Summary
Vi introducerer her en procedure til måling af protein oligomerer og sammenlægning i celle lysat og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi.
Abstract
Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons Sygdom (HS) osv. For at detektere og analysere opløselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater er der anvendt fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektere diffusionshastigheden og lysstyrken af en enkelt partikel med en enkelt molekylefølsomhed. Den korrekte procedure og knowhow til registrering af proteinsammenlægning er imidlertid ikke blevet udbredt. Her viser vi en standardprocedure for FCS-måling for diffusionsegenskaber af aggregerings-tilbøjelige proteiner i celle lysat og levende celler: ALS-associeret 25 kDa carboxyl-terminalfragment af TAR DNA/ RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoxid dismutase 1 (SOD1). De repræsentative resultater viser, at en del af aggregaterne af grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket TDP25 var lidt inkluderet i den opløselige fraktion af murine neuroblastoma Neuro2a celle lysat. Desuden viser GFP-mærket SOD1 med ALS-associeret mutation en langsommere diffusion i levende celler. Derfor introducerer vi her proceduren til påvisning af proteinsammenlægningen via dens diffusionsegenskab ved hjælp af FCS.
Introduction
Proteinsammenlægninger, der involverer neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom og så videre1 er kendt for at være giftige og ville forstyrre proteinhomostase (proteostase) i celler og organer, som derefter kan føre tilaldring 2. Rydning af proteinsammenlægning forventes som en terapeutisk strategi; Der er dog endnu ikke etableret kemikalier, der forhindrer dannelse af proteinsammenlægning og nedbryder proteinaggregater (f.eks. små molekyler eller lægemidler). Desuden er det stadig vanskeligt at finde ud af, hvordan proteinsammenlægning udøver toksicitet. For at fremme forskningsprojekter i forbindelse med proteinsammenlægning er det derfor vigtigt at indføre procedurer for høj overførselshastighed for blot at detektere proteinsammenlægning. Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af antistoffer, der anerkender overensstemmelsen af proteinsammenlægning og aggregeringsspecifikt fluorescerende farvestof, er blevet anvendt i vid udstrækning3. Det er dog vanskeligt at opdage sammenlægningen, især i levende celler ved hjælp af sådanne klassiske procedurer.
Förster resonans energioverførsel (FRET) er en procedure til påvisning af proteinsammenlægning og strukturelle ændringer. FRET er imidlertid ikke i stand til at analysere proteindynamik (f.eks. diffusion og oligomerisering af protein i levende celler)3. Derfor introducerer vi her en simpel protokol til påvisning af proteinsammenlægning i opløsning (f.eks. celle lysat) og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som måler diffusionsegenskaben og lysstyrken af fluorescerende molekyler med enkeltmolekylefølsomhed4. FCS er en foton-tælle metode ved hjælp af en laserscanning confocal mikroskop (LSM). Ved hjælp af en meget følsom fotondetektor og beregning af autokorrelationsfunktion (ACF) af foton ankomsttid måles gennemløbstiden og lysstyrken af fluorescerende molekyler i detektionsvolumen. Diffusionen aftager med en forøgelse af molekylvægten; Således kan intermolekylær interaktion estimeres ved hjælp af FCS. Endnu mere kraftfuldt indikerer en stigning i lysstyrken af fluorescerende molekyle homo-oligomerisering af molekylerne. Derfor er FCS et kraftfuldt værktøj til at opdage en sådan proteinsammenlægning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materialer og reagenser
- Brug pyrogene frie opløsninger og medium til cellekultur(tabel 1).
- Forbered løsninger til det biokemiske eksperiment ved hjælp af ultrapure vand og brug som DNase / RNase gratis.
- Vælg en passende FBS til cellekulturen med en lotkontrolproces. Da det valgte FBS-parti ændres regelmæssigt, kan kataloget og lotnummeret for FBS ikke repræsenteres her.
- Plasmid DNA
- Forbered pmeGFP-N15 til monomert eGFP-udtryk. pmeGFP-C1-TDP256 for GFP-TDP25 udtryk; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 for SOD1-G85R-GFP-udtryk; og pCAGGS8 som transportør.
BEMÆRK: meGFP er en monomerisk variant, der bærer A206K-mutation af forbedret GFP (eGFP). TDP25 er et ALS-associeret C-terminalfragment af TDP-43. SOD1-G85R er en ALS-associeret mutant af SOD1.
- Forbered pmeGFP-N15 til monomert eGFP-udtryk. pmeGFP-C1-TDP256 for GFP-TDP25 udtryk; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 for SOD1-G85R-GFP-udtryk; og pCAGGS8 som transportør.
- Cellestamme
- Brug murine neuroblastoma Neuro2a celler.
BEMÆRK: Neuro2a celler har høj transfekt effektivitet og meget udtrykke eksogene proteiner. For TDP25-udtryk kræves cellestammer med høj ekspressionseffektivitet som Neuro2a- eller HEK293-celler. I HeLa-celler var TDP25 ikke i stand til at udtrykkes effektivt.
- Brug murine neuroblastoma Neuro2a celler.
2. Cellekultur og transinfektion
- Forbered en 100 mm plast parabol voksende Neuro2a celler semi-confluently i normal vækst medium.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at inkubere ved 37 °C i ca. 48-72 timer efter den foregående såning, indtil halvflydende er nået. - Fjern mediet.
- Der tilsættes 0,5 ml trypsin-EDTA-opløsning i cellekulturen og inkuberes ved 37 °C i 1 min.
- Tilsæt 9,5 mL normalt vækstmedium i skålen og ophæng de løsrevne celler.
- Brug Trypan blå til at plette de døde celler, tælle antallet af celler ved hjælp af en celle tæller eller manuelt. Derefter fortyndes cellerne i dyrkningsmediet (1,0 × 105/mL).
- Der tilsættes 2 mL celleaffjedring til en 35 mm plastikskål til celle lysis eller en glasstafstand til måling af levende celler.
- Skålen inkuberes ved 37 °C i 1 dag.
- Start følgende præparater 15 minutter før dagen for transfekten.
- Forbered to 1,5 mL rør og tilsæt 100 μL Opti-MEM I til hvert rør.
- I det første rør blandes 1,0 μg plasmid-DNA (opløsning A). I det andet rør blandes 2,5 μL Lipofectamine 2000 (opløsning B).
BEMÆRK: For at opretholde transfekteffektiviteten skal den samlede DNA-mængde holdes den samme. For at reducere ekspressionsniveauet for FCS-måling i levende celler bør brøkdelen af plasmid-DNA for proteinudtryk falde (f.eks. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R og 0,8 μg pCAGGS-blanding). Desuden skal det samme forhold mellem mængden af Lipofectamine 2000 og mængden af plasmid-DNA bevares. - Bland forsigtigt løsning A og B ved at tilsætte et i begge rør, og inkuber det derefter i 1 minut ved stuetemperatur (løsning C).
- Føj løsning C til kulturmediet. og inkuber cellerne i 24 timer ved 37 °C.
3. Celle lysis og medium udveksling
- Kontroller GFP-udtrykket ved hjælp af et rutinemæssigt mikroskop.
- Fjern mediet i skålen.
- Der tilsættes 2 mL PBS ved 25 °C for at vaske mediet ud. Fjern PBS.
- Placer skålen på en aluminiumsplade oven på den knuste is.
BEMÆRK: Vi bruger en 1 mm tyk aluminium plade skåret i en søndag værktøjsbutik eller kommercielt tilgængelige en som laboratorieudstyr. - Der tilsættes 200 μL lysisbuffer ved 4 °C. Ryst skålen mildt, så bufferen fordeles jævnt i bunden af skålen.
- Skrab skålen ved hjælp af en celleskraber og gendan lysatet med uopløst celleaffald i et nyt 1,5 mL rør.
- Opløsningen centrifugeres ved 20.400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten genvindes i et nyt 1,5 mL rør, og den holdes ved 4 °C eller på is.
BEMÆRK: Lysatet må ikke fryses. - Til målinger af levende celler skal mediet udskiftes før målingen. Kontroller den vedhæftede fil i cellen ved hjælp af et mikroskop med fasekontrast. Bekræft udtryk ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
4. Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) kalibrering
- Start systemet, og kør driftssoftwaren. Tænd argon+ laser (458/477/488/514 nm). Stabilisere systemet mindst i 30 min.
- Opsætning af den optiske sti: Hovedstråle splitter: HFT488; Dichroic spejl: NFT600; Fluorescensbarrierefilter: et båndkortfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: lavine fotodiode (APD)).
- Indstil pinhole-størrelsen ved at indtaste værdien direkte (66 μm; 1 luftig enhed).
- Tilsæt Rhodamin 6G (Rh6G) opløsningen i en brønd af dækglaskammeret på scenen.
- Tilsæt nedsænkning ultrapure vand på målet. Brug ikke nedsænkningsolien.
- Sæt kammeret på mikroskop scenen. Flyt stadiet til den relevante position.
- Fokuser på den øverste glasoverflade ved at måle det spredte lys fra glasoverfladen. Når du har sænket den objektive linse til bunden, skal du dreje fokusknappen med uret for at justere.
BEMÆRK: Kontroller drejeretningen af fokusknappen, fordi den er modsat mellem dem, der er lavet i Japan og Tyskland. - Hæv omdrejningspunktet 200 μm over den øverste glasoverflade for at observere indersiden af opløsningen.
- Klik på tællehastigheden, og overvåg antallet af foton.
- Gradvist øge acousto-optiske justerbare filtre (AOTF) værdi (f.eks excitation laser transmission), således at tællehastigheden værdi er mere end 10 kHz.
- Klik på Justering af pinhole, og åbn guiden til justering af pinhole. Find pinhole-positionen med det højeste (et top) antal fotoner i både x- og y-aksen.
- Drej korrektionsringen for den objektive linse, så antallet pr. molekyleværdi (CPM) er den højeste.
BEMÆRK: Da tykkelsen af dækglasset i det her anførte kammer er 0,12-0,17 mm, er korrektionsringen på omkring sit minimum eller kun et par omgange fra den, hvor CPM'en er på sit maksimale. - Reducer AOTF-værdien gradvist, så CPM-værdien bliver 2-3 kHz.
- Anskaf autokorrelationsfunktionen (ACF) i Rh6G i 90 s.
- Når målingen er fuldført, skal du klikke på Tilpas for at udføre kurvetilpasningsanalyse.
- Vælg en model til tredimensionel (3D)-spredning med en tredimensionel tilstand.
BEMÆRK: Rh6G er monodisperse og en-komponent diffus med en triplet tilstand. - Indstil starttidspunktet for tilpasningen ved at flytte den røde linje. Klik på Tilpas til alle, og kontroller tilpasningsafvigelsen. Efter at have udført kurvebeslaget skal du sørge for, at diffusionstiden (DT) og strukturparameteren (SP) stort set ligger i intervallet henholdsvis 20-30 μs og 4-8.
- Husk den strukturelle parameterværdi. Brug SP-værdien til kurvetilpasningsanalyse af alle ACF'er, der måles samme dag, under de samme optiske forhold, og brug den samme type glasskarskål eller chambered coverglas, der er indstillet på mikroskopstadiet.
5. FCS-måling i celle lysat
- Forbered celle lysater (se ovenfor).
- Placer lysatet på dækglaskammeret. Placer et låg for at undgå tørring og scenelåget til lysskygge.
- Indstil anskaffelsestilstanden, lasereffekten, måletiden og gentagelserne.
- Klik på Tællehastighed, og juster laserens AOTF-værdi, så CPM-værdien bliver mere end 1 kHz.
- Udfør en forsøgsmåling i 1 min. Kontroller, om den beregnede ACF udviser en positiv amplitude og glat henfald.
- Udfør hovedmålingen i 5 min.
BEMÆRK: Den samlede måletid øges gradvist, indtil ACF'ens form ikke ændres, selvom måletiden øges. - Klik på Tilpas for at udføre kurvetilpasningsanalyse.
- Vælg en model til tokomponent 3D-diffusion med en triplet tilstand. Husk at indtaste SP-værdien og ændre dens indstilling til "Fast" ikke "Ledig", før du klikker på Tilpas alle.
- Eksporter den monterede tabel som en tabulatorsepareret tekstfil.
- Eksporter om nødvendigt posten ACF og antalshastighed som en fanesepareret tekstfil.
6. FCS-måling i levende celler
- Udskift mediet med et nyt før målingen.
- Brug en inkubator til varmestadiet. Sæt cellekulturen på mikroskopscenen.
- Bekræft fokus og position ved hjælp af confocal micrope. Marker målecellen. Zoom ind, og juster cellepositionen. Anskaf fluorescensbilleder af en GFP-udtrykscelle ved hjælp af tilstanden med langsom scanningshastighed.
- Vælg en FCS-måleposition ved hjælp af Position i afsnittet "FCS".
- Vælg mindst ét FCS-målepunkt ved hjælp af et trådkors (figur 1).
- Mål ACF i 1 min.
BEMÆRK: Da fluorescerende proteiner har tendens til at blive fotobleached i levende celler på grund af langsom bevægelse i forhold til opløsningen, bør måletiden være minimal. Det er generelt vanskeligt at opnå ACF i cellen lige så gnidningsløst som opløsningsmålinger, fordi langvarig måling vil føre til fotobleaching af fluorescerende proteiner. - Klik på Tilpas for at udføre kurvetilpasningsanalyse ved hjælp af en model til tokomponents 3D-diffusion med en triplet tilstand.
BEMÆRK: For levende cellemålinger ville en model for tokomponents 3D-diffusion med en triplet tilstand være bedre, fordi det er empirisk vanskeligt at reducere chi-square-værdien med en 3D-diffusionsmodel med en komponent på grund af eksistensen af forskellige mobile komponenter i den levende celle. Men selv ved hjælp af en model til trekomponents 3D-diffusion er diffusionskomponenterne normalt ikke adskilt sammenlignet med at bruge modellen til to komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udførte FCS måling af GFP-TDP25 i celle lysat og SOD1-G85R-GFP i levende celler. I begge tilfælde var en positiv amplitude og glatte ACF'er i stand til at erhverves. Vi har vist, at en del af GFP-TDP25 udtrykt i Neuro2a celler blev genvundet i opløselige fraktion under den angivne betingelse6. I den opløselige del af cellelysatet blev der påvist ekstremt lyse fluorescensmolekyler i fotontællingsrekorden ved hjælp af FCS (Figur 2A, top, pil). Sådanne "pigge (også kaldet burst)" blev ikke observeret i GFP monomerer og monodisperse kemisk fluorescerende farvestofopløsning, hvilket tyder på, at piggene indikerer oligomeriske proteiner9. Kurvetilpasningsanalyse ved hjælp af en model, der antager tokomponents 3D-diffusion med en triplet tilstand, viste, at de hurtige spredende molekyler (DTFast = 186 μs) var ~90%, og de resterende 10% var 2,3 ms (Figur 2A, bund og tabel 2).
Under SOD1-G85R-GFP-målingen i levende celler viste fotontællingsrekorden et gradvist fald, hvilket tyder på, at den er fotobleaching i detektionsvolumen (Figur 2B, top). Selv om fotobleachingens bidrag blev vist i et område på over 1 s i ACF, blev der observeret en positiv amplitude og glat henfald af ACF(figur 2B, bund). Kurvetilpasningsanalyse ved hjælp af en model, der antager tokomponents 3D-diffusion med en triplet tilstand, viste, at de hurtige spredemolekyler (DTFast = 397 μs) var ~93,4%, og de resterende 6,6% var 12,3 ms (Tabel 2). ALS-forbundet mutation, G85R, i SOD1 tillod ikke en dramatisk forskel i diffusionsegenskab sammenlignet med vild type. Proteasom hæmning faldt dog kun diffusionshastigheden i G85R-mutanten af SOD1 i cytoplasmaet7.
Figur 1: Konfokalt fluorescerende billede af Neuro2a-celler, der udtrykker SOD1-G85R-GFP. Konfokalt fluorescerende billede af Neuro2a-celler, der udtrykker SOD1-G85R-GFP. Trådkorset angiver FCS-målepositionen i cytoplasmaet. Bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Typiske FCS-resultater og monterede kurver for autokorrelationsfunktionerne. Nederst: Beregnede autokorrelationsfunktioner (ACF'er; Rå, grå linjer) og monterede ACF kurver ved hjælp af en model for to-komponent tre-dimensionel diffusion med en triplet tilstand (Fit, magenta linjer). G(τ) for Y-aksen angiver amplituden af AAF'er på tidspunktet for X-aksen. Punktlinjer viser passende start- og sluttidspunktspunkter. Mørkeblå pile viser spike med ekstremt lyse proteiner, der passerer gennem detektionsvolumen (dvs. opløselige oligomerer / aggregater). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på materiale/udstyr | Komponenter | Bemærkninger/beskrivelse |
| 0,1 mM Rhodamin 6G-opløsning. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M natriumchlorid (NaCl) | ||
| Lysis buffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× protease inhibitor cocktail | Protease hæmmer cocktail bør blandes lige før cellen lysis. |
| Normalt vækstmedium | DMEM suppleret med 10% FBS og 100 U/mL penicillin G og 100 mg/mL Streptomycin | Lot check for FBS bør være påkrævet. |
| Fosfatbuffers saltvand (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4 |
Tabel 1: Opløsningssammensætninger
| CPM (kHz) | DTHurtig (ms) | Hurtig komponent (%) | DTLangsom (ms) | Langsom komponent (%) | |
| GFP-TDP25 i lysat | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP i levende celle | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabel 2: Typiske monterede værdier for autokorrelationsfunktionerne
Monterede værdier for autokorrelationsfunktionerne er repræsenteret i figur 2 ved hjælp af en model for to-komponent tredimensionel diffusion med en triplet tilstand. Tæller pr. molekyle (CPM), hurtig og langsom diffusionstid (henholdsvis DTFast og DTSlow),og deres komponenter (Hurtig og Langsom komponent) er repræsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hensyn til systemkalibrering før målinger bør der anvendes de samme glasvarer som det, der anvendes til måling af prøven (f.eks. skal glaskammeret med 8 brønde til cellelysat og 35 mm glasbasisretten til levende celler anvendes). På grund af adsorptionen af Rh6G på glasset kan dens effektive koncentration undertiden falde. Hvis det er tilfældet, bør en stærkt koncentreret Rh6G-opløsning som 1 μM kun anvendes til justering af pinhole. Ekstremt høje antal fotonhastigheder skal undgås for at beskytte detektoren (f.eks. mere end 1000 kHz). Desuden er den koncentrerede løsning ikke egnet til erhvervelse af autokorrelationsfunktion (opretholde mindre end 100 kHz). Kalibreringen af pinhole position er vigtig. Hvis det optiske system anvendes hyppigt, er det sjældent, at pinhole forvrænges dramatisk. Derfor er det ofte ikke noget problem at bruge "Fint" i begyndelsen for at finde den rette position. Hvis der ikke findes nogen topplacering af tællehastighederne ved hjælp af "Fin", skal du bruge "Grov" til at flytte pinholet fra den ene ende af bevægelsesområdet til den anden før positionssøgning ved hjælp af "Fint". Hvis amplituden af ACF var flad, skal du kontrollere, om fokus og position er passende.
Efter Rh6G-målingen og dens montering, hvis DT og/eller SP er uden for det angivne område, skal du prøve pinhole- og korrektionsringens justering igen. Når du stadig viser ud af området, anbefaler vi at kontakte producentens support, da det sandsynligvis skyldes mistanke om afhopning af det optiske system. Ved hjælp af den målte DT og SP ud over den kendte diffusionskoefficient rh6G (414 μm2/s)i vand kan den effektive stråle talje beregnes, fordi DT er afhængig af bjælke taljen10. Da SP desuden er forholdet mellem stråle talje og højden af den effektive detektionsvolumen, kan detektionsvolumen beregnes. Volumenberegningen er nødvendig for at bestemme den absolutte koncentration. Mere beskrivelse af princippet og fejlfinding under kalibreringen er også tilgængelig i protokoller som rapporteret tidligere11,12,13.
Nogle pigge blev observeret i FCS måling af GFP-TDP25 i celle lysat (Figur 2A, top). Vi viser, at sådanne pigge blev observeret i FCS måling af aggregerede-tilbøjelige huntingtin herunder udvidet polyglutamin gentagelser mærket med GFP eller gul fluorescerende protein (YFP) (HttQ78 og HttQ143)9; den foreslår således opløselige oligomerer/aggregater af GFP-TDP25 i den opløselige del af cellelysatet. Men en sådan spike befolkning var sjælden; ACF og dens kurvetilpasningsresultat omfatter således muligvis ikke et større bidrag fra sådanne stigninger. En mulig årsag til, at kun en lille mængde aggregater indgår i den opløselige fraktion, er sandsynlig, fordi TDP25 er meget aggregeringsfølsom, og dens aggregater fraktioneres i den uopløselige fraktion som vist ved hjælp af en fraktionering af cellelysatet efterfulgt af vestlig blottingdetektering6. Fænomenerne med tendensen til at komme sig til den uopløselige fraktion af aggregerings-tilbøjeligt protein er ofte blevet observeret6,9. Sådanne opløselige oligomerer/aggregater kan ikke let påvises ved hjælp af konventionelle biokemiske metoder som SDS-PAGE efterfulgt af vestlig blotting; FCS har således en fordel. Men at analysere multikomponenter ved hjælp af konventionelle FCS er svært, fordi det måler den gennemsnitlige befolkning. Mere udviklingsmæssige procedurer kombineret med bayesisk ikke-parameteranalyse ville bestemme multikomponenterne i prøven uden antagelser for komponenterne14.
Diffusionstiden i levende celler var relativt langsom sammenlignet med cellelysatet. Da viskositet i cellen er kendt for at være højere end i opløsninger som PBS og vaskemiddel-holdige buffer15, diffusion tid i levende celler teoretisk bliver 2,5-3 gange længere. På grund af denne langsomme diffusion i levende celler, der sammenligner i opløsning, kan fotobleaching af fluorescerende tags ofte være forårsaget. For at korrigere fotobleaching-effekten på ACF'er er nogle procedurer såsom eksponentiel henfaldsantagelse16 og støjfiltrering ved hjælp af bølgefunktion blevet foreslået17. Selv om sådanne korrektioner menes at være effektive, har det stadig ikke været så enkelt for almindelige brugere, fordi det kræver programmering færdigheder. Desuden bør monteringsområdet i målinger af levende celler bestemmes mere omhyggeligt, således at den monterede kurves chi-square-værdi bliver lille. Som det fremgår af figur 2B,blev det interval, hvor G(τ) var mindre end 1, udelukket fra monteringsområdet. Alternativt kræves der flere lysstofrørsmærker til at analysere langsomt spredende / bevægelige molekyler. GFP er nem at bruge som mærkningsmærke, og dets stabilitet er godt, men det er ofte fotobleached under FCS-målinger. For at overvinde denne photostable ejendom, HaloTag med tetramethylrhodamine (TMR) som en kemisk fluorescerende farvestof har været til rådighed18. Ufuldstændig mærkning fra fluorescerende ligands (f.eks. TMR-ligand) og fanget farvestofpuljer er imidlertid problematiske spørgsmål for specifik mærkning af proteiner af interesse19; Således ville eksogen ekspression af protein-of-interest mærket med fluorescerende proteiner være det første valg for fluorescerende mærkning i levende celler.
Der er mange slags fluorescerende proteiner samt kemiske fluorescerende farvestoffer; Men som vist i denne artikel, monomeric forbedret GFP (meGFP) er en nem at bruge tag for FCS samt andre fluorescens mikroskopi, fordi dens biokemiske og fluorescens egenskaber er velkendte. Derfor er meGFP i vores undersøgelser det første valg og bruges generelt til at mærke de aggregeringsfølsomme proteiner til FCS-målinger6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Disse forfattere har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
A.K. blev støttet af en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), af et tilskud-in-aid fra Nakatani Foundation for Countermeasures mod nye coronavirus infektioner, med et tilskud fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskud-in-aid fra Hoansha Foundation. M. K. blev delvist støttet af en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
