Summary
In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.
Abstract
De studie van de DNA-schaderespons (DDR) is een complex en essentieel veld, dat alleen maar belangrijker is geworden door het gebruik van DDR-gerichte geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Deze doelwitten zijn poly(ADP-ribose) polymerasen (PARP's), die verschillende vormen van DNA-reparatie initiëren. Het remmen van deze enzymen met behulp van PARP-remmers (PARPi) bereikt synthetische letaliteit door een therapeutische kwetsbaarheid te verlenen in homologe recombinatie (HR) -deficiënte cellen als gevolg van mutaties in borstkanker type 1 (BRCA1), BRCA2 of partner en localizer van BRCA2 (PALB2).
Cellen behandeld met PARPi accumuleren DNA dubbelstrengs breuken (DSB's). Deze breuken worden verwerkt door de DNA-eindresectiemachinerie, wat leidt tot de vorming van enkelstrengs (ss) DNA en daaropvolgende DNA-reparatie. In een BRCA1-deficiënte context veroorzaakt het nieuw leven inblazen van DNA-resectie door mutaties in DNA-resectieremmers, zoals 53BP1 en DYNLL1, PARPi-resistentie. Daarom is het kunnen monitoren van DNA-resectie in cellulo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om PARPi-resistentie te overwinnen. Immunofluorescentie (IF)-gebaseerde technieken maken het mogelijk om wereldwijde DNA-resectie na DNA-schade te monitoren. Deze strategie vereist lange-puls genomische DNA-etikettering met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU). Na DNA-schade en DNA-eindresectie wordt het resulterende enkelstrengs DNA specifiek gedetecteerd door een anti-BrdU-antilichaam onder inheemse omstandigheden. Bovendien kan DNA-resectie ook worden bestudeerd met behulp van celcyclusmarkers om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus. Cellen in de S/G2-fase maken de studie van eindresectie binnen HR mogelijk, terwijl G1-cellen kunnen worden gebruikt om niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) te bestuderen. Een gedetailleerd protocol voor deze IF-methode gekoppeld aan celcyclusdiscriminatie wordt in dit artikel beschreven.
Introduction
Modulatie van DNA-reparatiefactoren is een steeds evoluerende methode voor kankertherapie, met name in DNA DSB-reparatie-deficiënte tumoromgevingen. De remming van specifieke reparatiefactoren is een van de ingenieuze strategieën die worden gebruikt om kankercellen te sensibiliseren voor DNA-schadelijke stoffen. Tientallen jaren van onderzoek leidden tot de identificatie van verschillende mutaties van DNA-reparatiegenen als biomarkers voor therapeutische strategiekeuzes1. Bijgevolg is het DNA-reparatieveld een hub geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen om een breed scala aan behandelingen te garanderen, waardoor het concept van gepersonaliseerde geneeskunde wordt versterkt.
DSB's worden gerepareerd door twee hoofdroutes: NHEJ en HR2. De NHEJ-route is foutgevoelig, waardoor de twee DNA-uiteinden snel worden geligeerd met weinig tot geen DNA-eindverwerking en waarbij het eiwitkinase (DNA-PKcs), het Ku70/80-complex, 53BP1 en RIF1-eiwitten3 betrokken zijn. HR daarentegen is een getrouw mechanisme geïnitieerd door BRCA14. Een essentiële stap in HR-reparatie is het DNA-end resectieproces, dat is de afbraak van de gebroken uiteinden die leidt tot enkelstrengs (ss) DNA met 3'-OH-uiteinden. BRCA1 vergemakkelijkt de rekrutering van de downstream eiwitten die het resectosoom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 vormen, die betrokken zijn bij de 5' tot 3' DNA-resectie5.
De initiële eindresectie wordt bereikt door de endonuclease-activiteit van MRE11, waardoor verdere verwerking door de DNA2- en EXO1-nucleasen mogelijk is. De gegenereerde ssDNA-overhangen worden snel gecoat met Replicatie-eiwit A (RPA) om ze te beschermen tegen verdere verwerking. Vervolgens nemen BRCA2, PALB2 en BRCA1 deel aan de bemiddeling van de verplaatsing van RPA en de assemblage van het RAD51-nucleofilament dat nodig is voor homologiegericht reparatiemechanisme. Een fijne balans tussen het gebruik van NHEJ en HR is noodzakelijk voor het optimale behoud van de genomische integriteit. De routekeuze hangt af van de celcyclusfase. HR wordt bij voorkeur gebruikt tijdens de S tot G2-fasen waarin DNA-resectie op het hoogste niveau is en de zusterchromatiden beschikbaar zijn om een goede reparatie te garanderen.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is een van de vroegste eiwitten die voor de DSB worden gerekruteerd. Het regelt zowel de resectieactiviteit als de assemblage van stroomafwaartse effectoren die betrokken zijn bij de NHEJ5,6. PARP-1 is ook vereist voor DNA enkelstrengs breukherstel tijdens replicatie7,8. Vanwege de belangrijke rol in DNA-reparatie worden PARP-remmers (PARPi) gebruikt als kankertherapieën. Bij verschillende HR-deficiënte kankers leidt parpi-behandeling tot een synthetische letale respons als gevolg van het onvermogen van HR-deficiënte cellen om de geaccumuleerde schade te herstellen via een alternatieve route9,10. Er zijn momenteel vier door de FDA goedgekeurde PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib en Talazoparib (ook wel BMN 673 genoemd), die worden gebruikt voor verschillende borst- en eierstokkankerbehandelingen11. PARPi-resistentie komt echter vaak voor en één mogelijke oorzaak ontstaat door de herovering van HR-vaardigheid12. Verlies of remming van PARP-1 in aanwezigheid van bestraling ontregelt de resectosoommachinerie, wat leidt tot de accumulatie van langere ssDNA-traktaten13. Daarom is een diepgaande studie van DNA-resectie in vivo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de daaropvolgende ontwikkeling van nieuwe strategieën om kanker te behandelen en PARPi-resistentie te overwinnen.
Er zijn verschillende methoden gebruikt om DNA-resectiegebeurtenissen te detecteren5. Een van die methoden is de klassieke IF-gebaseerde techniek die indirecte kleuring en visualisatie van het gereseceerde DNA na stress-geïnduceerde DSB mogelijk maakt met behulp van een anti-RPA-antilichaam. Het labelen van genomisch DNA met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) en het detecteren van alleen ssDNA is een directe meting van DNA-resectiegebeurtenissen. Het omzeilt de monitoring van RPA, die betrokken is bij meerdere cellulaire processen zoals DNA-replicatie. In de hier beschreven methode zorgen cellen geïncubeerd met BrdU voor een enkele celcyclus ervoor dat BrdU kan worden opgenomen in één streng van het replicerende cellulaire DNA. Na resectie wordt IF-kleuring uitgevoerd onder omstandigheden die BrdU-detectie alleen in de ssDNA-vorm mogelijk maken, met behulp van een anti-BrdU-antilichaam. Dit antilichaam heeft alleen toegang tot blootgestelde BrdU-nucleotiden en zal die niet detecteren die zijn geïntegreerd in dubbelstrengs DNA. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kan het gereseceerde DNA worden gevisualiseerd in de vorm van punctate BrdU/ ssDNA-foci. De nucleaire intensiteit van deze foci kan worden gebruikt als een uitlezing om resectie na DNA-schade te kwantificeren. Dit artikel beschrijft stap voor stap de processen van deze methode, die kunnen worden toegepast op de meeste cellijnen van zoogdieren. Deze methode zou van breed nut moeten zijn als een eenvoudige manier om DNA-eindresectie in cellulo te monitoren, als een proof of concept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek, behandelingen en coverslippreparaat
OPMERKING: Alle celbeplating, transfecties en behandelingen, afgezien van bestraling, moeten plaatsvinden onder een steriele celkweekkap.
- Dag 1
- Plaats in een plaat met 6 putten een enkele afdekplaat in elke put voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ~ 150.000 HeLa-cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling, naar wens.
OPMERKING: Als transfecteert, wordt het aanbevolen om een omgekeerde transfectie uit te voeren op het moment van plating, of het is mogelijk om enkele uren na het platen een voorwaartse transfectie uit te voeren om hechting mogelijk te maken. Een omgekeerde transfectie wordt bereikt door de transfectiemix aan de coverslip toe te voegen voordat de cellen worden toegevoegd; transfectie begint dus voordat de cellen beginnen te hechten. Een voorwaartse transfectie daarentegen is de toevoeging van het transfectiemengsel na hechting aan het oppervlak, meestal op de volgende dag. Het is echter mogelijk om dit op dezelfde dag te doen, op voorwaarde dat er voldoende tijd wordt gegeven voor de cellen om zich te hechten. - Gebruik voor deze methode 4 putten: Put 1: siRNA-controle (siCTRL genoemd); Nou 2: siRNA tegen PARP-1 (siPARP-1); Nou 3: onbehandeld; Wel 4: Te behandelen cellen met 5 μM BMN673 1 uur voorafgaand aan de bestraling.
OPMERKING: In dit protocol werden alle tests uitgevoerd onder bestraalde omstandigheden (zie rubriek 1.3). - Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator 's nachts, hoewel het transfectieprotocol tot 3 dagen incubatie mogelijk maakt. De incubatietijd voorafgaand aan de BrdU-behandeling is afhankelijk van de siRNA-transfectie-efficiëntie. Als er geen transfectie is, is incubatie gedurende 16 uur voldoende om hechting aan de coverslip en enige celgroei mogelijk te maken.
OPMERKING: De omstandigheden van de incubator kunnen worden gewijzigd op basis van de gebruikte cellijn.
- Plaats in een plaat met 6 putten een enkele afdekplaat in elke put voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ~ 150.000 HeLa-cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling, naar wens.
- Dag 2
- Voeg BrdU toe in een eindconcentratie van 10 μM in de juiste kweekmedia en incubeer gedurende 16 uur (één celcyclus).
OPMERKING: De BrdU-oplossing wordt bereid in dimethylsulfoxide; de gebruikte stamoplossing is 10 mM en wordt opgeslagen in aliquots bij -20 °C.
- Voeg BrdU toe in een eindconcentratie van 10 μM in de juiste kweekmedia en incubeer gedurende 16 uur (één celcyclus).
- Dag 3
- Bestraal de platen met een totale dosis van 5 Gy röntgenstraling (varieer de dosis bestraling afhankelijk van het type bestralingsapparaat, bijvoorbeeld bestralingen voor kleine dieren versus tafelbestralingen). Zie de tabel met materialen voor het merk en het model van de gebruikte bestralingsmachine.
- Breng de platen terug naar de incubator en laat de cellen gedurende 3 uur los.
- Bereid tijdens de incubatietijd van 3 uur de twee buffers, A en B, en 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Buffers A en B en de sucrose moeten vers worden bereid op de dag van fixatie, met behulp van verse sucrose-oplossing om besmetting te voorkomen.- Bereid buffer A (pre-extractiebuffer) voor, volgens de volgorde (30 ml) beschreven in tabel 1.
OPMERKING: De 1M sucrose moet op de dag van gebruik worden bereid om besmetting te voorkomen. - Bereid buffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) voor volgens de volgorde beschreven in tabel 1 (30 ml).
OPMERKING: Buffer B moet in de aangehaalde volgorde worden bereid om precipitatie van Tween-20 en natriumdeoxycholaatoplossing te voorkomen. - Bereid 4% PFA, 2 ml per conditie (10 ml), onder een chemische kap (tabel 1).
- Bereid buffer A (pre-extractiebuffer) voor, volgens de volgorde (30 ml) beschreven in tabel 1.
2. Voorextractie en fixatie
OPMERKING: Alle voorextractie en fixatie worden uitgevoerd met de coverslips die in de weefselkweekplaat op ijs of bij 4 °C achterblijven; de coverslip wordt pas in de laatste stap van de montage opgetild (zie discussie).
- Voorextractie
- Zuig het medium op, was de cellen twee keer voorzichtig met 1x PBS en verwijder de PBS. Voeg 2 ml voorextractiebuffer A toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Het is belangrijk dat de incubatietijd in buffer A niet wordt verlengd. Verlengde incubatie in de pre-extractiebuffers zal resulteren in een verhoogd aantal losgemaakte cellen van de coverslip. Als alternatief kan in plaats van incubatie bij 4°C incubatie op ijs worden gedaan. - Verwijder buffer A door middel van aspiratie.
OPMERKING: Was de coverslips niet na het verwijderen van buffer A. Ga verder met de volgende stap. - Voeg 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten. Aspirateer buffer B zorgvuldig en was de cellen eenmaal zorgvuldig met 1x PBS. Aspiraleer de 1x PBS zorgvuldig.
- Zuig het medium op, was de cellen twee keer voorzichtig met 1x PBS en verwijder de PBS. Voeg 2 ml voorextractiebuffer A toe en incubeer onmiddellijk bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Fixatie
- Fixeer de cellen door 2 ml 4% PFA onder de chemische kap toe te voegen.
OPMERKING: PFA is giftig en moet worden gemanipuleerd onder een chemische kap. - Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was de dekenslips twee keer met 1x PBS en zuig het overtollige op.
- Bedek de coverslips met 100% koude methanol en incubeer de coverslips bij -20 °C gedurende 5 min. Was twee keer met 1x PBS.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De coverslips kunnen bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard en de plaat indien nodig in aluminiumfolie worden gewikkeld. De cellen mogen niet langer dan 5 dagen worden bewaard voordat het IF-protocol wordt voortgezet.
- Fixeer de cellen door 2 ml 4% PFA onder de chemische kap toe te voegen.
3. Permeabilisatie
- Incubeer de cellen met 2 ml 1x PBS met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.
4. Immunostaining
- Blokkeringsstap
- Bereid voldoende verse blokkeringsbuffer (3% BSA in 1x PBS) voor om 2 ml per coverslip te gebruiken.
OPMERKING: Bereid een extra 5 ml blokkerende buffer voor om de antilichaamoplossingen te maken. - Voeg 2 ml blokkeerbuffer toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid voldoende verse blokkeringsbuffer (3% BSA in 1x PBS) voor om 2 ml per coverslip te gebruiken.
- Primaire antilichaam incubatie
- Bereid de primaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 en prolifererend celkernair antigeen (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
OPMERKING: Om het antilichaam te behouden, kan een kleiner volume worden gebruikt, 75-100 μL voor een coverslip van 22 x 22 mm, 50-75 μL voor een coverslip van 18 x 18 mm. - Voeg op elke coverslip 100 μL primaire antilichaamoplossing toe. Bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en positioneer de parafilm voorzichtig om geen bubbels te creëren.
- Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
- Verwijder de vierkanten van de parafilm en was de dekplaten drie keer met 2 ml steriele 1x PBS.
- Bereid de primaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: BrdU RPN202 1:1000 en prolifererend celkernair antigeen (PCNA) 1:500, 100 μL per coverslip.
- Secundaire antilichaamincubatie
- Bereid voldoende secundaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: anti-muis 488 fluorescerende secundaire A11011 (voor BrdU) verdunning 1:800 en anti-konijn 568 fluorescerende secundaire A11011 (voor PCNA) verdunning 1:800.
OPMERKING: De gebruikte kleuren kunnen worden aangepast aan de experimentele behoeften. Het specifieke gebruikte merk is te vinden in de Materialentabel. - Voeg op elke coverslip 100 μL secundaire antilichaamoplossing toe, bedek de coverslips met een vierkant parafilm met een pincet en plaats de parafilm voorzichtig zonder bubbels.
- Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met de plaat bedekt met aluminiumfolie.
- Was de dekenslips drie keer met 2 ml 1x PBS.
- Bereid voldoende secundaire antilichaamoplossing voor in een verse blokkerende buffer: anti-muis 488 fluorescerende secundaire A11011 (voor BrdU) verdunning 1:800 en anti-konijn 568 fluorescerende secundaire A11011 (voor PCNA) verdunning 1:800.
- Nucleaire kleuring
- Bereid een volume van 2 ml per coverslip van 1x PBS met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in een eindconcentratie van 1 μg/ml (1:1000).
- Voeg op elke coverslip 2 ml van de DAPI-oplossing toe. Incubeer de coverslips bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met de plaat bedekt met aluminiumfolie. Was de coverslips twee keer met 1x PBS.
- Bedek de coverslips met 1x PBS en gebruik een naald of een fijn pincet om de coverslip van de bodem van de put te tillen. Dep de overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapiertje op een rand te tikken.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de dia niet laat vallen of dat het vlakke oppervlak met de hechtende cellen het papier raakt. - Monteer de coverslips op dia's met behulp van 10-20 μL IF-specifieke montagemedia.
5. Beeldverwerving en -analyse
OPMERKING: Beeldacquisitie kan worden gedaan op verschillende soorten fluorescerende microscopen. Er werd gebruik gemaakt van een epifluorescentiemicroscoop met een 63x olieobjectief; zie de tabel met materialen voor het merk en model. Z-stacks zijn niet vereist, hoewel ze van nut kunnen zijn, afhankelijk van de cellijn en het niveau van mitochondriale kleuring.
- Beeldanalyse
- Maak voor elke afbeelding meerdere tiff-bestanden; voeg alle vlakken samen, maar houd de kleurkanalen gescheiden. Importeer deze bestanden in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) en analyseer met behulp van de Spikkeltel-pijplijn (Aanvullende video 1).
- Upload de afbeeldingen (aanvullende figuur S1A).
- Om te beginnen met het maken van het project, laadt u de spikkeltelpijplijn in het programma en de afbeeldingen die in het opgegeven gebied moeten worden geanalyseerd.
- Gebruik de module NamesAndTypes om aan elke afbeelding een betekenisvolle naam toe te wijzen waarmee andere modules verwijzen naar it-C01: Representing BrdU Channel; C02: Vertegenwoordigt PCNA-kanaal; C03: Vertegenwoordigt DAPI-kanaal.
OPMERKING: Deze identificatiemiddelen zijn afhankelijk van de microscoop; er moet een id in de bestandsnaam staan om onderscheid te maken tussen de kanalen.
- Bepaal welk bestand zal worden gebruikt om de kernen te identificeren en geef het een naam (wijzig deze naam indien nodig) (zie Aanvullende figuur S1B en Aanvullende figuur S1C).
- Selecteer de diameter van het object tussen eenheden van 50 en 300 pixels, wat het acceptabele groottebereik voor kernen is, maar wijzig de waarde zodat deze in de kernen in de afbeelding past.
OPMERKING: Het kan zijn dat 50 een te grote waarde is en voorkomt dat kleinere kernen worden geïdentificeerd; evenzo kan 300 het mogelijk maken om grote groepen kernen als 1 te tellen. - Gooi objecten buiten het diameterbereik weg om ervoor te zorgen dat alleen objecten die aan de criteria voldoen, worden geteld.
- Verwijder objecten die randen raken om cellen te verwijderen die zich mogelijk slechts gedeeltelijk in het veld bevinden.
- Pas de drempelwaarde toe om bij de specifieke afbeeldingen te passen. Let op de volgende instellingen als voorbeeld. Wijzig de drempelcorrectiefactor op basis van hoe streng de drempelstrategie zal zijn. Andere instellingen zijn onder meer drempelstrategie: Globaal; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: twee klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 1; onder- en bovengrenzen op drempel: 0,0 en 1,0; methode om samengeklonterde objecten te onderscheiden: Vorm; en methode om scheidingslijnen tussen samengeklonterde objecten te tekenen: Propagateren.
OPMERKING: Voor elke parameter biedt cell profiler aanvullende definities en de beschikbare mogelijkheid voor de variabele-instelling.
- Selecteer de diameter van het object tussen eenheden van 50 en 300 pixels, wat het acceptabele groottebereik voor kernen is, maar wijzig de waarde zodat deze in de kernen in de afbeelding past.
- Identificeer het primaire object om de foci te identificeren (aanvullende figuur S2A).
- Gebruik de volgende instellingen: selecteer de invoerafbeelding: Maskedgreen; het te identificeren primaire object genoemd: BrdUFoci; typische diameter van het object: 1-15; gooi het object buiten het diameterbereik weg: Ja; verwijder het object dat de rand van de afbeelding raakt: Nee; drempelstrategie: Adaptatief; drempelmethode: Otsu; drempels voor twee klassen of drie klassen: drie klassen; drempelafvlakkingsschaal: 1; drempelafvlakkingsfactor: 3; en grootte van het afvlakfilter: 4.
- Meetintensiteit (aanvullende figuur S2B).
- Selecteer de afbeelding die u wilt meten: OrigGreen.
- Klik op Nog een afbeelding toevoegen. Selecteer de afbeelding die u wilt meten: PCNA. Selecteer objecten om te meten: Kernen.
OPMERKING: Dit zal worden gebruikt om de BrdU- en PCNA-intensiteit te meten - de uiteindelijke gegevens die in een grafiek worden weergegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol werd de op bromodeoxyuridine (BrdU) gebaseerde test gebruikt om de resectierespons van HeLa-cellen op door bestraling veroorzaakte schade kwantitatief te meten. De gegenereerde ssDNA-sporen worden gevisualiseerd als afzonderlijke foci na immunofluorescentiekleuring (figuur 1A). De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de BrdU-kleuring in de kernen (figuur 1B, aanvullende figuur S1, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3). Het is mogelijk om het focigetal of de gemiddelde foci-intensiteit te meten, hoewel deze minder betrouwbaar kan zijn dan de totale nucleaire intensiteit, grotendeels tot de variabele grootte van de BrdU-foci.
Om onderscheid te maken tussen de resectie op korte afstand als gevolg van NHEJ en de resectie over lange afstand van HR, werd co-kleuring uitgevoerd met behulp van een anti-PCNA-antilichaam om cellen te identificeren die door de S-fase gaan (figuur 1 en aanvullende figuur S4). PCNA vormt de DNA-klem die fungeert als een processiviteitsfactor voor DNA-polymerase en essentieel is voor replicatie. PCNA is prominent aanwezig in de kern en bereikt maximale expressie tijdens de S-fase van de celcyclus. Vandaar dat in de vroege S-fase het PCNA-signaal laag is en een korrelige verdeling heeft. In de late S-fase daarentegen is de PCNA-kleuring vrij sterk (figuur 1A). Bij de eerste analyse van het PCNA (S-fase) signaal moeten de kernen worden geïdentificeerd en de PCNA-intensiteit worden gemeten.
De resulterende waarden worden vervolgens uitgezet als een spreidingsdiagram om de afkapintensiteit het beste te bepalen om onderscheid te maken tussen de PCNA-positieve en PCNA-negatieve kernen (aanvullende figuur S4A). De PCNA-negatieve resultaten worden dan uit de dataset verwijderd om de op BrdU-intensiteit gebaseerde analyse mogelijk te maken vanwege het lage BrdU-signaal, ongeacht de aandoening (aanvullende figuur S4B). In deze experimentele omstandigheden herbergen de PCNA-negatieve kernen een basale geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci van 900 willekeurige eenheden (A.U.). Deze waarde bereikt echter 1800 A.U. in PCNA-positieve kernen (figuur 1B). Dit betekent een 100% toename van de hoeveelheid van het geïntegreerde signaal van de BrdU-foci. Toename van brdU-intensiteit kan vervolgens worden gecorreleerd aan een toename van DNA-resectie, die meer uitgesproken en efficiënt is wanneer cellen door S- en G2-fasen gaan en worden bestraald.
In dit protocol, om een toename van DNA-resectie na bestraling (5 Gy) aan te tonen, werd de PARP-1-activiteit gemoduleerd door het verlies van PARP-1 met behulp van een siRNA-knockdown-conditie of na krachtige remming van PARP-1 met Talazoparib (BMN673) (figuur 2 en aanvullende figuur S5). De hoeveelheden gereseceerd DNA in elke aandoening werden vervolgens gekwantificeerd na IF (figuur 2B). In onverstoorbare toestand (siCTRL) is de geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci per kern ongeveer 1500 A.U. in de PCNA-positieve kernen (figuur 2A,B). Na een efficiënte knockdown van PARP-1 met behulp van een siRNA (figuur 2C), werd een significante toename van de intensiteit van de BrdU-foci tot ongeveer 1900 A.U. waargenomen, wat overeenkomt met een toename van 26% in intensiteit (p ˂ 0,0001). Evenzo nam na remming van PARP-1 met BEHULP VAN BMN673 (5 μM eindconcentratie) de intensiteit van foci toe van ongeveer 1750 tot 2500 A.U. wat overeenkomt met 43% toename van de foci-intensiteit (p ˂ 0,0001). Verlies van PARP-1 ontregelt dus DNA-resectie zoals eerder gemeld13.
Het is belangrijk om te onthouden dat BMN-673 zowel de activiteit van PARP-1 remt als het in DNA opsluit, en het effect van deze behandeling is veel schadelijker voor de cel, wat resulteert in de grotere toename van BrdU-intensiteit dan in met siRNA behandelde cellen. Het kleine verschil in onbehandelde en siCTRL-intensiteiten laat zien hoe elke behandeling, zoals siRNA-transfectie, de respons en output van een test kan beïnvloeden. Het kan verder het belang aantonen van het gebruik van de juiste controles voor elke aandoening.
Figuur 1: BrdU-focivorming komt vaker voor in PCNA-positieve cellen dan in replicerende cellen. (A) Representatieve beelden van BrdU-focivorming en PCNA-kleuring na 5 Gy-bestraling en 3 uur afgifte. Een ingezoomd vierkant met gemarkeerde BrdU-foci is aanwezig in de hoek van elke BrdU-afbeelding. Schaalstaven = 5 μm. (B) Kwantificering van de BrdU nucleaire intensiteit in onbehandelde (zonder BMN-673) HeLa cellen. De gegevens tonen het gemiddelde ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Afkortingen: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = prolifererend celkernair antigeen; IR = bestraling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; A.U. = willekeurige eenheden; s.e.m. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Poly(ADP-ribose) polymerase-1 knockdown of inhibitie resulteert in verhoogde BrdU foci vorming in replicerende cellen. (A) Representatieve beelden van BrdU foci vorming en PCNA kleuring in onbehandelde HeLa cellen, behandeld met 5 μM BMN-673, siCTRL en siPARP-1, gevolgd door 5 Gy bestraling en 3 uur afgifte. Een ingezoomd vierkant met gemarkeerde BrdU-foci is aanwezig in de hoek van elke BrdU-afbeelding. Schaalstaven = 5 μm. (B) Kwantificering van de BrdU-nucleaire intensiteit in onbehandelde HeLa-cellen, behandeld met 5 μM BMN-673, siCTRL en siPARP-1 gevolgd door 5 Gy-bestraling, tonen de gegevens het gemiddelde ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Western blot om de siRNA knockdown van PARP-1 te valideren. Het F1-23 PARP-1-antilichaam herkent automodificatie PARP-1, wat resulteert in het uitgesmeerde uiterlijk van de siCTRL-band en het solide uiterlijk van de katalytisch geremde PARP-1 in met BMN-673 behandelde monsters. Afkortingen: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; PCNA = prolifererend celkernair antigeen; IR = bestraling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; A.U. = willekeurige eenheden; siCTRL = siRNA-controle; siPARP-1 = siRNA om PARP-1 neer te halen; s.e.m. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffer A (Pre-Extractie Buffer) 30 ml | ||
| Reagens | Volume | Eindconcentratie |
| H2O | 18 ml | |
| BUIZEN (pH 7, 500 mM) | 600 μL | 10 meter |
| NaCl (4 M) | 750 μL | 100m |
| MgCl2 (1 m) | 90 μl | 3 meter |
| EGTA (500m) | 60 μl | 1mm |
| Trition X-100 (10%) | 1,5 ml | 0.50% |
| Sucrose (1 M) | 9 ml | 300 meter |
| Buffer B (Cytoskelet Stripping Buffer) 30 ml | ||
| Reagens | Volume | Eindconcentratie |
| H2O | 25.035 ml | |
| Tris pH 7,5 (1 M) | 300 μL | 10 meter |
| NaCl (4 M) | 75 μL | 10 meter |
| MgCl2 (1 m) | 90 μl | 3 meter |
| Tween20 (10%) | 3 ml | 1% |
| 10% Natrium deoxycholcate | 1,5 ml | 0.50% |
| Reagens | Volume |
| 16% PFA | 2,5 ml |
| Pbs 1x | 7,5 ml |
Tabel 1.
Aanvullende figuur S1: Visuele weergave van de Cell Profiler Software en Speckle counting pipeline deel 1. (A) Screenshot toont het venster dat wordt gebruikt om de verschillende kanaalbestanden van de te analyseren afbeeldingen te identificeren. Deze opnamen tonen de interface van de celprofiler. (B) Schermafbeelding van het menu Primaire objecten identificeren om de kernen te identificeren. De gemarkeerde waarden zijn de vaak gewijzigde waarden om kernen het beste te identificeren. Afkortingen: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Visuele weergave van de Cell Profiler Software en Speckle counting pipeline deel 2. (A) Schermafbeelding van het menu Primaire objecten identificeren om de BrdU-foci in de kernen te identificeren. (B) Screenshot van het menu Intensiteit van het object meten om de brdU- en PCNA-kernintensiteit te meten. Afkortingen: BrdU = 5-bromo-2′-deoxyuridine; PCNA = prolifererend celkernair antigeen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Visuele weergave van de Cell Profiler Software en Speckle counting pipeline deel 3. (A) Weergave van de kernidentificatie door celprofiel na optimalisatie. (B) Weergave van de BrdU foci identificatie. (C) Screenshot is een zoom-in op één cel in het eerste venster. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Spreidingsplot van PCNA-positieve en PCNA-negatieve cellen. (A) Een voorbeeld van een PCNA-scatterplot dat wordt gebruikt om PCNA-positieve van PCNA-negatieve cellen te onderscheiden. De PCNA-intensiteit van een enkele aandoening werd uitgezet en het onderscheid tussen de twee populaties werd geïdentificeerd. Het groen markeert de PCNA-positieve cellen, het rood vertegenwoordigt de PCNA-negatieve cellen. Dit wordt gedaan voor elk individueel experiment en elke aandoening. (B) kwantificering van de nucleaire intensiteit van brdU in PCNA-negatieve onbehandelde HeLa-cellen, behandeld met 5 μM BMN-673, siCTRL en siPARP-1; de gegevens tonen de gemiddelde ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Afkortingen: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; IR = bestraling; PCNA = prolifererend celkernair antigeen; A.U. = willekeurige eenheden; siCTRL = siRNA-controle; siPARP-1 = siRNA om PARP-1 neer te halen; s.e.m. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S5: BrdU-signaal zonder bestraling. (A) Representatieve beelden van BrdU-focivorming en PCNA-kleuring zonder bestraling. Schaalbalken = 5 μm. Een ingezoomd vierkant met gemarkeerde BrdU-foci is aanwezig in de hoek van elke BrdU-afbeelding. (B) kwantificering van de brdU-nucleaire intensiteit in PCNA-positieve onbehandelde Hela-cellen, behandeld met 5 μM BMN-673, siCTRL en siPARP-1; de gegevens tonen de gemiddelde ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). (C) Kwantificering van de brdU-nucleaire intensiteit in PCNA-negatieve onbehandelde HeLa-cellen, behandeld met 5 μM BMN-673, siCTRL en siPARP-1; de gegevens tonen het gemiddelde ± s.e.m (Mann-Whitney U-test). Afkortingen: PARP-1 = poly(ADP-ribose) polymerase 1; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; PCNA = prolifererend celkernair antigeen; IR = bestraling; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; A.U. = willekeurige eenheden; siCTRL = siRNA-controle; siPARP-1 = siRNA om PARP-1 neer te halen; s.e.m. = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Gebruik van Cell Profiler en de Spikkeltelpijplijn om BrdU-kleuring te analyseren voor het meten van DNA-resectie. Deze video demonstreert het gebruik van Cell Profiler en de Spikkeltel-pijplijn. Het laat zien hoe u afbeeldingen kunt importeren en analyseren met deze tool specifiek voor dit protocol. Afkorting: BrdU =5-bromo-2′-deoxyuridine. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van IF-kleuring om variaties in DNA-resectie in cellulose te meten. De huidige standaard voor het observeren van een effect op DNA-resectie is door RPA-kleuring; dit is echter een indirecte methode die kan worden beïnvloed door DNA-replicatie. Eerder is een andere op BrdU-integratie gebaseerde DNA-resectie IF-techniek beschreven voor het classificeren van de resulterende intensiteiten in BrdU-positieve en BrdU-negatieve cellen. Met deze methode konden cellen die geen HR ondergaan als positief worden geteld vanwege achtergrond- of mitochondriale kleuring, wat resulteert in een hoge BrdU-intensiteit14,15,16. De belangrijkste nieuwigheid van de methode die in dit artikel wordt beschreven, is de toevoeging van PCNA-kleuring, die selectiviteit mogelijk maakt voor S- en G2-fasen van de celcyclus, waardoor ervoor wordt gezorgd dat het resulterende BrdU-signaal te wijten is aan resectie en dus aan homologiegerichte reparatie.
De cruciale stap in dit protocol is de pre-extractie; zonder dit zullen de BrdU-foci niet zichtbaar zijn en als ze verkeerd worden gedaan, zullen de cellen volledig loskomen. Verkeerd voorbereide buffers zullen resulteren in onvolledige pre-extractie, zoals gedeeltelijke cytoskeletale verwijdering of verhoogd achtergrondsignaal. Het is erg belangrijk om de incubatieduur met de pre-extractiebuffers te respecteren, een langere duur in de buffers kan ertoe leiden dat de cellen loskomen van de coverslip. Belangrijk is dat als dit protocol wordt uitgevoerd met slecht hechtende cellen, de coverslips voorbehandelt met polylysine om celloslating tijdens de pre-extractie te verminderen. Zonder methanolfixatie is het PCNA-signaal vervolgens niet zichtbaar.
Een andere belangrijke variabele in dit protocol is de blokkeringsbuffer: incompatibele blokkeringsbuffers zullen resulteren in verlies van BrdU-signaal. Bijvoorbeeld, 10% foetaal runderserum in 1x PBS-blokkerende buffer zal functioneren wanneer het niet wordt gecombineerd met methanolfixatie; in combinatie met methanolfixatie zoals vereist voor de PCNA-kleuring, wordt het BrdU-signaal echter aanzienlijk verminderd. Het is mogelijk dat andere blokkerende middelen en methoden met dit protocol werken; 3% BSA in 1x PBS leverde de beste resultaten op. Een laatste essentieel onderdeel van deze techniek is het gebruik van een DNA-schadebron; zonder dit zal er weinig tot geen nucleair BrdU-signaal zijn (aanvullende figuur S5). De ervaring heeft geleerd dat bestraling een uitstekende bron van schade is voor deze methode. Als er echter geen toegang is tot een bestralingsapparaat, kunnen in plaats daarvan radiomimetische geneesmiddelen zoals neocarzinostatine worden gebruikt.
Cell profiler is een nuttig en veelzijdig hulpmiddel dat een eenvoudige en consistente analyse van de beelden die in deze techniek worden geproduceerd, mogelijk maakt. De instellingen kunnen worden aangepast voor zowel de grootte van de geïdentificeerde objecten als de drempel waarop dit gebeurt (aanvullende video 1). Aangezien de nucleaire intensiteit van de BrdU-kleuring de gewenste uitlezing is, ligt de belangrijkste aanpassing in de identificatie van de kernen uit de DAPI-bestanden. De analyse van de afbeeldingen van elke voorwaarde moet afzonderlijk worden uitgevoerd, omdat de resultaten worden verkregen in de vorm van een enkel csv-bestand met cel- en afbeeldingsnummers, maar geen voorwaardenamen. Als u wilt bepalen of de analyseomstandigheden geschikt zijn, gebruikt u de functie Testmodus starten en controleert u of het oogpictogram in de gewenste stappen is geopend. Sluit dit pictogram bij het uitvoeren van de eigenlijke analyse, omdat dit zal resulteren in pop-upvensters en het programma zal vertragen. In de Start-testmodus kunnen gebruikers heen en weer gaan en de instellingen indien nodig wijzigen om eerst de kernen en vervolgens de BrdU-foci goed te identificeren.
Zodra u tevreden bent met de resulterende identificatie, gebruikt u dezelfde instellingen voor elke voorwaarde binnen hetzelfde experiment; dit kan de verwerving van een testafbeelding voor elke voorwaarde vereisen voordat de hele batch wordt geanalyseerd om ervoor te zorgen dat de instellingen aan elke voorwaarde voldoen. Het is belangrijk op te merken dat, afhankelijk van de beeldacquisitie, er variabiliteit kan zijn in de cell profiler-instellingen tussen gebruikers en tussen softwareversies. Daarom is het essentieel om de testfase te doorlopen om de ideale parameters voor specifieke experimenten te bepalen. Bij de voorbereiding om de resultaten in kaart te brengen, moeten de PCNA (S-fase) -positieve cellen worden geïdentificeerd. Om dit te doen, wordt de PCNA-intensiteit gemeten, op dezelfde manier als de BrdU-intensiteit, en de resulterende waarden uitgezet als een scatterplot om de afkapintensiteitswaarde voor PCNA-positieve cellen het beste te visualiseren. De PCNA-negatieve resultaten worden dan uit de dataset verwijderd om de BrdU-intensiteitsgrafiek mogelijk te maken. De verstrekte aanvullende cijfers tonen screenshots van het programma met de meest geoptimaliseerde instellingen (aanvullende figuur S1, aanvullende figuur S2 en aanvullende figuur S3).
Een mogelijke wijziging van het protocol is het gebruikte PCNA-antilichaam; twee verschillende PCNA-antilichamen werden met succes getest, de hier genoemde en de andere die niet langer in productie is - een monoklonaal antilichaam van een rat (Bulldog Bio PCA16D10). Ten slotte moeten gebruikers de coverslips bedekken met parafilm tijdens de incubatie van antilichamen. Het is niet strikt noodzakelijk, hoewel een aanzienlijk groter volume antilichaamoplossing nodig zou zijn om de coverslip volledig zonder dit te bedekken. Een andere methode is om een vel parafilm rond een glasplaat te plaatsen, druppels van de antilichaamoplossing op de parafilm te plaatsen en de coverslip-celzijde voorzichtig op de druppel antilichaamoplossing te plaatsen. Deze glasplaat kan vervolgens 's nachts in een vochtige kamer bij 4 °C worden geplaatst voor primaire incubatie en in het donker bij kamertemperatuur voor secundaire incubatie. Deze methode is volledig functioneel, hoewel het de tijd van het hanteren van de coverslips aanzienlijk verlengt en als gevolg daarvan de kans op het laten vallen of breken van de coverslip verhoogt.
Een alternatieve methode om resectie te meten is door het gebruik van de DNA-kammen SMART methode; hoewel deze techniek zeer duidelijke resultaten oplevert, is het veel ingewikkelder, kost het meer tijd en is het duurder17. De SMART-methode vereist de extractie van het DNA zonder het te beschadigen, gevolgd door het uitrekken van dit DNA op coverslips om te worden gevolgd door een IF. De BrdU IF-methode is in vergelijking daarmee zowel eenvoudig als kosteneffectief en vereist geen grotere investering dan de kosten van het antilichaam. Deze methode biedt een eerste manier om resectie te meten die nauwkeuriger is dan alleen het meten van RPA-focivorming, wat kan worden gerelateerd aan de effecten ervan op veel cellulaire functies. RPA wordt echter gefosforyleerd op specifieke residuen tijdens resectie als onderdeel van de DNA-schaderespons.
Beeldvorming met één molecuul onthulde onlangs gefosforyleerde RPA (pRPA) als een negatieve resectieregulator18. Daarom kan deze methode op de lange termijn nog nauwkeuriger worden gemaakt door PCNA / gefosforyleerde RPA-kleuring te koppelen aan BrdU-beeldvorming met behulp van geschikte antilichamen en geoptimaliseerde kleuringsomstandigheden. De gepresenteerde methode biedt echter een weergave van resectie die onafhankelijk van de eiwitten die betrokken zijn bij het resectieproces wordt waargenomen, waardoor bias die kan optreden door veranderingen in hun signaal als reactie op de behandeling, wordt ontkend. Deze techniek biedt niet alleen een methode om te bepalen of een eiwit betrokken is bij resectie, maar ook om te bepalen of celdood als gevolg van medicamenteuze behandeling gerelateerd is aan hypo / hyperresectie. Deze informatie kan nuttig zijn om niet alleen de mechanistische aspecten van DNA-reparatie te begrijpen, maar ook het biologische mechanisme dat ten grondslag ligt aan de door geneesmiddelen geïnduceerde celdood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Marie-Christine Caron voor haar uitstekende technische advies. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. bekleedt een Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S is een FRQS PhD student fellow, en S.Y.M is een FRQS postdoctoraal fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
References
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J.
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
