (तालिका 1) के तहत 4% PFA, 2 mL प्रति स्थिति (10 mL) तैयार करें।

2. पूर्व निष्कर्षण और निर्धारण

नोट: सभी पूर्व निष्कर्षण और निर्धारण बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक संस्कृति प्लेट में शेष coverslips के साथ किया जाता है; coverslip केवल बढ़ते के अंतिम चरण में उठाया जाता है (चर्चा देखें).

  1. पूर्व निष्कर्षण
    1. माध्यम को एस्पिरेट करें, 1x पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक धोएं, और पीबीएस को हटा दें। पूर्व निष्कर्षण बफर ए के 2 एमएल जोड़ें और तुरंत 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट:: यह महत्वपूर्ण है कि बफ़र A में इनक्यूबेशन समय विस्तारित नहीं है। पूर्व-निष्कर्षण बफ़र्स में विस्तारित इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कवरस्लिप से अलग कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि होगी। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बजाय, इनक्यूबेशन बर्फ पर किया जा सकता है।
    2. आकांक्षा के माध्यम से बफ़र A निकालें.
      नोट:: बफ़र A को निकालने के बाद coverslips को न धोएं। अगले चरण के लिए आगे बढ़ें।
    3. साइटोस्केलेटन स्ट्रिपिंग बफर बी के 2 एमएल जोड़ें और तुरंत 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ध्यान से aspirate बफर बी, और ध्यान से 1x PBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने. ध्यान से 1x PBS aspirate.
  2. ग्रस्तता
    1. रासायनिक हुड के तहत 4% पीएफए के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
      नोट: पीएफए विषाक्त है और एक रासायनिक हुड के तहत हेरफेर किया जाना चाहिए।
    2. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 1x PBS के साथ दो बार coverslips धोलें, और अतिरिक्त aspirate.
    3. 100% ठंडे मेथनॉल के साथ coverslips को कवर करें, और 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें। 1x PBS के साथ दो बार धोएं।
      नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। coverslips 1x PBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटी प्लेट। IF प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले कोशिकाओं को 5 दिनों से अधिक नहीं रखा जाना चाहिए।

3. Permeabilization

  1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.5% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 1x PBS के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 1x PBS के 2 mL के साथ तीन बार coverslips धोएं।

4. Immunostaining

  1. अवरोधित चरण
    1. पर्याप्त ताजा ब्लॉकिंग बफर (1x PBS में 3% BSA) तैयार करने के लिए 2 mL प्रति coverslip का उपयोग करने के लिए।
      नोट:: एंटीबॉडी समाधान बनाने के लिए बफर ब्लॉकिंग का एक अतिरिक्त 5mL तैयार करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से बफर को अवरुद्ध करने के लिए 2 मिलीलीटर जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. ताजा अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें: BrdU RPN202 1:1000 और सेल परमाणु एंटीजन (PCNA) 1:500, 100 μL प्रति coverslip proliferating।
      नोट: एंटीबॉडी को संरक्षित करने के लिए, एक छोटी मात्रा का उपयोग किया जा सकता है, 22 x 22 मिमी कवरस्लिप के लिए 75-100 μL, 18 x 18 मिमी कवरस्लिप के लिए 50-75 μL।
    2. प्रत्येक coverslip पर, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL जोड़ें। चिमटी का उपयोग करके पैराफिल्म के एक वर्ग के साथ कवरस्लिप को कवर करें, और बुलबुले न बनाने के लिए पैराफिल्म को ध्यान से रखें।
    3. एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेट को कवर करें, और एक humidified कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी incubate।
    4. पैराफिल्म वर्गों को हटा दें, और बाँझ 1x पीबीएस के 2 एमएल के साथ तीन बार coverslips धोलें।
  3. द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. ताजा अवरुद्ध बफर में पर्याप्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें: एंटी-माउस 488 फ्लोरोसेंट माध्यमिक A11011 (BrdU के लिए) कमजोर पड़ने 1: 800 और एंटी-खरगोश 568 फ्लोरोसेंट माध्यमिक A11011 (PCNA के लिए) कमजोर पड़ने 1: 800।
      नोट: उपयोग किए गए रंगों को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप बदला जा सकता है। उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट ब्रांड को सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।
    2. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के प्रत्येक coverslip 100 μL पर जोड़ें, चिमटी का उपयोग कर पैराफिल्म के एक वर्ग के साथ coverslips को कवर, और ध्यान से बुलबुले के बिना parafilm की स्थिति.
    3. एल्यूमीनियम पन्नी में कवर प्लेट के साथ 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेट।
    4. 1x PBS के 2 mL के साथ तीन बार coverslips धोएं।
  4. नाभिकीय धुंधला
    1. 1x PBS के प्रति कवरस्लिप 2 mL की मात्रा तैयार करें जिसमें 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1 μg / mL (1: 1000) की अंतिम एकाग्रता पर शामिल है।
    2. DAPI समाधान के प्रत्येक coverslip 2 mL पर जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया गया प्लेट के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर coverslips incubate. कवरलिप्स को 1x PBS के साथ दो बार धोएं।
    3. 1x PBS के साथ coverslips को कवर करें, और कुएं के नीचे से coverslip उठाने के लिए या तो एक सुई या ठीक चिमटी का उपयोग करें। ध्यान से एक कागज तौलिया पर धीरे से एक किनारे दोहन द्वारा अतिरिक्त तरल बंद धब्बा.
      नोट:: सावधान रहें कि स्लाइड को न छोड़ें या अनुयायी कोशिकाओं के साथ सपाट सतह को कागज को छूने की अनुमति दें।
    4. IF-विशिष्ट बढ़ते मीडिया के 10-20 μL का उपयोग करके स्लाइड पर coverslips माउंट करें।

5. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

नोट: छवि अधिग्रहण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के कई प्रकार पर किया जा सकता है। 63x तेल उद्देश्य के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था; ब्रांड और मॉडल के लिए सामग्री की तालिका देखें। जेड-स्टैक की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि वे सेल लाइन और माइटोकॉन्ड्रियल स्टेनिंग के स्तर के आधार पर उपयोग के हो सकते हैं।

  1. छवि विश्लेषण
    1. प्रत्येक छवि के लिए, एकाधिक टिफ़ फ़ाइलें बनाएँ; सभी विमानों को विलय करें, लेकिन रंग चैनलों को अलग रखें। सेल Profiler (https://cellprofiler.org/home ब्रॉड इंस्टीट्यूट) में इन फ़ाइलों को आयात करें और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन (पूरक वीडियो 1) का उपयोग कर विश्लेषण करें।
    2. छवियों को अपलोड करें (पूरक चित्रा S1A).
      1. परियोजना बनाना शुरू करने के लिए, प्रोग्राम में धब्बेदार गिनती पाइपलाइन और प्रदान किए गए क्षेत्र में विश्लेषण की जाने वाली छवियों को लोड करें।
      2. प्रत्येक छवि को एक सार्थक नाम असाइन करने के लिए NamesAndTypes मॉड्यूल का उपयोग करें जिसके द्वारा अन्य मॉड्यूल इसे-C01 को संदर्भित करेंगे: BrdU चैनल का प्रतिनिधित्व करना; C02: PCNA चैनल का प्रतिनिधित्व; C03: DAPI चैनल का प्रतिनिधित्व करता है।
        नोट:: ये पहचानकर्ता माइक्रोस्कोप पर निर्भर करेंगे; चैनलों के बीच अंतर करने के लिए फ़ाइल नाम में एक पहचानकर्ता होना चाहिए।
    3. पहचानें कि नाभिक की पहचान करने और इसे नाम देने के लिए किस फ़ाइल का उपयोग किया जाएगा (इस नाम को आवश्यकतानुसार बदलें) ( पूरक चित्र S1B और पूरक चित्रा S1C देखें)।
      1. 50 और 300 पिक्सेल इकाइयों के बीच वस्तु के व्यास का चयन करें, जो नाभिक के लिए स्वीकार्य आकार सीमा है, लेकिन छवि में नाभिक को फिट करने के लिए मान बदलें।
        नोट: यह हो सकता है कि 50 बहुत बड़ा मान है और छोटे नाभिक को पहचाने जाने से रोकता है; इसी तरह, 300 नाभिक के बड़े समूहों को 1 के रूप में गिना जा सकता है।
      2. व्यास श्रेणी के बाहर ऑब्जेक्ट्स को छोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केवल मानदंडसे मेल खाने वाले ऑब्जेक्ट्स की गणना की जाएगी।
      3. उन कक्षों को निकालने के लिए बॉर्डर्स को छूने वाले ऑब्जेक्ट्स को छोड़ें जो केवल आंशिक रूप से फ़ील्ड में हो सकते हैं.
      4. विशिष्ट छवियों को फिट करने के लिए थ्रेशोल्ड लागू करें। एक उदाहरण के रूप में निम्न सेटिंग्स नोट करें। थ्रेशोल्डिंग रणनीति कितनी कठोर होगी, इसके आधार पर थ्रेशोल्डिंग सुधार कारक परिवर्तित करें. अन्य सेटिंग्स में थ्रेशोल्ड रणनीति शामिल है: वैश्विक; थ्रेशोल्डिंग विधि: Otsu; दो वर्ग या तीन वर्ग थ्रेशोल्डिंग: दो वर्ग; थ्रेशोल्ड स्मूथिंग स्केल: 1; थ्रेशोल्ड स्मूथिंग फैक्टर: 1; दहलीज पर निचली और ऊपरी सीमा: 0.0 और 1.0; clumped वस्तुओं को अलग करने के लिए विधि: आकृति; और clumped वस्तुओं के बीच विभाजित रेखाओं को आकर्षित करने के लिए विधि: प्रोपेगेट करें।
        नोट:: प्रत्येक पैरामीटर के लिए, कक्ष profiler पूरक परिभाषाएँ और चर सेटिंग के लिए उपलब्ध संभावना प्रदान करता है।
    4. foci (पूरक चित्रा S2A) की पहचान करने के लिए प्राथमिक ऑब्जेक्ट की पहचान करें।
      1. निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: इनपुट छवि का चयन करें: नकाबपोशग्रीन; पहचान की जाने वाली प्राथमिक वस्तु का नाम दिया गया: BrdUFoci; वस्तु का विशिष्ट व्यास: 1-15; व्यास सीमा के बाहर ऑब्जेक्ट को छोड़ दें: हाँ; छवि की सीमा को छूने वाली वस्तु को छोड़ दें: नहीं; दहलीज रणनीति: Adaptative; थ्रेशोल्डिंग विधि: Otsu; दो वर्ग या तीन वर्ग थ्रेशोल्डिंग: तीन वर्ग; थ्रेशोल्ड स्मूथिंग स्केल: 1; थ्रेशोल्ड स्मूथिंग फैक्टर: 3; और चिकनाई फिल्टर का आकार: 4.
    5. तीव्रता को मापें (पूरक चित्रा S2B).
      1. मापा जा करने के लिए छवि का चयन करें: OrigGreen.
      2. Add another image पर क्लिक करें। मापा जा करने के लिए छवि का चयन करें: PCNA. मापने के लिए वस्तुओं का चयन करें: नाभिक।
        नोट:: यह BrdU और PCNA तीव्रता को मापने के लिए उपयोग किया जाएगा-अंतिम डेटा जो graphed किया जाएगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, bromodeoxyuridine (BrdU) -आधारित परख मात्रात्मक विकिरण प्रेरित क्षति के लिए HeLa कोशिकाओं की लकीर प्रतिक्रिया को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उत्पन्न ssDNA पटरियों immunofluorescence धुंधला (चित्रा 1A) के बाद अलग foci के रूप में visualized कर रहे हैं. पहचाने गए फोकी को तब परिमाणित किया गया था और नाभिक में बीआरडीयू स्टेनिंग की कुल एकीकृत तीव्रता के रूप में व्यक्त किया गया था (चित्रा 1 बी, पूरक चित्रा एस 1, पूरक आंकड़ा एस 2, और पूरक चित्रा एस 3)। फोकी संख्या या मतलब फोकी तीव्रता को मापना संभव है, हालांकि यह कुल परमाणु तीव्रता की तुलना में कम विश्वसनीय हो सकता है, मोटे तौर पर बीआरडीयू फोकी के चर आकार के हिस्से में।

एनएचईजे और एचआर की लंबी दूरी की लकीर के परिणामस्वरूप छोटी दूरी की लकीर के बीच अंतर करने के लिए, एस-चरण (चित्रा 1 और पूरक चित्रा एस 4) के माध्यम से जाने वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एंटी-पीसीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके सह-धुंधला प्रदर्शन किया गया था। PCNA डीएनए क्लैंप का गठन करता है जो डीएनए पोलीमरेज़ के लिए एक प्रक्रियात्मकता कारक के रूप में कार्य करता है और प्रतिकृति के लिए आवश्यक है। PCNA नाभिक में प्रमुख है और सेल चक्र के एस-चरण के दौरान अधिकतम अभिव्यक्ति तक पहुंचता है। इसलिए, प्रारंभिक एस-चरण में, पीसीएनए सिग्नल कम होता है और इसमें दानेदार वितरण होता है। इसके विपरीत, देर से एस-चरण में, पीसीएनए धुंधला काफी मजबूत है (चित्रा 1 ए)। पहली बार PCNA (S-phase) सिग्नल का विश्लेषण करते समय, नाभिक की पहचान की जानी चाहिए और PCNA तीव्रता को मापा जाना चाहिए।

परिणामी मानों को तब पीसीएनए-पॉजिटिव और पीसीएनए-नकारात्मक नाभिक (पूरक चित्रा S4A) के बीच भेदभाव करने के लिए कट-ऑफ तीव्रता को सबसे अच्छा निर्धारित करने के लिए एक स्कैटर प्लॉट के रूप में प्लॉट किया जाता है। PCNA-नकारात्मक परिणाम तब BrdU तीव्रता-आधारित विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए डेटा सेट से हटा दिया जाएगा क्योंकि शर्त की परवाह किए बिना कम BrdU संकेत (पूरक चित्रा S4B) की परवाह किए बिना। इन प्रयोगात्मक स्थितियों में, PCNA-नकारात्मक नाभिक 900 मनमाने ढंग से इकाइयों (A.U.) के BrdU foci की एक बेसल एकीकृत तीव्रता को बंदरगाह करते हैं। हालांकि, यह मान PCNA-सकारात्मक नाभिक (चित्रा 1B) में 1800 A.U. तक पहुँचता है। यह BrdU foci के एकीकृत संकेत की मात्रा में 100% वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है। बीआरडीयू तीव्रता में वृद्धि को तब डीएनए लकीर में वृद्धि से संबंधित किया जा सकता है, जो अधिक स्पष्ट और कुशल होता है जब कोशिकाएं एस और जी 2 चरणों से गुजरती हैं और विकिरणित होती हैं।

इस प्रोटोकॉल में, विकिरण (5 Gy) के बाद डीएनए लकीर में वृद्धि को प्रदर्शित करने के लिए, PARP-1 गतिविधि को या तो एक siRNA नॉकडाउन स्थिति का उपयोग करके PARP-1 के नुकसान के माध्यम से या Talazoparib (BMN673) (चित्रा 2 और पूरक चित्रा S5) का उपयोग करके PARP-1 के शक्तिशाली निषेध के बाद संशोधित किया गया था। प्रत्येक स्थिति में उच्छेदित डीएनए की मात्रा को तब IF (चित्रा 2 B) के बाद परिमाणित किया गया था। अशांत स्थिति (siCTRL) में, प्रति नाभिक BrdU foci की एकीकृत तीव्रता PCNA-सकारात्मक नाभिक (चित्रा 2A, B) में लगभग 1500 A.U. है। एक siRNA (चित्रा 2C) का उपयोग करके PARP-1 के एक कुशल नॉकडाउन के बाद, लगभग 1900 A.U. के लिए BrdU foci की तीव्रता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई थी, जो तीव्रता में 26% की वृद्धि से मेल खाती है (पी - 0.0001)। इसी तरह, BMN673 (5 μM अंतिम एकाग्रता) का उपयोग करके PARP-1 के निषेध के बाद, foci की तीव्रता लगभग 1750 से 2500 A.U. तक बढ़ गई, जो foci तीव्रता की 43% वृद्धि के अनुरूप है (p - 0.0001)। इस प्रकार, PARP-1 का नुकसान डीएनए लकीर को नियंत्रित करता है जैसा कि पहले बताया गया था13।

यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि बीएमएन -673 दोनों PARP-1 की गतिविधि को रोकता है और इसे डीएनए में फंसाता है, और इस उपचार का प्रभाव सेल के लिए बहुत अधिक हानिकारक है, जिसके परिणामस्वरूप सीआरएनए-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में बीआरडीयू तीव्रता में अधिक वृद्धि होती है। अनुपचारित और siCTRL तीव्रता में मामूली अंतर यह दर्शाता है कि किसी भी उपचार, जैसे कि siRNA अभिकर्मक, एक परख की प्रतिक्रिया और आउटपुट को कैसे प्रभावित कर सकता है। यह आगे प्रत्येक स्थिति के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग करने के महत्व को प्रदर्शित कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: BrdU foci गठन को प्रतिकृति कोशिकाओं की तुलना में PCNA-सकारात्मक कोशिकाओं में होने की अधिक संभावना है। (A) BrdU foci गठन और PCNA की प्रतिनिधि छवियां 5 Gy विकिरण और 3 h रिलीज के बाद धुंधला। प्रत्येक BrdU छवि के कोने में चिह्नित BrdU foci दिखा एक ज़ूम-इन वर्ग मौजूद है। स्केल बार = 5 μm. (B) अनुपचारित (BMN-673 के बिना) HeLa कोशिकाओं में BrdU परमाणु तीव्रता का परिमाणीकरण। डेटा मतलब ± एसई.m (मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। संक्षेप: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = सेल परमाणु प्रतिजन proliferating; IR = विकिरण; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; A.U. = मनमाना इकाइयाँ; s.e.m. = माध्य की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पॉली (ADP-ribose) पोलीमरेज़-1 नॉकडाउन या निषेध के परिणामस्वरूप प्रतिकृति कोशिकाओं में BrdU foci गठन में वृद्धि होती है। (A) अनुपचारित HeLa कोशिकाओं में BrdU foci गठन और PCNA धुंधला की प्रतिनिधि छवियां, 5 μM BMN-673, siCTRL, और siPARP-1 के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद 5 Gy विकिरण और 3 h रिलीज होता है। प्रत्येक BrdU छवि के कोने में चिह्नित BrdU foci दिखा एक ज़ूम-इन वर्ग मौजूद है। स्केल बार = 5 μm. (B) अनुपचारित HeLa कोशिकाओं में BrdU परमाणु तीव्रता का परिमाणीकरण, 5 μM BMN-673, siCTRL, और siPARP-1 के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद 5 Gy विकिरण, डेटा s.e.m (Mann-Whitney U-test) के ± माध्य को दर्शाता है। (सी) पश्चिमी धब्बा PARP-1 के siRNA नॉकडाउन को मान्य करने के लिए। F1-23 PARP-1 एंटीबॉडी automodified PARP-1 को पहचानता है जिसके परिणामस्वरूप siCTRL बैंड की स्मीयर उपस्थिति और BMN-673-उपचारित नमूनों में उत्प्रेरक रूप से बाधित PARP-1 की ठोस उपस्थिति होती है। संक्षेप: PARP-1 = poly(ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = सेल परमाणु प्रतिजन proliferating; IR = विकिरण; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; A.U. = मनमाना इकाइयाँ; siCTRL = siRNA नियंत्रण; SIPARP-1 = SIRNA PARP-1 को नीचे दस्तक देने के लिए; s.e.m. = माध्य की मानक त्रुटि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफ़र A (पूर्व निष्कर्षण बफ़र) 30 mL
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन अंतिम एकाग्रता
H2O 18 mL
पाइप (पीएच 7, 500 mM) 600 μL 10 mM
NaCl (4 M) 750 μL 100 mM
MgCl2 (1 मीटर) 90 μL 3 mM
ईजीटीए (500 mM) 60 μL 1 mM
Trition X-100 (10%) 1.5 mL 0.50%
सुक्रोज (1 मीटर) 9 mL 300 mM

बफर बी (साइटोस्केलेटन अलग करना बफर) 30 मिलीलीटर
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन अंतिम एकाग्रता
H2O 25.035 mL
Tris pH 7.5 (1 M) 300 μL 10 mM
NaCl (4 M) 75 μL 10 mM
MgCl2 (1 मीटर) 90 μL 3 mM
Tween20 (10%) 3 mL 1%
10% सोडियम डीऑक्सीकोल्केट 1.5 mL 0.50%

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन
16% PFA 2.5 mL
PBS 1x 7.5 mL

तालिका 1.

पूरक चित्रा S1: सेल Profiler सॉफ़्टवेयर और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन भाग 1 का दृश्य प्रतिनिधित्व। (ए) स्क्रीनशॉट विश्लेषण की जाने वाली छवियों की विभिन्न चैनल फ़ाइलों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली विंडो को दिखाता है। ये शॉट्स सेल प्रोफाइलर इंटरफ़ेस दिखाते हैं। (बी) नाभिक की पहचान करने के लिए प्राथमिक वस्तुओं की पहचान करें मेनू का स्क्रीनशॉट। हाइलाइट किए गए मान नाभिक की सबसे अच्छी पहचान करने के लिए आमतौर पर परिवर्तित मान हैं। संक्षेप: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: सेल Profiler सॉफ़्टवेयर और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन भाग 2 का दृश्य प्रतिनिधित्व। (ए) नाभिक के भीतर बीआरडीयू फोकी की पहचान करने के लिए प्राथमिक वस्तुओं की पहचान करें मेनू का स्क्रीनशॉट। (बी) BrdU और PCNA परमाणु तीव्रता को मापने के लिए माप वस्तु तीव्रता मेनू का स्क्रीनशॉट। संक्षेप: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = proliferating cell nuclear antigen कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S3: सेल Profiler सॉफ़्टवेयर और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन भाग 3 का दृश्य प्रतिनिधित्व। (ए) अनुकूलन के बाद सेल प्रोफाइलर द्वारा नाभिक पहचान का प्रतिनिधित्व। (बी) बीआरडीयू फोकी पहचान का प्रतिनिधित्व। (सी) स्क्रीनशॉट प्रारंभिक विंडो के भीतर एक सेल पर एक ज़ूम-इन है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S4: PCNA-सकारात्मक और PCNA-नकारात्मक कोशिकाओं के तितर बितर साजिश. (ए) पीसीएनए-नकारात्मक कोशिकाओं से पीसीएनए-पॉजिटिव को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीएनए स्कैटर प्लॉट का एक उदाहरण। एक ही स्थिति से PCNA तीव्रता प्लॉट किया गया था और दो आबादी के बीच अंतर की पहचान की गई थी। हरा PCNA-सकारात्मक कोशिकाओं पर प्रकाश डाला गया है, लाल PCNA-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रत्येक व्यक्तिगत प्रयोग और स्थिति के लिए किया जाता है। (बी) पीसीएनए-नकारात्मक अनुपचारित हेला कोशिकाओं में बीआरडीयू परमाणु तीव्रता का परिमाणीकरण, 5 μM BMN-673, siCTRL, और siPARP-1 के साथ इलाज किया जाता है; डेटा मतलब ± s.e.m (मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। संक्षेप: PARP-1 = poly(ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; IR = विकिरण; PCNA = सेल परमाणु प्रतिजन proliferating; A.U. = मनमाना इकाइयाँ; siCTRL = siRNA नियंत्रण; SIPARP-1 = SIRNA PARP-1 को नीचे दस्तक देने के लिए; s.e.m. = माध्य की मानक त्रुटि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S5: विकिरण के बिना BrdU संकेत. (ए) विकिरण के बिना बीआरडीयू फोकी गठन और पीसीएनए धुंधला की प्रतिनिधि छवियां। स्केल सलाखों = 5 μm. प्रत्येक BrdU छवि के कोने में चिह्नित BrdU foci दिखा एक ज़ूम-इन वर्ग मौजूद है। (बी) पीसीएनए-पॉजिटिव अनुपचारित हेला कोशिकाओं में बीआरडीयू परमाणु तीव्रता का परिमाणीकरण, जिसे 5 μM BMN-673, siCTRL और siPARP-1 के साथ इलाज किया जाता है; डेटा मतलब ± s.e.m (मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) को दर्शाता है। (ग) पीसीएनए-नकारात्मक अनुपचारित हेला कोशिकाओं में बीआरडीयू नाभिकीय तीव्रता का परिमाणीकरण, जिसे 5 μM BMN-673, siCTRL और siPARP-1 के साथ उपचारित किया जाता है; डेटा s.e.m (मान-व्हिटनी यू-टेस्ट) ± मतलब दिखाता है। संक्षेप: PARP-1 = poly(ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1; BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = सेल परमाणु प्रतिजन proliferating; IR = विकिरण; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; A.U. = मनमाना इकाइयाँ; siCTRL = siRNA नियंत्रण; SIPARP-1 = SIRNA PARP-1 को नीचे दस्तक देने के लिए; s.e.m. = माध्य की मानक त्रुटि। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1: सेल प्रोफाइलर और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन का उपयोग डीएनए लकीर के माप के लिए BrdU धुंधला का विश्लेषण करने के लिए। यह वीडियो सेल Profiler और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन के उपयोग को दर्शाता है। यह दिखाता है कि विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए इस उपकरण के साथ छवियों को आयात और विश्लेषण कैसे करें। संक्षिप्त नाम: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पेपर एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो सेल्युलो में डीएनए लकीर में भिन्नताओं को मापने के लिए आईएफ स्टेनिंग का उपयोग करता है। डीएनए लकीर पर प्रभाव को देखने के लिए वर्तमान मानक आरपीए धुंधला के माध्यम से है; हालांकि, यह एक अप्रत्यक्ष विधि है जो डीएनए प्रतिकृति से प्रभावित हो सकती है। इससे पहले, एक और बीआरडीयू निगमन-आधारित डीएनए लकीर IF तकनीक को बीआरडीयू-पॉजिटिव और बीआरडीयू-नकारात्मक कोशिकाओं में परिणामी तीव्रता को वर्गीकृत करने के लिए वर्णित किया गया है। इस विधि ने उन कोशिकाओं के लिए अनुमति दी जो एचआर से नहीं गुजर रहे हैं, उन्हें पृष्ठभूमि या माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला होने के कारण सकारात्मक के रूप में गिना जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च बीआरडीयू तीव्रता 14,15,16 होती है। इस पेपर में वर्णित विधि की प्राथमिक नवीनता पीसीएनए स्टेनिंग के अलावा है, जो सेल चक्र के एस और जी 2 चरणों के लिए चयनात्मकता के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि परिणामी बीआरडीयू सिग्नल लकीर के कारण है और इस प्रकार, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के लिए।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम पूर्व निष्कर्षण है; इसके बिना, बीआरडीयू फोकी दिखाई नहीं देगा, और यदि गलत तरीके से किया जाता है, तो कोशिकाएं पूरी तरह से अलग हो जाएंगी। गलत तरीके से तैयार किए गए बफ़र्स के परिणामस्वरूप अपूर्ण पूर्व-निष्कर्षण होगा, जैसे कि आंशिक साइटोस्केलेटल हटाने या बढ़ी हुई पृष्ठभूमि संकेत। पूर्व-निष्कर्षण बफ़र्स के साथ इनक्यूबेशन की अवधि का सम्मान करना बहुत महत्वपूर्ण है, बफ़र्स में बढ़ी हुई अवधि के परिणामस्वरूप कोशिकाएं कवरस्लिप से अलग हो सकती हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यदि यह प्रोटोकॉल खराब अनुयायी कोशिकाओं के साथ किया जाता है, तो पूर्व-निष्कर्षण के दौरान सेल टुकड़ी को कम करने के लिए पॉलीलिसिन के साथ कवरलिप्स का पूर्व-उपचार करें। बाद में, मेथनॉल निर्धारण के बिना, PCNA संकेत दिखाई नहीं देगा।

इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण चर ब्लॉकिंग बफर है: असंगत ब्लॉकिंग बफ़र्स के परिणामस्वरूप बीआरडीयू सिग्नल का नुकसान होगा। उदाहरण के लिए, 1x PBS ब्लॉकिंग बफर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम मेथनॉल निर्धारण के साथ संयुक्त नहीं होने पर कार्य करेगा; हालांकि, जब पीसीएनए धुंधला करने के लिए आवश्यक के रूप में मेथनॉल निर्धारण के साथ संयुक्त, बीआरडीयू संकेत काफी कम हो जाता है। यह संभव है कि अन्य अवरुद्ध एजेंट और तरीके इस प्रोटोकॉल के साथ काम करेंगे; 1x PBS में 3% BSA ने सबसे अच्छे परिणाम प्रदान किए। इस तकनीक के लिए एक अंतिम आवश्यक घटक एक डीएनए क्षति स्रोत का उपयोग है; इसके बिना, कोई परमाणु BrdU संकेत (पूरक चित्रा S5) के लिए बहुत कम होगा। अनुभव से पता चला है कि विकिरण इस विधि के लिए क्षति का एक उत्कृष्ट स्रोत है। हालांकि, यदि इरेडिएटर तक कोई पहुंच नहीं है, तो इसके बजाय नियोकार्ज़िनोस्टेटिन जैसी रेडियोमिमेटिक दवाओं का उपयोग किया जा सकता है।

सेल प्रोफाइलर एक उपयोगी और बहुमुखी उपकरण है जो इस तकनीक में उत्पादित छवियों के आसान और सुसंगत विश्लेषण की अनुमति देता है। सेटिंग्स दोनों की पहचान की वस्तुओं के आकार और दहलीज जिस पर यह ऐसा करता है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (पूरक वीडियो 1). जैसा कि BrdU धुंधला की परमाणु तीव्रता वांछित रीडआउट है, कुंजी अनुकूलन DAPI फ़ाइलों से नाभिक की पहचान में है। प्रत्येक स्थिति से छवियों का विश्लेषण अलग से किया जाना चाहिए क्योंकि परिणाम सेल और छवि संख्याओं वाले एकल सीएसवी फ़ाइल के रूप में प्राप्त किए जाते हैं, लेकिन शर्त नाम नहीं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या विश्लेषण की स्थितियाँ उपयुक्त हैं, प्रारंभ परीक्षण मोड सुविधा का उपयोग करें, और सुनिश्चित करें कि इच्छित चरणों में आंख चिह्न खुला है. वास्तविक विश्लेषण चलाते समय इस आइकन को बंद करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप पॉप-अप विंडो होगी और प्रोग्राम को धीमा कर देगा। स्टार्ट टेस्ट मोड में, उपयोगकर्ता आगे और पीछे जा सकते हैं, सेटिंग्स को पहले नाभिक और फिर बीआरडीयू फोकी की ठीक से पहचान करने के लिए आवश्यक रूप से बदल सकते हैं।

एक बार परिणामी पहचान से संतुष्ट होने के बाद, एक ही प्रयोग के भीतर प्रत्येक स्थिति के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें; यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेटिंग्स प्रत्येक शर्त का पालन करने के लिए पूरे बैच का विश्लेषण करने से पहले प्रत्येक शर्त के लिए एक परीक्षण छवि के अधिग्रहण की आवश्यकता हो सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, छवि अधिग्रहण के आधार पर, उपयोगकर्ताओं के बीच और सॉफ़्टवेयर संस्करणों के बीच सेल प्रोफाइलर सेटिंग्स में परिवर्तनशीलता हो सकती है। इसलिए, विशिष्ट प्रयोगों के लिए आदर्श मापदंडों को निर्धारित करने के लिए परीक्षण चरण के माध्यम से जाना आवश्यक है। परिणामों को ग्राफ़ करने की तैयारी करते समय, PCNA (S चरण)-सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान की जानी चाहिए। ऐसा करने के लिए, PCNA तीव्रता को BrdU तीव्रता के रूप में एक ही फैशन में मापा जाता है, और परिणामस्वरूप मूल्यों को PCNA-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए कट-ऑफ तीव्रता मान की सबसे अच्छी कल्पना करने के लिए स्कैटर प्लॉट के रूप में प्लॉट किया जाता है। PCNA-नकारात्मक परिणाम तब BrdU तीव्रता graphing के लिए अनुमति देने के लिए डेटा सेट से हटा दिया जाएगा। प्रदान किए गए पूरक आंकड़े कार्यक्रम से स्क्रीनशॉट दिखाते हैं जो सबसे अनुकूलित सेटिंग्स (पूरक चित्रा S1, पूरक चित्रा S2, और पूरक चित्रा S3) को हाइलाइट करते हैं।

प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित संशोधन पीसीएनए एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है; दो अलग-अलग पीसीएनए एंटीबॉडी का सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था, एक यहां सूचीबद्ध किया गया था और दूसरा जो अब उत्पादन में नहीं है- एक चूहा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (बुलडॉग बायो पीसीए 16 डी 10)। अंत में, उपयोगकर्ताओं को एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के दौरान पैराफिल्म के साथ कवरलिप्स को कवर करना चाहिए। यह सख्ती से आवश्यक नहीं है, हालांकि इसके बिना पूरी तरह से कवरस्लिप को कवर करने के लिए एंटीबॉडी समाधान की काफी बड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी। एक अन्य विधि एक ग्लास प्लेट के चारों ओर पैराफिल्म की एक शीट रखना है, पैराफिल्म पर एंटीबॉडी समाधान की बूंदों को रखें, और ध्यान से कवरस्लिप सेल-साइड को एंटीबॉडी समाधान की बूंद पर रखें। इस ग्लास प्लेट को तब प्राथमिक इनक्यूबेशन के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में रखा जा सकता है और माध्यमिक इनक्यूबेशन के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखा जा सकता है। यह विधि पूरी तरह से कार्यात्मक है, हालांकि यह कवरलिप्स को संभालने के समय को काफी बढ़ाती है और परिणामस्वरूप, कवरस्लिप को छोड़ने या तोड़ने की संभावना बढ़ जाती है।

लकीर को मापने के लिए एक वैकल्पिक विधि डीएनए-कॉम्बिंग स्मार्ट विधि के उपयोग के माध्यम से है; जबकि यह तकनीक बहुत स्पष्ट परिणाम प्रदान करती है, यह बहुत अधिक जटिल है, अधिक समय की आवश्यकता होती है, और अधिक महंगा है। SMART विधि को नुकसान पहुंचाए बिना डीएनए के निष्कर्षण की आवश्यकता होती है, इसके बाद इस डीएनए को कवरलिप पर खींचने के बाद एक IF द्वारा पीछा किया जाता है। BrdU IF विधि, तुलनात्मक रूप से, सरल और लागत प्रभावी दोनों है, एंटीबॉडी की लागत की तुलना में अधिक निवेश की आवश्यकता नहीं है। यह विधि लकीर को मापने का एक प्रारंभिक तरीका प्रदान करती है जो केवल आरपीए फोकी गठन को मापने की तुलना में अधिक सटीक है, जो कई सेलुलर कार्यों पर इसके प्रभावों से संबंधित हो सकती है। हालांकि, आरपीए डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में लकीर के दौरान विशिष्ट अवशेषों पर फॉस्फोराइलेटेड है।

एकल-अणु इमेजिंग ने हाल ही में फॉस्फोराइलेटेड आरपीए (पीआरपीए) को एक नकारात्मक लकीर नियामक 18 के रूप में प्रकट किया। इसलिए, लंबी अवधि में, इस विधि को उचित एंटीबॉडी और अनुकूलित धुंधला स्थितियों के उपयोग के साथ बीआरडीयू इमेजिंग के साथ पीसीएनए / फॉस्फोराइलेटेड आरपीए स्टेनिंग को युग्मन करके और भी अधिक सटीक बनाया जा सकता है। हालांकि, प्रस्तुत विधि लकीर का एक प्रतिनिधित्व प्रदान करती है जो लकीर प्रक्रिया में शामिल प्रोटीन से स्वतंत्र रूप से देखी जाती है, इस प्रकार पूर्वाग्रह को नकारती है जो उपचार के जवाब में उनके संकेत में परिवर्तन से हो सकती है। यह तकनीक न केवल यह निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदान करती है कि क्या कोई प्रोटीन लकीर में शामिल है, बल्कि यह भी निर्धारित करने के लिए कि क्या दवा उपचार के परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु हाइपो / हाइपर-लकीर से संबंधित है। यह जानकारी न केवल डीएनए मरम्मत के यांत्रिक पहलुओं को समझने में फायदेमंद हो सकती है, बल्कि दवा-प्रेरित कोशिका मृत्यु के अंतर्निहित जैविक तंत्र को भी समझ सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए मैरी-क्रिस्टीन कैरन को धन्यवाद देते हैं। यह काम कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान जेवाई.M (CIHR FDN-388879) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है। J.-Y.M डीएनए मरम्मत और कैंसर चिकित्सीय में एक टियर 1 कनाडा अनुसंधान कुर्सी रखती है। J.O'S एक FRQS पीएचडी छात्र साथी है, और S.Y.M एक FRQS पोस्टडॉक्टोरल फेलो है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit Molecular probes A11011 1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse Molecular probes A11001 1:800
Anti PARP1 (F1-23) Homemade 1:2500
Anti PCNA (SY12-07) Novus NBP2-67390 1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A) Abcam Ab7291 1:100000
anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1:1000
Benchtop X-ray Irradiator Cell Rad
BMN673 MedChem Express HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU) Sigma B5002
BSA Sigma A7906
Cell profiler Broad Institute V 3.19 https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft Fisher scientific 13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen Life Technology D1306
DMEM high glucose Fisher scientific 10063542
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Fetal Bovine serum Gibco 12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 Fisher scientific 12 541B
Fluorescent microscope Leica DMI6000B 63x immersion objective
HeLa ATCC CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V VWR 51030408 37% CO2
MgCl2 BioShop Canada MAG520.500
NaCl BioShop Canada SOD002.10
Needle
PBS 1x Wisent Bio Products 311-010-CS
PFA 16% Cedarlane Labs 15710-S(EM)
PIPES Sigma-Aldrich P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen Life Technology P-36930
RNAiMAX Invitrogen 13778-075
siPARPi Dharmacon AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control Dharmacon UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate Sigma-Aldrich D6750-100G
Sucrose BioShop Canada SUC507.5
Tris-base BioShop Canada TRS001.5
Trition X-100 Millipore Sigma T8787-250ML
Tween20 Fisher scientific BP337500
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Tags

जीव विज्ञान मुद्दा 170 BrdU foci Immunofluorescence डीएनए अंत लकीर होमोलोगस पुनर्संयोजन PARP-1 PARP अवरोधक PARP अवरोधक प्रतिरोध BMN673
सेल चक्र भेदभाव इमेजिंग के साथ युग्मित BrdU-डीएनए लेबलिंग का उपयोग कर वैश्विक डीएनए डबल स्ट्रैंड एंड लकीर का आकलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, J., Mersaoui, S. Y.,… More

O'Sullivan, J., Mersaoui, S. Y., Poirier, G., Masson, J. Y. Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging. J. Vis. Exp. (170), e62553, doi:10.3791/62553 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter