Summary
نحن هنا نقدم إجراء لقياس أوليغومر البروتين والتجميع في الخلايا lysate والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي ارتباط مضان.
Abstract
تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD) وما إلى ذلك. للكشف عن وتحليل أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان أو المنتشرة أو المجاميع ، تم استخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يمكنه اكتشاف سرعة الانتشار وسطوع جسيم واحد مع حساسية جزيء واحد. ومع ذلك، لم يتم تقاسم الإجراءات والدراية المناسبة للكشف عن تجميع البروتين على نطاق واسع. هنا ، نعرض إجراء قياسيا لقياس FCS لخصائص الانتشار للبروتينات المعرضة للتراكم في lysate الخلية والخلايا الحية: ALS المرتبطة 25 kDa carboxyl-terminal جزء من TAR DNA / الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 43 كيلودا (TDP25) وdismutase أكسيد 1 (SOD1). تظهر النتائج التمثيلية أن جزءا من مجاميع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم TDP25 تم تضمينه قليلا في الكسر القابل للذوبان من تحلل خلية الورم الأرومي العصبي المورفين Neuro2a. وعلاوة على ذلك ، GFP الموسومة SOD1 تحمل الطفرة المرتبطة ALS يظهر انتشار أبطأ في الخلايا الحية. وبناء على ذلك، نحن هنا نقدم الإجراء للكشف عن تجميع البروتين عن طريق خاصية نشرها باستخدام FCS.
Introduction
تجمعات البروتين التي تنطوي على اضطرابات عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, وهلم جرا1 ومن المعروف أن تكون سامة ومن شأنها أن تزعج التوازن البروتين (البروتيوستاسي) في الخلايا والأعضاء, التي يمكن أن تؤدي بعد ذلك إلى الشيخوخة2. ومن المتوقع إزالة البروتين تجميع كاستراتيجية علاجية; ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد المواد الكيميائية التي تمنع تكوين البروتين وتتحلل مجاميع البروتين (مثل الجزيئات الصغيرة أو الأدوية). وعلاوة على ذلك، فإن كيفية ممارسة تجميع البروتين للسمية لا تزال بعيدة المنال. لذلك ، لتعزيز المشاريع البحثية المتعلقة بتجميع البروتين ، من المهم إدخال إجراءات عالية الإنتاجية للكشف ببساطة عن تجميع البروتين. الكشف عن تجميع البروتين باستخدام الأجسام المضادة التعرف على تشكيل تجميع البروتين وصبغ الفلورسنت تجميع محددة وقد استخدمت على نطاق واسع3. ومع ذلك ، من الصعب الكشف عن التجميع ، خاصة في الخلايا الحية باستخدام مثل هذه الإجراءات الكلاسيكية.
Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هو إجراء للكشف عن تجميع البروتين والتغيير الهيكلي. ومع ذلك ، فإن FRET غير قادر على تحليل ديناميات البروتين (على سبيل المثال ، نشر وoligomerization البروتين في الخلايا الحية)3. لذلك ، نقدم هنا بروتوكولا بسيطا للكشف عن تجميع البروتين في المحلول (على سبيل المثال ، lysate الخلية) والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يقيس خاصية الانتشار وسطوع جزيئات الفلورسنت مع حساسية جزيء واحد4. FCS هو طريقة العد الضوئي باستخدام المجهر confocal مسح الليزر (LSM). باستخدام كاشف فوتون حساس للغاية وحساب وظيفة التصحيح التلقائي (ACF) لوقت وصول الفوتون ، يتم قياس المرور عبر الوقت وسطوع جزيئات الفلورسنت في حجم الكشف. الانتشار يبطئ مع زيادة الوزن الجزيئي. وبالتالي، يمكن تقدير التفاعل بين الجزيئات باستخدام FCS. حتى أكثر قوة، زيادة في سطوع جزيء الفلورسنت يشير إلى المثلية-oligomerization من الجزيئات. ولذلك، FCS هو أداة قوية للكشف عن مثل هذا التجمع البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المواد والكواشف
- استخدام الحلول الحرة بيراموجينيك والمتوسطة لثقافة الخلية (الجدول 1).
- إعداد حلول للتجربة الكيميائية الحيوية باستخدام المياه فائقة الشراء واستخدامها كما DNase / RNase الحرة.
- حدد FBS مناسبة لثقافة الخلية مع عملية الاختيار الكثير. وبما أن مجموعة FBS المحددة تتغير بانتظام، لا يمكن تمثيل الكتالوج ورقم اللوت ل FBS هنا.
- الحمض النووي البلازميد
- إعداد pmeGFP-N15 للتعبير عن أحادية eGFP؛ pmeGFP-C1-TDP256 للتعبير GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 للتعبير SOD1-G85R-GFP؛ وpCAGGS8 باعتبارها الناقل.
ملاحظة: meGFP هو متغير أحادي يحمل طفرة A206K من GFP المحسن (eGFP). TDP25 هو جزء C-المحطة الطرفية المرتبطة ALS من TDP-43. SOD1-G85R هو متحولة المرتبطة ALS من SOD1.
- إعداد pmeGFP-N15 للتعبير عن أحادية eGFP؛ pmeGFP-C1-TDP256 للتعبير GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 للتعبير SOD1-G85R-GFP؛ وpCAGGS8 باعتبارها الناقل.
- سلالة الخلية
- استخدام الخلايا الورم الأرومي العصبي مورين Neuro2a.
ملاحظة: تتمتع خلايا Neuro2a بكفاءة عالية في العدوى وبروتينات خارجية عالية التعبير. للتعبير TDP25، سلالات الخلايا وجود كفاءات التعبير عالية مثل Neuro2a أو خلايا HEK293 مطلوبة. في خلايا هيلا، لم يكن من الممكن التعبير عن TDP25 بكفاءة.
- استخدام الخلايا الورم الأرومي العصبي مورين Neuro2a.
2. ثقافة الخلية والعاب
- إعداد طبق من البلاستيك 100 ملم زراعة خلايا Neuro2a شبه التقاء في متوسط النمو الطبيعي.
ملاحظة: من الضروري الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة تقريبا بعد البذر السابق حتى يتم الوصول إلى شبه التقاء. - إزالة الوسيطة.
- أضف 0.5 مل من محلول التريبسين-EDTA إلى طبق زراعة الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
- إضافة 9.5 مل من متوسط النمو الطبيعي في الطبق وتعليق الخلايا المنفصلة.
- باستخدام تريبان الأزرق لتلطيخ الخلايا الميتة، عد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية أو يدويا. ثم تمييع الخلايا في الثقافة المتوسطة (1.0 × 105/ مل).
- أضف 2 مل من تعليق الخلية إلى طبق بلاستيكي 35 مم لتحلل الخلية أو طبق قاعدة زجاجي لقياس الخلايا الحية.
- احتضان الطبق في 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
- ابدأ التحضيرات التالية قبل 15 دقيقة من يوم العدوى.
- إعداد اثنين من أنابيب 1.5 مل وإضافة 100 ميكرولتر من Opti-MEM I إلى كل أنبوب.
- في الأنبوب الأول، اخلط 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (الحل A). في الأنبوب الثاني، اخلط 2.5 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000 (الحل ب).
ملاحظة: للحفاظ على كفاءة العدوى، احتفظ بكمية الحمض النووي الإجمالية كما هي. لتقليل مستوى التعبير لقياس FCS في الخلايا الحية، يجب أن تنخفض كمية الكسر من الحمض النووي البلازميد للتعبير عن البروتين (على سبيل المثال، 0.2 ميكروغرام من pmeGFP-N1-SOD1-G85R و 0.8 ميكروغرام من خليط pCAGGS). وعلاوة على ذلك، الحفاظ على نفس النسبة بين حجم ليبوفيكتامين 2000 وكمية الحمض النووي البلازميد. - مزيج بلطف الحل A و B بإضافة واحد في أي أنبوب، ومن ثم احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الحل C).
- إضافة الحل C إلى وسيطة الثقافة; واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
3. تحلل الخلية والتبادل المتوسط
- تحقق من التعبير GFP باستخدام المجهر الروتيني.
- إزالة المتوسطة في الطبق.
- إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في 25 درجة مئوية لغسل المتوسطة. إزالة برنامج تلفزيوني.
- وضع الطبق على لوحة الألومنيوم على رأس الجليد سحقت.
ملاحظة: نحن نستخدم لوحة الألومنيوم 1 ملم سميكة قطع في متجر أداة الأحد أو واحدة متاحة تجاريا كمعدات المختبر. - أضف 200 ميكرولتر من حاجز التحلل عند 4 درجات مئوية. يهز الطبق أقل ما يقال بحيث يتم توزيع المخزن المؤقت بالتساوي في الجزء السفلي من الطبق.
- كشط الطبق باستخدام مكشطة الخلية واستعادة lysate مع حطام الخلية غير الملولوب في أنبوب جديد 1.5 مل.
- طرد مركزي الحل في 20400 س غ لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- استعادة supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية أو على الجليد.
ملاحظة: عدم تجميد lysate. - بالنسبة لقياسات الخلايا الحية، استبدل الوسط قبل القياس. تحقق من مرفق الخلية باستخدام مجهر تباين المرحلة. تأكيد التعبير باستخدام مجهر مضان.
4- معايرة التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS)
- بدء تشغيل النظام وتشغيل برنامج التشغيل. تشغيل أرجون+ ليزر (458/477/488/514 نانومتر). استقرار النظام على الأقل لمدة 30 دقيقة.
- إعداد المسار البصري: مقسم الحزمة الرئيسي: HFT488; مرآة ديكهروي: NFT600; مرشح حاجز الفلورسينس: مرشح ممر 505-540 (BP505-540)؛ كاشف: الصمام الثنائي الضوئي الانهيار الجليدي (APD)).
- قم بتعيين حجم الثقب بإدخال القيمة مباشرة (66 ميكرومتر؛ وحدة واحدة متجددة الهواء).
- أضف محلول رودامين 6G (Rh6G) إلى بئر من غرفة الزجاج الغطاء على خشبة المسرح.
- إضافة المياه فائقة الغمر على الهدف. لا تستخدم زيت الغمر.
- تعيين الغرفة على خشبة المسرح المجهر. نقل المرحلة إلى الموضع المناسب.
- ركز على السطح الزجاجي العلوي من خلال قياس الضوء المتناثر من السطح الزجاجي. بعد خفض العدسة الهدف إلى أسفل، بدوره مقبض التركيز في اتجاه عقارب الساعة لضبط.
ملاحظة: تحقق من اتجاه تحول مقبض التركيز لأنه هو عكس بين تلك المصنوعة في اليابان وألمانيا. - رفع نقطة محورية 200 ميكرومتر فوق سطح الزجاج العلوي لمراقبة داخل الحل.
- انقر على معدل العد وراقب معدل تعدادات فوتون.
- زيادة تدريجيا في acousto البصرية tunable مرشحات (AOTF) قيمة (على سبيل المثال، الإثارة انتقال الليزر) بحيث تكون قيمة معدل العد أكثر من 10 كيلوهرتز.
- انقر فوق تعديل الثقب وافتح معالج ضبط الثقب. العثور على موقف الثقب مع أعلى (ذروة) عدد من فوتونات في كل من المحور س ص.
- قم بتشغيل حلقة التصحيح للعدسة الهدف بحيث تكون قيمة العد لكل جزيء (CPM) هي الأعلى.
ملاحظة: بما أن سمك زجاج الغطاء للغرفة المحددة هنا هو 0.12-0.17 مم ، فإن حلقة التصحيح في حدها الأدنى أو مجرد بضعة منعطفات منه ، حيث يكون CPM في أقصى حد له. - إنقاص قيمة AOTF تدريجيا بحيث تصبح قيمة CPM 2-3 كيلو هرتز.
- الحصول على وظيفة الارتباط التلقائي (ACF) من Rh6G لمدة 90 s.
- بمجرد اكتمال القياس، انقر فوق احتواء لإجراء تحليل تركيب المنحنى.
- حدد نموذجا لنشر ثلاثي الأبعاد مكون واحد (ثلاثي الأبعاد) مع حالة ثلاثية الأبعاد.
ملاحظة: وRh6G هو monodisperse وعنصر واحد منتشر مع حالة ثلاثية. - تعيين وقت البدء المناسب عن طريق تحريك الخط الأحمر. انقر فوق احتواء الكل وتحقق من الانحراف الملائم. بعد تنفيذ تركيب المنحنى، تأكد من أن وقت الانتشار (DT) والمعلمة بنية (SP) تقريبا في نطاق 20-30 ميكروس و 4-8، على التوالي.
- تذكر قيمة المعلمة الهيكلية. استخدم قيمة SP لتحليل تركيب المنحنى لجميع ACFs التي تم قياسها في نفس اليوم ، في ظل نفس الظروف البصرية ، واستخدام نفس النوع من طبق الأساس الزجاجي أو زجاج الغطاء المغرغرم على مرحلة المجهر.
5. FCS القياس في lysate الخلية
- إعداد lysates الخلية (انظر أعلاه).
- وضع lysate على غرفة الزجاج الغطاء. ضع غطاء لتجنب التجفيف وغطاء المسرح للتظليل الخفيف.
- قم بتعيين حالة الامتلاك، وقوة الليزر، ووقت القياس، والتكرار.
- انقر فوق معدل العد وضبط قيمة AOTF الليزر بحيث تصبح قيمة CPM أكثر من كيلو هرتز واحد.
- إجراء قياس تجريبي لمدة دقيقة واحدة. تحقق مما إذا كان ACF المحسوب يظهر السعة الإيجابية والاضمحلال السلس.
- قم بإجراء القياس الرئيسي لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يتم زيادة وقت القياس الإجمالي تدريجيا حتى لا يتغير شكل ACF حتى في حالة زيادة وقت القياس. - انقر فوق احتواء لإجراء تحليل تركيب المنحنى.
- حدد نموذجا لنشر ثلاثي الأبعاد مكونين مع حالة ثلاثية. تذكر إدخال قيمة SP وتغيير إعدادها إلى "ثابت" وليس "مجاني" قبل النقر فوق احتواء الكل.
- تصدير الجدول المجهز كملف نصي محدد علامة تبويب.
- إذا لزم الأمر، قم بتصدير سجل معدل ACF و Count كملف نصي محدد بعلامات التبويب.
6. قياس FCS في الخلايا الحية
- استبدل الوسط بوسط جديد قبل القياس.
- استخدام حاضنة مرحلة الحرارة. تعيين طبق ثقافة الخلية على مرحلة المجهر.
- تأكيد التركيز والموقف باستخدام ميكروبي confocal. حدد خلية القياس. تكبير وضبط موضع الخلية. احصل على صور مضانة لخلية تعبر عن GFP باستخدام وضع سرعة المسح الضوئي البطيء.
- حدد موضع قياس FCS باستخدام الموضع في قسم "FCS".
- حدد نقطة قياس FCS واحدة على الأقل باستخدام مرمى(الشكل 1).
- قياس ACF لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: لأن البروتينات الفلورية تميل إلى أن تكون photobleached في الخلايا الحية بسبب بطء الحركة مقارنة مع الحل، ينبغي أن يكون الحد الأدنى من وقت القياس. من الصعب بشكل عام الحصول على ACF في الخلية بسلاسة مثل قياسات الحل لأن القياس المطول سيؤدي إلى bleaching الضوئي للبروتينات الفلورية. - انقر فوق احتواء لإجراء تحليل تركيب المنحنى باستخدام نموذج للنشر ثلاثي الأبعاد المكون من مكونين مع حالة ثلاثية.
ملاحظة: بالنسبة لقياسات الخلايا الحية، سيكون من الأفضل وضع نموذج لنشر ثلاثي الأبعاد مكونين مع حالة ثلاثية لأنه من الصعب تجريبيا تقليل القيمة المربعة مع نموذج نشر ثلاثي الأبعاد مكون واحد بسبب وجود مكونات متنقلة مختلفة في الخلية الحية. ولكن حتى باستخدام نموذج للنشر ثلاثي الأبعاد المكون من ثلاثة مكونات ، لا يتم فصل مكونات الانتشار عادة مقارنة باستخدام النموذج لمكونين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد قمنا بقياس FCS ل GFP-TDP25 في lysate الخلية وSUD1-G85R-GFP في الخلايا الحية. وفي كلتا الحالتين، أمكن الحصول على سعة إيجابية وسلاسة في الصناديق الاستئمانية. لقد أظهرنا أن جزءا من GFP-TDP25 أعرب في خلايا Neuro2a تم استردادها في جزء قابل للذوبان تحت الشرط المشار إليه6. في جزء قابل للذوبان من lysate الخلية، تم الكشف عن جزيئات مضان مشرق للغاية في سجل معدل العد الفوتون باستخدام FCS(الشكل 2A،أعلى، السهم). لم يلاحظ مثل هذه "المسامير (وتسمى أيضا انفجار)" في مونومرات GFP ومحلول صبغ الفلورسنت الكيميائية monodisperse، مما يشير إلى أن المسامير تشير إلى بروتينات أوليغوميريك9. أظهر تحليل تركيب المنحنى باستخدام نموذج يفترض انتشار ثلاثي الأبعاد مكونين مع حالة ثلاثية الانتشار أن جزيئات الانتشار السريع (DTFast = 186 μs) كانت ~ 90٪ وكانت ال 10٪ المتبقية 2.3 مللي ثانية(الشكل 2A، أسفل ؛ والجدول 2).
خلال قياس SOD1-G85R-GFP في الخلايا الحية، أظهر سجل معدل العد الفوتون انخفاضا تدريجيا، مما يشير إلى bleaching لها في حجم الكشف(الشكل 2B،أعلى). على الرغم من أن مساهمة photobleaching كان مبينا في نطاق أطول من 1 ثانية في إطار التعاون بين الجنسين، لوحظت السعة الإيجابية والاضمحلال السلس لل ACF(الشكل 2B،أسفل). أظهر تحليل تركيب المنحنى باستخدام نموذج على افتراض انتشار ثلاثي الأبعاد مكونين مع حالة ثلاثية الانتشار أن جزيئات الانتشار السريع (DTFast = 397 μs) كانت ~ 93.4٪ و6.6٪ المتبقية كانت 12.3 مللي ثانية(الجدول 2). لم تسمح الطفرة المرتبطة ب ALS ، G85R ، في SOD1 باختلاف كبير في خاصية الانتشار مقارنة بالنوع البري. ومع ذلك، انخفض تثبيط بروتياسوم معدل الانتشار فقط في متحولة G85R من SOD1 في السيتوبلازم7.
الشكل 1: صورة الفلورسنت Confocal من الخلايا Neuro2a التعبير عن SOD1-G85R-GFP. صورة فلورية كونفوجكال لخلايا Neuro2a تعبر عن SOD1-G85R-GFP. يشير التقاطع إلى موضع قياس FCS في السيتوبلازم. شريط = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:نتائج FCS النموذجية والمنحنيات المجهزة لوظائف العلاقة التلقائية. (A و B) الأعلى: معدل عدد فوتون مسجل في النطاق الزمني لقياس FCS (الخط الأخضر). أسفل: دالات العلاقات الذاتية المحسوبة (ACFs; الخام، وخطوط رمادية) وتركيبها منحنيات ACF باستخدام نموذج لنشر ثنائي مكون ثلاثي الأبعاد مع حالة ثلاثية (صالح، خطوط أرجواني). G(τ) لمحور Y يشير إلى سعة ACFs في الوقت τ ثانية بالنسبة للمحور X. تظهر خطوط النقاط نقاط وقت البدء والانتهاء المناسبة. تظهر الأسهم الزرقاء الداكنة الارتفاع مع البروتينات الساطعة للغاية التي تمر عبر حجم الكشف (أي أوليغومرات / مجاميع قابلة للذوبان). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم المواد/ المعدات | مكونات | تعليقات / وصف |
| 0.1 mM رودامين 6G الحل. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7.5 | ||
| 2 م كلوريد الصوديوم (NaCl) | ||
| مخزن Lysis المؤقت | 50 mM HEPES-KOH pH 7.5، 150 mM NaCl، 1٪ تريتون X-100، 1× كوكتيل مثبط البروتيز | يجب خلط كوكتيل مثبطات البروتيز قبل تحلل الخلية مباشرة. |
| متوسط النمو الطبيعي | تكملة DMEM مع 10٪ FBS و 100 U/mL البنسلين G و 100 ملغ / مل ستربتومايسين | يجب أن تكون هناك حاجة إلى التحقق من اللوت ل FBS. |
| الفوسفات العازلة المالحة (PBS) | 137 mM NaCl, 2.7 m M KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
الجدول 1: تركيبات الحلول
| CPM (كيلو هرتز) | DTسريع (مللي ثانية) | مكون سريع (٪) | DTبطيئة (مللي ثانية) | مكون بطيء (٪) | |
| GFP-TDP25 في lysate | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP في الخلايا الحية | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
الجدول 2: القيم النموذجية المجهزة لوظائف العلاقات الذاتية
يتم تمثيل القيم المجهزة لوظائف العلاقات التلقائية في الشكل 2 باستخدام نموذج للنشر ثلاثي الأبعاد المكونين مع حالة ثلاثية الأبعاد. يتم تمثيل عدد كل جزيء (CPM) ووقت الانتشار السريع والبطيء (DTFast و DTSlow، على التوالي) ومكوناتها (مكون سريع وبطيئ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفيما يتعلق بمعايرة النظام قبل القياسات، ينبغي استخدام نفس الأواني الزجاجية المستخدمة لقياس العينة (على سبيل المثال، تغطي الآبار الثمانية الحجرة الزجاجية لليسات الخلية وطبق الأساس الزجاجي للخلايا الحية مقاس 35 ملم). بسبب الامتزاز من Rh6G على الزجاج، قد ينخفض تركيزها الفعال في بعض الأحيان. إذا كان الأمر كذلك، ينبغي استخدام محلول Rh6G مركزة للغاية مثل 1 ميكرومتر فقط لتعديل الثقب. يجب تجنب معدلات العد الفوتون عالية للغاية لحماية الكاشف (على سبيل المثال، أكثر من 1000 كيلوهرتز). وعلاوة على ذلك، فإن الحل المركز غير مناسب لاقتناء وظيفة العلاقات الذاتية (الحفاظ على أقل من 100 كيلوهرتز). معايرة موقف الثقب مهم. إذا كان النظام البصري يستخدم بشكل متكرر ، فمن النادر حدوث خلع درامي للثقب ؛ وبالتالي ، فإن استخدام "Fine" في البداية غالبا ما لا يمثل مشكلة في العثور على الموقف المناسب. إذا لم يتم العثور على موضع الذروة لمعدلات العد باستخدام "Fine" ، فاستخدم "Coarse" لنقل الثقب من أحد طرفي نطاق الحركة إلى الطرف الآخر قبل العثور على الموضع باستخدام "Fine". إذا كانت سعة ACF مسطحة، فتحقق مما إذا كان التركيز والموضع مناسبين.
بعد قياس Rh6G وتركيبه، إذا كان DT و / أو SP خارج النطاق المشار إليه، أعد تجربة الثقب وتعديل حلقة التصحيح. عندما لا تزال تظهر خارج النطاق، نوصي بالاتصال بدعم الشركة المصنعة لأنه من المرجح أن يكون ذلك بسبب الاشتباه في انشقاق النظام البصري. باستخدام قياس DT و SP بالإضافة إلى معامل الانتشار المعروف من Rh6G (414 ميكرومتر2/ ثانية) في الماء ، يمكن حساب الخصر شعاع فعال لأن DT يعتمد على الخصر شعاع10. وعلاوة على ذلك، كما SP هو نسبة الخصر شعاع وارتفاع حجم الكشف الفعال، يمكن حساب حجم الكشف. حساب الحجم مطلوب لتحديد التركيز المطلق. مزيد من وصف المبدأ واستكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء المعايرة هو متاح أيضا في البروتوكولات كما ذكرت سابقا11،12،13.
ولوحظت بعض طفرات في قياس FCS من GFP-TDP25 في lysate الخلية(الشكل 2A،أعلى). نظهر أن مثل هذه المسامير لوحظت في قياس FCS من هنتنغتين المعرضة للجمع بما في ذلك تكرار البوليغلوتامين الموسع المسمى مع GFP أو البروتين الفلوري الأصفر (YFP) (HttQ78 و HttQ143)9؛ وبالتالي فإنه يقترح oligomers قابلة للذوبان / المجاميع من GFP-TDP25 في جزء قابل للذوبان من lysate الخلية. ولكن مثل هذا الارتفاع في عدد السكان كان نادرا؛ فقد كان هذا الارتفاع في عدد السكان نادرا. وبالتالي، فإن إطار التعاون الإقليمي ونتيجته الملائمة للمنحنى قد لا يتضمنان مساهمة كبيرة في هذه الارتفاعات. من المحتمل أن يكون السبب المحتمل لعدم تضمين كمية صغيرة فقط من المجاميع في الكسر القابل للذوبان هو أن TDP25 عرضة للتجميع بشكل كبير ويتم تجزئة مجاميعه في الكسر غير القابل للذوبان كما هو موضح باستخدام تجزئة من lysate الخلية يليها الكشف عن النشاف الغربي6. وقد لوحظت ظواهر الميل إلى التعافي إلى جزء غير قابل للذوبان من البروتين المعرضة للتراكم في كثير من الأحيان6،9. ولا يمكن بسهولة الكشف عن هذه الأوليغومرات/المجاميع القابلة للذوبان باستخدام الأساليب الكيميائية الحيوية التقليدية مثل SDS-PAGE يليها النشاف الغربي؛ وبالتالي، FCS له ميزة. ومع ذلك، من الصعب تحليل المكونات المتعددة باستخدام FCS التقليدية لأنه يقيس متوسط عدد السكان. ومن شأن المزيد من الإجراءات التنموية جنبا إلى جنب مع تحليل بايزي غير البارامترية تحديد المكونات المتعددة في العينة دون أي افتراضات للمكونات14.
كان وقت الانتشار في الخلايا الحية بطيئا نسبيا مقارنة بخلية lysate. منذ اللزوجة في الخلية ومن المعروف أن تكون أعلى من ذلك في حلول مثل برنامج تلفزيوني والمنظفات التي تحتوي على العازلة15، ووقت الانتشار في الخلايا الحية يحصل نظريا 2.5-3 مرات أطول. بسبب هذا الانتشار البطيء في الخلايا الحية مقارنة في الحل ، يمكن أن يكون سبب photobleaching من العلامات الفلورية في كثير من الأحيان. لتصحيح تأثير photobleaching على ACFs ، تم اقتراح بعض الإجراءات مثل افتراض الاضمحلال الأسي16 وتصفية الضوضاء باستخدام وظيفة الموجة17. وعلى الرغم من أن هذه التصحيحات يعتقد أنها فعالة، فإنها لم تكن حتى الآن بهذه البساطة بالنسبة للمستخدمين العامين لأنها تتطلب مهارات برمجة. وعلاوة على ذلك، في قياسات الخلايا الحية، ينبغي تحديد نطاق التركيب بعناية أكبر بحيث تصبح القيمة المربعة للمنحنى المجهز صغيرة. كما هو مبين في الشكل 2B، تم استبعاد النطاق الذي كان فيه G (τ) أقل من 1 من نطاق التركيب. بدلا من ذلك ، هناك حاجة إلى المزيد من علامات الفلورسنت photostable لتحليل نشر ببطء / نقل الجزيئات. GFP سهلة الاستخدام كعلامة وضع العلامات، واستقرارها على ما يرام، ولكن غالبا ما يكون photobleached خلال قياسات FCS. للتغلب على هذه الخاصية photostable، هالوتاغ مع رباعي ميثيل هودامين (TMR) كصبغة الفلورسنت الكيميائية كانت متاحة18. ومع ذلك، وضع العلامات غير مكتملة من قبل ligands الفلورسنت (على سبيل المثال، TMR-ligand) وبرك صبغ المحاصرين هي قضايا إشكالية لتسمية محددة من البروتينات ذات الأهمية19؛ وبالتالي ، فإن التعبير الخارجي عن البروتين من الفائدة الموسومة بالبروتينات الفلورية سيكون الخيار الأول لوضع العلامات الفلورية في الخلايا الحية.
هناك أنواع كثيرة من البروتينات الفلورية، فضلا عن الأصباغ الفلورية الكيميائية. ومع ذلك ، كما هو موضح في هذه المقالة ، فإن GFP المعزز أحادي المرونة (meGFP) هو علامة سهلة الاستخدام ل FCS بالإضافة إلى المجهر الفلوري الآخر لأن خصائصه الكيميائية الحيوية والفلورسينس معروفة جيدا. لذلك، في دراساتنا، meGFP هو الخيار الأول وتستخدم عموما لتسمية البروتينات المعرضة للتجميع لقياسات FCS6،7،9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
هؤلاء المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
11- وتحظى منظمة "A.K. " بدعم من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة في المعونة لأغراض البحث العلمي (C) (#18K06201)، ومنحة معونة من مؤسسة ناكاتاني للتدابير المضادة ضد العدوى الجديدة بالفيروس التاجي، ومنحة من مكتب جامعة هوكايدو لتطوير قادة بحوث المستقبل (L-Station)، ومنحة مساعدة من مؤسسة هوانشا. 10 - وتحظى م. ك. بدعم جزئي من منحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات الابتكارية "كيمياء النظم الحيوية المتعددة الجزيئات التي تزاحم" (#20H04686)، ومنحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات المبتكرة "فيزياء المعلومات للمسائل المعيشية" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
