Summary
אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.
Abstract
צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.
Introduction
צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלבונים וצבירה ספציפית לצבירה צבע פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב3. עם זאת, קשה לזהות את הצבירה, במיוחד בתאים חיים באמצעות הליכים קלאסיים כאלה.
העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא הליך לגילוי צבירת חלבונים ושינוי מבני. עם זאת, FRET אינו מסוגל לנתח את דינמיקת החלבון (למשל, דיפוזיה ואוליגומריזציה של חלבון בתאים חיים)3. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט לזיהוי צבירת חלבונים בתמיסה (למשל, ליזלת תאים) ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות (FCS), המודדת את מאפיין הדיפוזיה והבהירות של מולקולות פלואורסצנטיות עם רגישות למולקולותבודדות 4. FCS היא שיטת ספירת פוטון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר (LSM). באמצעות גלאי פוטון רגיש מאוד וחישוב של פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של זמן ההגעה של פוטון, המעבר בזמן ובבהירות של מולקולות הפלואורסצנט בנפח הגילוי נמדד. הדיפוזיה מאטה עם עלייה במשקל מולקולרי; לכן, אינטראקציה בין מולקולרית ניתן להעריך באמצעות FCS. אפילו יותר בעוצמה, עלייה בבהירות של מולקולת הפלואורסצנט מצביעה על הומו-אוליגומריזציה של המולקולות. לכן, FCS הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות צבירת חלבון כזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומרים ריאגנטים
- השתמש בפתרונות חינם pyrogenic ובינוני עבור תרבות התא (טבלה 1).
- הכינו פתרונות לניסוי הביוכימי באמצעות מים אולטרה-דקים והשתמשו בהם כ-DNase/RNase ללא תשלום.
- בחר FBS מתאים עבור תרבות התא עם תהליך בדיקה רב. מאחר שמגרש FBS שנבחר משתנה באופן קבוע, אין אפשרות לייצג כאן את הקטלוג ואת מספר הלוט עבור FBS.
- פלסמיד דנ"א
- הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל.
הערה: meGFP היא גרסה מונומרית הנושאת מוטציה A206K של GFP משופרת (eGFP). TDP25 הוא קטע מסוף C הקשור ל- ALS של TDP-43. SOD1-G85R הוא מוטציה הקשורה ל- ALS של SOD1.
- הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל.
- זן תאים
- השתמש בתאי נוירובלסטומה מורין Neuro2a.
הערה: תאי Neuro2a יש יעילות transfection גבוהה וחלבונים אקסוגני אקספרס מאוד. עבור ביטוי TDP25, זני תאים בעלי יעילות ביטוי גבוהה כגון נוירו2a או HEK293 תאים נדרשים. בתאי HeLa, TDP25 לא היה מסוגל לבוא לידי ביטוי ביעילות.
- השתמש בתאי נוירובלסטומה מורין Neuro2a.
2. תרבות התא ו transfection
- הכן צלחת פלסטיק 100 מ"מ גדל Neuro2a תאים חצי משולבת במדיום צמיחה נורמלי.
הערה: יש צורך לדגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 48-72 שעות לאחר הזריעה הקודמת עד חצי מפגש הוא הגיע. - הסר את המדיום.
- הוסף 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA לתוך צלחת תרבות התא ולהדגיר אותם ב 37 °C (69 °F) במשך 1 דקות.
- מוסיפים 9.5 מ"ל של מדיום צמיחה נורמלי לתוך המנה ולהשעות את התאים המנותקים.
- באמצעות Trypan כחול כדי להכתים את התאים המתים, לספור את מספר התאים באמצעות מונה התא או באופן ידני. לאחר מכן לדלל את התאים במדיום תרבות (1.0 × 105/ מ"ל).
- מוסיפים 2 מ"ל של השעיית תאים לתבשיל פלסטיק 35 מ"מ לתזת תאים או צלחת בסיס זכוכית למדידת תא חי.
- דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יום אחד.
- התחל את ההכנות הבאות 15 דקות לפני יום ההשתנות.
- הכינו שני צינורות 1.5 מ"ל והוסיפו 100 μL של Opti-MEM I לכל צינור.
- בצינור הראשון, מערבבים 1.0 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (פתרון A). בצינור השני, לערבב 2.5 μL של ליפופקטמין 2000 (פתרון B).
הערה: כדי לשמור על יעילות transfection, לשמור על כמות ה-DNA הכוללת זהה. כדי להפחית את רמת הביטוי למדידת FCS בתאים חיים, כמות השבר של DNA פלסמיד עבור ביטוי חלבון צריך להקטין (למשל, 0.2 מיקרוגרם של pmeGFP-N1-SOD1-G85R ו 0.8 מיקרוגרם של תערובת pCAGGS). יתר על כן, לשמור על אותו יחס בין נפח Lipofectamine 2000 ואת כמות ה-DNA פלסמיד. - מערבבים בעדינות את הפתרון A ו- B על ידי הוספת אחד לשני הצינורים, ולאחר מכן דגירה אותו במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (פתרון C).
- הוסף את הפתרון C למדיום התרבות; ולהדגיר את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F).
3. תמוגת תאים והחלפה בינונית
- בדוק את ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ שגרתי.
- מוציאים את המדיום בצלחת.
- הוסף 2 מ"ל של PBS ב 25 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את המדיום. הסר את PBS.
- מניחים את המנה על צלחת אלומיניום על גבי הקרח כתוש.
הערה: אנו משתמשים בצלחת אלומיניום בעובי 1 מ"מ שנחתכה בחנות כלים של יום ראשון או זמינה מסחרית כציוד מעבדה. - הוסף 200 μL של מאגר תמוגה ב 4 מעלות צלזיוס. לנער את המנה במתינות, כך החיץ מופץ באופן שווה בתחתית המנה.
- לגרד את המנה באמצעות מגרד תאים ולשחזר את lysate עם פסולת תא לא פתורה בצינור חדש 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה הפתרון ב 20,400 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשחזר את supernatant בצינור חדש 1.5 מ"ל ולשמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
הערה: אין להקפיא את הליסאט. - למדידות תאים חיים, החלף את המדידה לפני המדידה. בדוק את הקובץ המצורף לתא באמצעות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. אשר ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. כיול ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS)
- הפעל את המערכת והפעל את תוכנת ההפעלה. הפעל את ארגון+ לייזר (458/477/488/514 ננומטר). לייצב את המערכת לפחות במשך 30 דקות.
- הגדר את הנתיב האופטי: מפצל קרן ראשי: HFT488; מראה דיכרית: NFT600; מסנן מחסום פלואורסצנטי: מסנן פס 505-540 (BP505-540); גלאי: פוטודיודה מפולת שלגים (APD)).
- הגדר את גודל חור הסיכה על-ידי הזנת הערך ישירות (66 מיקרומטר; יחידה אוורירית אחת).
- מוסיפים את הפתרון רודמין 6G (Rh6G) לתוך באר של תא זכוכית כיסוי על הבמה.
- הוסף את המים האולטרה-דקים לטבילה במטרה. אין להשתמש בשמן הטבילה.
- שים את התא על במת המיקרוסקופ. הזז את הבמה למיקום המתאים.
- התמקדו במשטח הזכוכית העליון על ידי מדידת האור המפוזר מפני הזכוכית. לאחר הנמכת העדשה האובייקטיבית לתחתית, סובב את ידית המיקוד בכיוון השעון כדי להתאים.
הערה: בדוק את כיוון הפנייה של ידית המיקוד מכיוון שהיא הפוכה בין אלה שנעשו ביפן ובגרמניה. - הרם את המוקד 200 מיקרומטר מעל משטח הזכוכית העליונה כדי להתבונן בחלק הפנימי של הפתרון.
- לחץ על קצב הספירה ונטר את קצב ספירת הפוטונין.
- הגדל בהדרגה את ערך המסננים הניתנים לכוונון acousto-optic (AOTF) (למשל, שידור לייזר עירור) כך שערך קצב הספירה יהיה יותר מ- 10 kHz.
- לחצו על 'התאמת חור סיכה' ופתחו את אשף התאמת חור הסיכה. מצא את מיקום חור הסיכה עם המספר הגבוה ביותר (שיא) של פוטונים הן בציר x והן בציר y.
- סובב את טבעת התיקון של העדשה האובייקטיבית כך שהערך ספירות לכל מולקולה (CPM) הוא הגבוה ביותר.
הערה: מכיוון עובי זכוכית הכיסוי של התא שצוין כאן הוא 0.12-0.17 מ"מ, טבעת התיקון היא סביב המינימום שלה או רק כמה סיבובים ממנו, שבו עלות לאלף חשיפות היא המקסימום שלה. - הקטן את ערך ה- AOTF בהדרגה כך שערך עלות לאלף חשיפות יהפוך ל- 2-3 קילו-הרץ.
- לרכוש את פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של Rh6G עבור 90 s.
- לאחר השלמת המדידה, לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה.
- בחר מודל לפיזור תלת-ממדי (תלת-ממדי) של רכיב אחד עם מצב שלישייה.
הערה: Rh6G הוא מונודיספרס ורכיב אחד מפוזר עם מצב שלישייה. - הגדר את שעת ההתחלה המתאימה על-ידי הזזת הקו האדום. לחץ על התאם הכל ובדוק את סטיית ההתאמה. לאחר ביצוע התאמת העקומה, ודא שזמן הדיפוזיה (DT) ות פרמטר המבנה (SP) נמצאים בערך בטווח של 20-30 מיקרומטר ו- 4-8, בהתאמה.
- זכור את ערך הפרמטר המבני. השתמש בערך SP לניתוח התאמת עקומה של כל מסמכי ה- ACF הנמדדים באותו יום, באותם תנאים אופטיים, ושימוש באותו סוג של צלחת בסיס זכוכית או ערכת זכוכית כיסוי קאמרית על שלב המיקרוסקופ.
5. מדידת FCS ב- lysate התא
- הכן את lysates התא (ראה לעיל).
- מניחים את lysate על תא זכוכית כיסוי. מניחים מכסה כדי למנוע ייבוש ואת מכסה הבמה להצללה קלה.
- הגדר את תנאי הרכישה, עוצמת הלייזר, זמן המדידה והחזרות.
- לחץ על קצב ספירה והתאם את ערך ה- AOTF של הלייזר כך שערך ה- CPM יהפוך ליותר מ- 1 kHz.
- בצע מדידת ניסיון במשך דקה. בדוק אם ACF המחושב מראה משרעת חיובית וריקבון חלק.
- בצע את המדידה העיקרית במשך 5 דקות.
הערה: זמן המדידה הכולל גדל בהדרגה עד שצורת ה- ACF אינה משתנה גם אם זמן המדידה מוגדל. - לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה.
- בחרו דגם לפיזור תלת-ממדי דו-רכיבי עם מצב שלישייה. זכור להזין את ערך SP ולשנות את ההגדרה שלו ל"קבוע" ולא "חופשי" לפני שתלחץ על התאם הכל.
- יצא את הטבלה המותאמת כקובץ טקסט המופרד באמצעות טאבים.
- במידת הצורך, יצא את רשומת קצב ACF ו- Count כקובץ טקסט המופרד באמצעות טאבים.
6. מדידת FCS בתאים חיים
- החלף את המדיום במדידה טרייה לפני המדידה.
- השתמש באינקובטור שלב חום. הניחו את צלחת תרבות התאים על במת המיקרוסקופ.
- אשר את המיקוד והמיקום באמצעות המיקרופה הקונפוקלית. בחר את תא המדידה. הגדל והתאם את מיקום התא. השג תמונות פלואורסצנטיות של תא מבטא GFP באמצעות מצב מהירות סריקה איטית.
- בחר מיקום מדידת FCS באמצעות מיקום בסעיף "FCS".
- בחרו לפחות נקודת מדידה אחת של FCS בעזרת הכוונת (איור 1).
- למדוד את ACF במשך 1 דקות.
הערה: מכיוון שחלבונים פלואורסצנטיים נוטים להיות פוטובלצ'ים בתאים חיים עקב תנועה איטית בהשוואה לפתרון, זמן המדידה צריך להיות מינימלי. בדרך כלל קשה להשיג ACF בתא בצורה חלקה כמו מדידות פתרון כי מדידה ממושכת תוביל photobleaching של חלבונים פלואורסצנטיים. - לחץ על התאם כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה באמצעות מודל לפיזור תלת-ממדי של שני רכיבים עם מצב שלישייה.
הערה: עבור מדידות תאים חיים, מודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית של שני רכיבים עם מצב שלישייה יהיה טוב יותר מכיוון שקשה מבחינה אמפירית להקטין את הערך הריבועי של הצ'י עם מודל דיפוזיה תלת-ממדי של רכיב אחד בשל קיומם של רכיבים ניידים שונים בתא החי. אבל אפילו באמצעות מודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית של שלושה רכיבים, רכיבי הדיפוזיה בדרך כלל אינם מופרדים בהשוואה לשימוש במודל עבור שני רכיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו מדידת FCS של GFP-TDP25 בתא ליסקאט ו- SOD1-G85R-GFP בתאים חיים. בשני המקרים, משרעת חיובית ACFs חלקה הצליחו לרכוש. הראינו כי חלק GFP-TDP25 לידי ביטוי בתאי Neuro2a התאושש בשבר מסיס תחת התנאי המצוין6. בחלק המסיס של lysate התא, מולקולות פלואורסצנטיות בהירות מאוד זוהו ברשומה קצב ספירת פוטון באמצעות FCS (איור 2A, למעלה, חץ). כזה "קוצים (המכונה גם פרץ)" לא נצפו מונומרים GFP ותמיסת צבע פלואורסצנטי כימי מונודיספרס, מה שמרמז כי הקוצים מצביעים על חלבונים אוליגומריים9. ניתוח התאמת עקומה באמצעות מודל בהנחה של דיפוזיה תלת-ממדית בשני רכיבים עם מצב שלישייה הראה כי מולקולות פיזור מהיר (DTFast = 186 μs) היו ~ 90% ו 10% הנותרים היו 2.3 ms (איור 2A, למטה; וטבלה 2).
במהלך מדידת SOD1-G85R-GFP בתאים חיים, רשומת קצב ספירת הפוטונין הראתה ירידה הדרגתית, מה שמרמז על ירידה הדרגתית בפוטו-בלאק בנפח הזיהוי (איור 2B, למעלה). למרות שתרומת הצילום הוצגה בטווח ארוך מ-1 s ב-ACF, נצפתה משרעת חיובית וריקבון חלק של ה-ACF(איור 2B, למטה). ניתוח התאמת עקומה באמצעות מודל בהנחה דיפוזיה תלת-ממדית שני רכיבים עם מצב שלישייה הראה כי מולקולות פיזור מהיר (DTFast = 397 μs) היו ~ 93.4% ו 6.6% הנותרים היו 12.3 ms (טבלה 2). מוטציה הקשורה ל- ALS, G85R, ב- SOD1 לא אפשרה הבדל דרמטי במאפיין דיפוזיה בהשוואה לסוג פראי. עם זאת, עיכוב פרוטאזום ירד שיעור הדיפוזיה רק מוטציה G85R של SOD1 בציטופלסמה7.
איור 1: תמונת פלואורסצנט קונפוקלית של תאי Neuro2a המבטאים SOD1-G85R-GFP. תמונה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאי Neuro2a המבטאים SOD1-G85R-GFP. הכוונת מציינת את מיקום המדידה של FCS בציטופלסמה. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות FCS אופייניות ועקומות מותאמות לפונקציות התיקון האוטומטי. (A ו- B) למעלה: קצב ספירת פוטון מוקלט בטווח זמן המדידה של FCS (קו ירוק). למטה: פונקציות חישוביות של תיקון שגיאות אוטומטי (ACFs; קווים גולמיים, אפורים) ועקומות ACF מותאמות באמצעות מודל לפיזור תלת-ממדי של שני רכיבים עם מצב שלישייה (Fit, קווי מגנטה). G(τ) עבור ציר Y מציין את משרעת של מסמכי ACFs בזמן τ שניות. עבור ציר X. קווי נקודה מציגים נקודות התחלה ושם סיום מתאימות. חצים כחולים כהים מראים את היתד עם חלבונים בהירים במיוחד העוברים דרך נפח הגילוי (כלומר, אוליגומרים/אגרגטים מסיסים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם חומר/ציוד | רכיבים | הערות/תיאור |
| 0.1 mM רודמין 6G פתרון. | ||
| 1 מ' היפס-קו pH 7.5 | ||
| 2 מ' נתרן כלורי (NaCl) | ||
| מאגר תמוגה | 50 מ"מ HEPES-KOH pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 1% טריטון X-100, 1× קוקטייל מעכב פרוטאז | קוקטייל מעכב פרוטאז צריך להיות מעורבב רק לפני תמוגת התא. |
| מדיום צמיחה רגיל | DMEM בתוספת 10% FBS ו 100 U/mL פניצילין G ו 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין | יש לדרוש בדיקת לוט עבור FBS. |
| מלוחים של מאגר פוספט (PBS) | 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מנה 2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4 |
טבלה 1: קומפוזיציות פתרון
| עלות לאלף חשיפות (kHz) | DTמהיר (אלפיות שניה) | רכיב מהיר (%) | DTאיטי (אלפיות שניה) | רכיב איטי (%) | |
| GFP-TDP25 ב lysate | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP בתא חי | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
טבלה 2: ערכים מותאמים אופייניים לפונקציות התיקון האוטומטי
ערכים מותאמים לפונקציות התיקון האוטומטי מיוצגים באיור 2 באמצעות מודל לפיזור תלת-ממדי של שני רכיבים עם מצב שלישייה. ספירות לכל מולקולה (עלות לאלף חשיפות), זמן דיפוזיה מהיר ואיטי (DTFast ו- DTSlow, בהתאמה) והרכיבים שלהם (רכיב מהיר ואיטי) מיוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ"מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חור הסיכה. יש להימנע משיעורי ספירת פוטון גבוהים במיוחד כדי להגן על הגלאי (למשל, יותר מ-1,000 קילו-הרץ). יתר על כן, הפתרון המרוכז אינו מתאים לרכישת פונקציית תיקון אוטומטי (לשמור על פחות מ 100 kHz). הכיול של מיקום חור סיכה חשוב. אם המערכת האופטית משמשת לעתים קרובות, זה נדיר עבור נקע דרמטי של חור הסיכה; לכן, באמצעות "בסדר" בהתחלה היא לעתים קרובות אין בעיה למצוא את המיקום המתאים. אם לא נמצאה מיקום שיא של שיעורי הספירה באמצעות "Fine", השתמש ב"גס" כדי להזיז את חור הסיכה מקצה אחד של טווח התנועה לקצה השני לפני מציאת המיקום באמצעות "Fine". אם משרעת ה- ACF הייתה שטוחה, בדוק אם המיקוד והמיקום מתאימים.
לאחר מדידת Rh6G והתאמתה, אם ה- DT ו/ או SP נמצאים מחוץ לטווח שצוין, נסה מחדש את התאמת חור הפינה וטבעת התיקון. כאשר עדיין מראה מחוץ לטווח, אנו ממליצים לפנות לתמיכת היצרן כפי שהוא צפוי בשל חשד עריקה של המערכת האופטית. באמצעות DT נמדד SP בנוסף מקדם דיפוזיה ידוע של Rh6G (414 מיקרומטר2/s) במים, המותניים קרן יעיל ניתן לחשב כי DT תלוי המותניים קרן10. יתר על כן, כמו SP הוא היחס של המותניים קרן ואת הגובה של נפח זיהוי יעיל, נפח הגילוי ניתן לחשב. חישוב הנפח נדרש כדי לקבוע ריכוז מוחלט. תיאור נוסף של העיקרון ופתרון בעיות במהלך הכיול זמין גם בפרוטוקולים כפי שדווח בעבר11,12,13.
קוצים מסוימים נצפו במדידת FCS של GFP-TDP25 ב- lysate התא(איור 2A, למעלה). אנו מראים כי קוצים כאלה נצפו במדידת FCS של צייד נוטה צבירה כולל חוזר פוליגלוטמין מורחב שכותרתו עם GFP או חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) (HttQ78 ו HttQ143)9; זה אפוא מרמז אוליגומרים מסיסים / אגרגטים של GFP-TDP25 בחלק המסיס של ליזאט התא. ואולם, אוכלוסיית ספייק שכזו הייתה נדירה; לפיכך, ACF ותוצאת התאמת העקומה שלה לא יכול לכלול תרומה גדולה של קוצים כאלה. סיבה אפשרית לכך שרק כמות קטנה של אגרגטים נכללים בשבר המסיס היא ככל הנראה משום ש- TDP25 נוטה מאוד לצבירה והאגרגטים שלו מופרדים בשבר הבלתי מסיס כפי שמוצג באמצעות שבר של ליסטד התא ואחריו זיהוי נפיחות מערבי6. תופעות הנטייה להתאושש לשבר הבלתי מסיס של חלבון נוטה לצבירה נצפו לעתיםקרובות 6,9. אוליגומרים/אגרגטים מסיסים כאלה אינם ניתנים לגילוי בקלות בשיטות ביוכימיות קונבנציונליות כגון SDS-PAGE ואחריו סופג מערבי; לכן, FCS יש יתרון. עם זאת, כדי לנתח רכיבים מרובים באמצעות FCS קונבנציונלי קשה כי זה מודד את האוכלוסייה הממוצעת. הליכים התפתחותיים נוספים בשילוב עם ניתוח לא פרמטרי בייסיאני יקבעו את ריבוי הרכיבים במדגם ללא הנחות כלשהן עבור הרכיבים14.
זמן הדיפוזיה בתאים חיים היה איטי יחסית לתא lysate. מאז צמיגות בתא ידוע להיות גבוה יותר מזה בפתרונות כגון PBS ומאגר המכיל חומר ניקוי15, זמן הדיפוזיה בתאים חיים תיאורטית מקבל 2.5-3 פעמים יותר. בשל דיפוזיה איטית זו בתאים חיים המשווים בתמיסה, פוטובלאצ'ינג של תגי פלואורסצנט יכול להיגרם לעתים קרובות. כדי לתקן את אפקט photobleaching על ACFs, כמה הליכים כגון הנחת ריקבון אקספוננציאלית16 ו סינון רעש באמצעות פונקציית wavelet הוצעו17. למרות תיקונים כאלה הם האמינו להיות יעיל, זה עדיין לא היה כל כך פשוט עבור משתמשים כלליים כי זה דורש כישורי תכנות. יתר על כן, במדידות תאים חיים, טווח ההתאמה צריך להיקבע בזהירות רבה יותר, כך הערך ריבוע צ'י של העקומה מצויד הופך קטן. כפי שמוצג באיור 2B, הטווח שבו G(τ) היה פחות מ- 1 לא נכלל בטווח המתאים. לחלופין, תגי פלואורסצנט יותר לצילום נדרשים לנתח מולקולות מתפזרות/נעות לאט. GFP קל לשימוש כתג תיוג, ויציבותו היא טובה, אבל זה לעתים קרובות photobleached במהלך מדידות FCS. כדי להתגבר על נכס זה phototable, HaloTag עם tetramethylrhodamine (TMR) כמו צבע פלואורסצנטי כימי כבר זמין18. עם זאת, תיוג לא שלם על ידי ליגנדים פלואורסצנטיים (למשל, TMR-ligand) ובריכות צבע לכודים הם נושאים בעייתיים לתיוג ספציפי של חלבונים מעניינים19; לפיכך, ביטוי אקסוגני של חלבון בעל עניין המתויג בחלבונים פלואורסצנטיים יהיה הבחירה הראשונה לתיוג פלואורסצנטי בתאים חיים.
ישנם סוגים רבים של חלבונים פלואורסצנטיים, כמו גם צבעים פלואורסצנטיים כימיים; עם זאת, כפי שמוצג במאמר זה, GFP משופר מונומרי (meGFP) הוא תג קל לשימוש עבור FCS, כמו גם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אחרים כי המאפיינים הביוכימיים שלה פלואורסצנטי ידועים. לכן, במחקרים שלנו, MEGFP היא הבחירה הראשונה ומשמש בדרך כלל כדי לתייג את החלבונים נוטה צבירה עבור מדידות FCS6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אלה אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים "כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות" (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים "פיזיקת מידע בענייני חיים" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
