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Biology

फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना

Published: April 25, 2021 doi: 10.3791/62576
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

Summary

हम यहां फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिका ओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन ओलिगोमर और एकत्रीकरण को मापने के लिए एक प्रक्रिया शुरू करते हैं।

Abstract

प्रोटीन एकत्रीकरण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग (एचडी) आदि की एक बानगी है। घुलनशील या फैलाना प्रोटीन ओलिगोमर या समुच्चय का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), जो एक ही अणु संवेदनशीलता के साथ एक कण की प्रसार गति और चमक का पता लगा सकता है, का उपयोग किया गया है। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए उचित प्रक्रिया और जानकारी व्यापक रूप से साझा नहीं किया गया है । यहां, हम सेल लिसेट और लाइव कोशिकाओं में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के प्रसार गुणों के लिए एफसीएस माप की एक मानक प्रक्रिया दिखाते हैं: एएलएस-संबद्ध 25 केडीए कार्बोक्सिल-टार डीएनए/आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन 43 केडीए (टीडीपी 25) और सुपरऑक्साइड डिस्ट्यूट 1 (एसओडी) का टर्मिनल टुकड़ा। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए टीडीपी25 के समुच्चय का एक हिस्सा थोड़ा मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा न्यूरो2ए सेल lysate के घुलनशील अंश में शामिल किया गया था। इसके अलावा, GFP टैग SOD1 ALS से जुड़े उत्परिवर्तन ले जाने के लाइव कोशिकाओं में एक धीमी प्रसार से पता चलता है । तदनुसार, हम यहां एफसीएस का उपयोग करके अपने प्रसार संपत्ति के माध्यम से प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने की प्रक्रिया शुरू करते हैं।

Introduction

एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से जुड़े प्रोटीन एकत्रीकरण, और इतने पर 1 विषाक्त होने के लिए जानाजाता है और कोशिकाओं और अंगों में प्रोटीन होमोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) को परेशान करेगा, जो तब उम्र बढ़ने का कारणबनसकता है। प्रोटीन एकत्रीकरण की मंजूरी एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में अपेक्षित है; हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण गठन को रोकने और प्रोटीन समुच्चय (जैसे, छोटे अणुओं या दवाओं) को नीचा दिखाने वाले रसायन अभी तक स्थापित नहीं किए गए हैं। इसके अलावा, प्रोटीन एकत्रीकरण विषाक्तता को कैसे लागू करता है, मायावी रहता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण से संबंधित अनुसंधान परियोजनाओं को बढ़ावा देने के लिए, प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए उच्च थ्रूपुट प्रक्रियाएं शुरू करना महत्वपूर्ण है। प्रोटीन एकत्रीकरण और एकत्रीकरण-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई की संरचना को पहचानने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है3। हालांकि, एकत्रीकरण का पता लगाना मुश्किल है, खासकर ऐसी शास्त्रीय प्रक्रियाओं का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में।

Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) प्रोटीन एकत्रीकरण और संरचनात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया है। हालांकि, FRET प्रोटीन गतिशीलता (जैसे, प्रसार और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के अल्पाधिकार) का विश्लेषण करने में असमर्थ है3. इसलिए, हम यहां एक सरल प्रोटोकॉल पेश करते हैं ताकि फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) का उपयोग करके समाधान (जैसे, सेल लिसेट) और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाया जा सके, जो एकल अणु संवेदनशीलता4के साथ फ्लोरोसेंट अणुओं की प्रसार संपत्ति और चमक को मापता है। एफसीएस लेजर स्कैन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएसएम) का उपयोग करके एक फोटॉन-काउंटिंग विधि है। फोटॉन आगमन समय के एक अत्यधिक संवेदनशील फोटॉन-डिटेक्टर और ऑटोकोरिएलेशन फ़ंक्शन (एसीएफ) की गणना का उपयोग करके, पता लगाने की मात्रा में फ्लोरोसेंट अणुओं के समय और चमक के माध्यम से गुजरता है। प्रसार आणविक वजन की वृद्धि के साथ धीमा हो जाता है; इस प्रकार, एफसीएस का उपयोग करके इंटरमॉलिकुलर इंटरैक्शन का अनुमान लगाया जा सकता है। इससे भी अधिक शक्तिशाली रूप से, फ्लोरोसेंट अणु की चमक में वृद्धि अणुओं के होमो-ओलिगोमेराइजेशन को इंगित करती है। इसलिए, एफसीएस इस तरह के प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

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Protocol

1. सामग्री और अभिकर् ता

  1. सेल कल्चर(टेबल 1)के लिए पायरोजेनिक फ्री सॉल्यूशंस और मीडियम का इस्तेमाल करें।
  2. अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके जैव रासायनिक प्रयोग के लिए समाधान तैयार करें और DNase/RNase मुक्त के रूप में उपयोग करें ।
  3. बहुत जांच प्रक्रिया के साथ सेल संस्कृति के लिए एक उपयुक्त एफबीएस का चयन करें। चूंकि चयनित एफबीएस बहुत नियमित रूप से बदलता है, इसलिए एफबीएस के लिए सूची और बहुत संख्या का प्रतिनिधित्व यहां नहीं किया जा सकता है।
  4. प्लाज्मिड डीएनए
    1. eGFP मोनोमर अभिव्यक्ति के लिए pmeGFP-N15 तैयार करें; GFP-TDP25 अभिव्यक्ति के लिए pmeGFP-C1-TDP256; SOD1-G85R-GFP अभिव्यक्ति के लिए pmeGFP-N1-SOD1-G85R7; और एक वाहक के रूप मेंपीसीजीजी 8।
      नोट: meGFP एक मोनोमेरिक संस्करण है जिसमें बढ़ाया GFP (eGFP) का A206K उत्परिवर्तन है। टीडीपी25 टीडीपी-43 का एएलएस-एसोसिएटेड सी-टर्मिनल टुकड़ा है। SOD1-G85R SOD1 का एएलएस-संबद्ध उत्परिवर्ती है।
  5. सेल स्ट्रेन
    1. मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा न्यूरो2ए कोशिकाओं का प्रयोग करें।
      नोट: न्यूरो2ए कोशिकाओं में उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता और अत्यधिक एक्सप्रेस एक्सोजेनस प्रोटीन होता है। TDP25 अभिव्यक्ति के लिए, उच्च अभिव्यक्ति क्षमता वाले कोशिका उपभेदों जैसे न्यूरो2ए या HEK293 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। वाघेला कोशिकाओं में, TDP25 कुशलता से व्यक्त करने में सक्षम नहीं था।

2. सेल संस्कृति और ट्रांसफैक्शन

  1. सामान्य विकास माध्यम में न्यूरो2ए कोशिकाओं को अर्ध-विन्यास में उगाने वाले 100 मिमी प्लास्टिक डिश तैयार करें।
    नोट: अर्ध-उदारता तक पहुंचने तक पिछले सीडिंग के बाद लगभग 48-72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना आवश्यक है।
  2. माध्यम निकालें।
  3. सेल-कल्चर डिश में ट्राइपसिन-ईडीटीए समाधान का 0.5 मिलियन मिलियन जोड़ें और उन्हें 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. डिश में सामान्य विकास माध्यम के 9.5 एमएल जोड़ें और अलग कोशिकाओं को निलंबित करें।
  5. मृत कोशिकाओं को दाग देने के लिए ट्राइपैन नीले रंग का उपयोग करना, कोशिका काउंटर या मैन्युअल रूप से उपयोग करने वाली कोशिकाओं की संख्या गिनें। फिर संस्कृति माध्यम (1.0 × 105/एमएल) में कोशिकाओं को पतला करें।
  6. सेल लाइसिस के लिए 35 मिमी प्लास्टिक डिश या लाइव-सेल माप के लिए ग्लास बेस डिश में सेल सस्पेंशन के 2 एमएल जोड़ें।
  7. 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान इनक्यूबेट।
  8. ट्रांसफेक्शन के दिन से 15 मिनट पहले निम्नलिखित तैयारियां शुरू करें।
  9. दो 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में ऑप्टी-एमईएम I के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  10. पहली ट्यूब में, प्लाज्मिड डीएनए (समाधान ए) के 1.0 माइक्रोग्राम मिलाएं। दूसरी ट्यूब में लिपोफेक्टामाइन 2000 (सॉल्यूशन बी) के 2.5 माइक्रोल मिलाएं।
    नोट: ट्रांसफेक्शन दक्षता बनाए रखने के लिए, कुल डीएनए राशि को समान रखें। लाइव कोशिकाओं में एफसीएस माप के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को कम करने के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड डीएनए की अंश राशि कम होनी चाहिए (उदाहरण के लिए, पीएमईजीएफपी-N1-SOD1-G85R और पीसीएजीजीएस मिश्रण के 0.8 माइक्रोग्राम)। इसके अलावा, लिपोफेक्टामाइन 2000 की मात्रा और प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा के बीच एक ही अनुपात रखें।
  11. धीरे-धीरे एक को ट्यूब में जोड़कर घोल ए और बी को मिलाएं, और फिर इसे कमरे के तापमान (समाधान सी) पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. संस्कृति माध्यम में समाधान सी जोड़ें; और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

3. सेल लाइसिस और मीडियम एक्सचेंज

  1. नियमित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें।
  2. डिश में मीडियम निकालें।
  3. माध्यम को धोने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस का 2 एमएल जोड़ें। पीबीएस निकालें।
  4. पिसी हुई बर्फ के ऊपर एक एल्यूमीनियम प्लेट पर पकवान रखें।
    नोट: हम एक रविवार उपकरण की दुकान में एक 1 मिमी मोटी एल्यूमीनियम प्लेट कटौती या प्रयोगशाला उपकरण के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक का उपयोग करें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर लाइसिस बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। पकवान को हल्का हिलाएं ताकि बफर को पकवान के तल पर समान रूप से वितरित किया जा सके।
  6. एक सेल स्क्रैपर का उपयोग कर पकवान परिमार्जन और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में अविस्पित सेल मलबे के साथ lysate ठीक हो।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,400 x ग्राम पर समाधान सेंट्रलाइज करें।
  8. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में सुपरनिटेंट को ठीक करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखें।
    नोट: lysate फ्रीज मत करो।
  9. लाइव सेल माप के लिए, माप से पहले माध्यम को बदलें। फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल अटैचमेंट की जांच करें। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अभिव्यक्ति की पुष्टि करें।

4. फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) अंशांकन

  1. सिस्टम शुरू करें और ऑपरेशन सॉफ्टवेयर चलाएं। आर्गन+ लेजर (458/477/488/514 एनएम) चालू करें । कम से कम 30 मिनट के लिए सिस्टम को स्थिर करें।
  2. ऑप्टिकल पथ की स्थापना: मुख्य बीम स्प्लिटर: एचएफटी488; डिक्रोइक मिरर: NFT600; फ्लोरेसेंस बैरियर फिल्टर: एक बैंडपास फिल्टर 505-540 (BP505-540); डिटेक्टर: हिमस्खलन फोटोडायोड (एपीडी)) ।
  3. सीधे मूल्य (66 माइक्रोन; 1 हवादार इकाई) दर्ज करके पिनहोल आकार सेट करें।
  4. स्टेज पर कवर ग्लास चैंबर के एक कुएं में रोडामाइन 6G (Rh6G) समाधान जोड़ें।
  5. उद्देश्य पर विसर्जन अल्ट्रापुरे पानी डालें। विसर्जन तेल का प्रयोग न करें।
  6. माइक्रोस्कोप स्टेज पर चैंबर सेट करें। मंच को उपयुक्त स्थिति में ले जाएं।
  7. कांच की सतह से बिखरे हुए प्रकाश को मापकर ऊपरी कांच की सतह पर ध्यान दें। उद्देश्य लेंस को नीचे करने के लिए कम करने के बाद, समायोजित करने के लिए ध्यान घुंडी दक्षिणावर्त बारी ।
    नोट: फोकस घुंडी के मोड़ दिशा की जांच करें क्योंकि यह जापान और जर्मनी में बने लोगों के बीच विपरीत है ।
  8. समाधान के अंदर का निरीक्षण करने के लिए ऊपरी कांच की सतह के ऊपर केंद्र बिंदु 200 माइक्रोन उठाएं।
  9. गिनती दर पर क्लिक करें और फोटॉन मायने रखता है दर की निगरानी ।
  10. धीरे-धीरे एसीओज़ो-ऑप्टिक ट्यूनेबल फिल्टर (एओटीएफ) मूल्य (जैसे, उत्तेजना लेजर ट्रांसमिशन) बढ़ाएं ताकि काउंट रेट वैल्यू 10 किलोहर्ट्ज से अधिक हो।
  11. पिनहोल एडजस्टमेंट पर क्लिक करें और पिनहोल एडजस्टमेंट विजार्ड खोलें। दोनों एक्स और वाई-अक्ष में फोटॉनों की उच्चतम (एक चोटी) संख्या के साथ पिनहोल स्थिति का पता लगाएं ।
  12. ऑब्जेक्टिव लेंस के करेक्शन रिंग को चालू करें ताकि प्रति अणु (सीपीएम) मूल्य सबसे अधिक हो।
    नोट: चूंकि यहां निर्दिष्ट कक्ष के कवर ग्लास की मोटाई 0.12-0.17 मिमी है, इसलिए सुधार अंगूठी अपने न्यूनतम या इससे कुछ ही मोड़ पर है, जहां सीपीएम अपने अधिकतम है।
  13. AOTF मूल्य को धीरे-धीरे कम करें ताकि सीपीएम मूल्य 2-3 किलोहर्ट्ज बन जाए।
  14. 90 एस के लिए Rh6G के ऑटोकोरिएलेशन फंक्शन (एसीएफ) का अधिग्रहण करें।
  15. एक बार माप पूरा हो जाने के बाद, वक्र फिटिंग विश्लेषण करने के लिए फिट पर क्लिक करें।
  16. एक कंपोनेंट थ्री-डायमेंशनल (3डी) प्रसार के लिए एक मॉडल का चयन करें जिसमें ट्रिपल राज्य है।
    नोट: Rh6G एकाक्षी और एक घटक एक ट्रिपल राज्य के साथ फैलाना है ।
  17. लाल रेखा को हिलाकर फिटिंग शुरू समय निर्धारित करें। सभी फिट पर क्लिक करें और फिट विचलन की जांच करें। वक्र फिटिंग करने के बाद, सुनिश्चित करें कि प्रसार समय (डीटी) और संरचना पैरामीटर (एसपी) क्रमशः 20-30 माइक्रोन और 4-8 की सीमा में हैं।
  18. संरचनात्मक पैरामीटर मूल्य याद रखें। एक ही ऑप्टिकल स्थितियों के तहत, एक ही दिन मापा सभी ACFs के वक्र फिटिंग विश्लेषण के लिए एसपी मूल्य का उपयोग करें, और कांच के आधार पकवान या माइक्रोस्कोप चरण पर सेट कक्ष कवर ग्लास के एक ही प्रकार का उपयोग कर ।

5. सेल lysate में FCS माप

  1. सेल lysates तैयार (ऊपर देखें) ।
  2. lysate कवर ग्लास चैंबर पर रखें। सुखाने से बचने के लिए ढक्कन रखें और प्रकाश छायांकन के लिए मंच का ढक्कन रखें।
  3. अधिग्रहण की स्थिति, लेजर पावर, माप समय, और पुनरावृत्ति सेट करें।
  4. काउंट रेट पर क्लिक करें और लेजर के AOTF वैल्यू को एडजस्ट करें ताकि सीपीएम वैल्यू 1 kHz से ज्यादा हो जाए ।
  5. 1 मिनट के लिए एक परीक्षण माप प्रदर्शन करें। जांच करें कि गणना एसीएफ एक सकारात्मक आयाम और चिकनी क्षय दिखाता है या नहीं।
  6. 5 मिनट के लिए मुख्य माप प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: माप समय में वृद्धि होने पर भी एसीएफ का आकार न बदलने तक कुल माप समय धीरे-धीरे बढ़ जाता है।
  7. वक्र फिटिंग विश्लेषण करने के लिए फिट क्लिक करें।
  8. ट्रिपल स्टेट के साथ दो-कंपोनेंट 3डी प्रसार के लिए एक मॉडल चुनें। एसपी मूल्य में प्रवेश करना याद रखें और सभी फिट पर क्लिक करने से पहले "फिक्स्ड" नहीं "फ्री" में अपनी सेटिंग बदलें।
  9. फिट टेबल को टैब-डीलिमित टेक्स्ट फाइल के रूप में निर्यात करें।
  10. यदि आवश्यक हो, तो एसीएफ और काउंट रेट रिकॉर्ड को टैब-डीलिमित टेक्स्ट फाइल के रूप में निर्यात करें।

6. लाइव कोशिकाओं में एफसीएस माप

  1. माप से पहले एक ताजा एक के साथ माध्यम की जगह।
  2. हीट स्टेज इनक्यूबेटर का इस्तेमाल करें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर सेल-कल्चर डिश सेट करें।
  3. कॉन्फोकल माइक्रोप का उपयोग करके फोकस और स्थिति की पुष्टि करें। मापक कोशिका का चयन करें। जूम इन और सेल की स्थिति को समायोजित करें। धीमी स्कैनिंग गति मोड का उपयोग करके जीएफपी-एक्सप्रेसिंग सेल की फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करें।
  4. "एफसीएस" अनुभाग में स्थिति का उपयोग करके एफसीएस-मापने की स्थिति का चयन करें।
  5. क्रॉसहेयर(चित्रा 1)का उपयोग करके कम से कम एक एफसीएस माप बिंदु चुनें।
  6. एसीएफ को 1 मिनट के लिए मापें।
    नोट: क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन समाधान की तुलना में धीमी गति के कारण जीवित कोशिकाओं में फोटोब्लेच हो जाते हैं, माप समय न्यूनतम होना चाहिए। आम तौर पर कोशिका में एसीएफ प्राप्त करना समाधान माप के रूप में सुचारू रूप से मुश्किल होता है क्योंकि लंबे समय तक माप करने से फ्लोरोसेंट प्रोटीन की फोटोब्लैचिंग हो जाएगी।
  7. ट्रिपल राज्य के साथ दो घटक 3 डी प्रसार के लिए एक मॉडल का उपयोग करके वक्र फिटिंग विश्लेषण करने के लिए फिट क्लिक करें।
    नोट: लाइव सेल मापन के लिए, ट्रिपल राज्य के साथ दो-घटक 3 डी प्रसार के लिए एक मॉडल बेहतर होगा क्योंकि लाइव सेल में विभिन्न मोबाइल घटकों के अस्तित्व के कारण एक घटक 3 डी प्रसार मॉडल के साथ ची-स्क्वायर मूल्य को कम करना अनुभवजन्य रूप से मुश्किल है। लेकिन यहां तक कि तीन घटक 3 डी प्रसार के लिए एक मॉडल का उपयोग कर, प्रसार घटकों आमतौर पर दो घटकों के लिए मॉडल का उपयोग करने की तुलना में अलग नहीं कर रहे हैं ।

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Representative Results

हमने लाइव सेल में सेल लिसेट और एसओडी1-जी85आर-जीएफपी में जीएफपी-टीडीपी25 का एफसीएस माप किया। दोनों ही मामलों में, एक सकारात्मक आयाम और चिकनी ACFs का अधिग्रहण करने में सक्षम थे । हमने दिखाया है कि न्यूरो2ए कोशिकाओं में व्यक्त जीएफपी-टीडीपी25 का एक हिस्सा संकेतित शर्त6के तहत घुलनशील अंश में बरामद किया गया था । कोशिका के घुलनशील अंश में, एफसीएस(चित्रा 2A,शीर्ष, तीर) का उपयोग करके फोटॉन काउंट रेट रिकॉर्ड में बेहद उज्ज्वल फ्लोरेसेंस अणुओं का पता लगाया गया था। इस तरह के "स्पाइक्स (जिसे फट भी कहा जाता है) " जीएफपी मोनोमर और मोनोडिस्पर्स केमिकल फ्लोरोसेंट डाई समाधान में नहीं देखा गया, यह सुझाव देता है कि स्पाइक्स ओलिगोमेरिक प्रोटीन9का संकेत देते हैं। एक ट्रिपल राज्य के साथ दो घटक 3 डी प्रसार संभालने के मॉडल का उपयोग कर वक्र फिटिंग विश्लेषण से पता चला है कि तेजी से फैलाना अणुओं (डीटीफास्ट = १८६ μs) ~ ९०% थे और शेष 10% २.३ एमएस(चित्रा 2A, नीचे;और तालिका 2)था ।

लाइव कोशिकाओं में SOD1-G85R-GFP माप के दौरान, फोटॉन गिनती दर रिकॉर्ड एक क्रमिक कमी दिखाई, पता लगाने की मात्रा में अपनी फोटोब्लैचिंग का सुझाव(चित्रा 2B,शीर्ष) । यद्यपि फोटोब्लैचिंग का योगदान एसीएफ में 1 एस से अधिक लंबी सीमा में दिखाया गया था, लेकिन एसीएफ का एक सकारात्मक आयाम और चिकनी क्षय देखा गया(चित्रा 2B,नीचे)। एक ट्रिपल राज्य के साथ दो घटक 3 डी प्रसार संभालने के मॉडल का उपयोग कर वक्र फिटिंग विश्लेषण से पता चला है कि तेजी से फैलाना अणुओं (डीटीफास्ट = ३९७ μs) ~ ९३.४% थे और शेष ६.६% १२.३ एमएस(तालिका 2)था । SOD1 में एएलएस से जुड़े उत्परिवर्तन, G85R ने जंगली प्रकार की तुलना में प्रसार संपत्ति में नाटकीय अंतर की अनुमति नहीं दी। हालांकि, प्रोटेसोम अवरोध ने साइटोप्लाज्म 7 में एसओडी1 के जी85आर उत्परिवर्ती में ही प्रसार दर में कमीकी।

Figure 1
चित्रा 1:SOD1-G85R-GFP व्यक्त न्यूरो2ए कोशिकाओं की कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट छवि।  SOD1-G85R-GFP व्यक्त न्यूरो2ए कोशिकाओं की कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट छवि। क्रॉसहेयर साइटोप्लाज्म में एफसीएस माप स्थिति को इंगित करता है। बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:विशिष्ट एफसीएस परिणाम और ऑटोकोरिएलेशन कार्यों के लिए फिट घटता है। (ए और बी)टॉप: एफसीएस माप समय सीमा (ग्रीन लाइन) में रिकॉर्ड किए गए फोटॉन काउंट रेट। नीचे: गणना ऑटोकोरिएलेशन कार्य (एसीएफ; रॉ, ग्रे लाइनें) और फिट एसीएफ घटता एक ट्रिपल राज्य (फिट, मजेंटा लाइनों) के साथ दो घटक तीन आयामी प्रसार के लिए एक मॉडल का उपयोग कर घटता है । वाई-एक्सिस के लिए जी(α) एक्स-एक्सिस के लिए समय पर एसीएफ के आयाम को इंगित करता है। डॉट लाइन्स फिटिंग स्टार्ट और एंड टाइम पॉइंट्स दिखाती हैं । गहरे नीले तीर अत्यंत उज्ज्वल प्रोटीन का पता लगाने की मात्रा (यानी, घुलनशील अल्पाधिकार/समुच्चय) के माध्यम से गुजर के साथ स्पाइक दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सामग्री/उपकरण का नाम घटक टिप्पणियां/विवरण
0.1 mM रोडामाइन 6G समाधान।
1 एम हेप्स-कोह पीएच 7.5
2 एम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल)
लाइसिस बफर 50 m M HEPES-KOH पीएच 7.5, 150 mm NaCl, 1% ट्राइटन एक्स-100, 1× प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल को सेल लाइसिस से ठीक पहले मिलाया जाना चाहिए।
सामान्य विकास माध्यम डीएमईएम 10% एफबीएस और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन जी और 100 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक एफबीएस के लिए लॉट चेक की आवश्यकता होनी चाहिए।
फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) 137 एमएमएम एनएसीएल, 2.7 एमएमएम केसीएल, 10 एमएमएनए 2एचपीओ4, 1.8 एमएम केएच2पीओ4

तालिका 1: समाधान रचनाएं

सीपीएम (kHz) डीटीफास्ट (एमएस) फास्ट कंपोनेंट (%) डीटीस्लो (एमएस) धीमी गति से घटक (%)
जीएफपी-टीडीपी25 में 7.9 186 89.7 2.3 10.3
लाइव सेल में SOD1-G85R-GFP 6.3 397 93.4 12.3 6.6

तालिका 2: ऑटोकोरिएलेशन कार्यों के लिए विशिष्ट फिट मान
ऑटोकोरिएलेशन कार्यों के लिए फिट मानों को चित्र 2 में एक ट्रिपल राज्य के साथ दो घटक तीन आयामी प्रसार के लिए एक मॉडल का उपयोग करके दर्शाया जाता है। प्रति अणु (सीपीएम), तेज और धीमी गति से प्रसार समय (डीटीफास्ट और डीटीस्लो,क्रमशः) मायने रखता है, और उनके घटकों (फास्ट और स्लो घटक) का प्रतिनिधित्व किया जाता है।

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Discussion

माप से पहले सिस्टम अंशांकन के बारे में, नमूना मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान कांच के सामान का उपयोग किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 8-कुएं सेल लिस्लेट के लिए ग्लास चैंबर और जीवित कोशिकाओं के लिए 35-मिमी ग्लास बेस डिश) को कवर करते हैं। ग्लास पर Rh6G के सोखने के कारण, इसकी प्रभावी एकाग्रता कभी-कभी कम हो सकती है। यदि हां, तो 1 माइक्रोन जैसे अत्यधिक केंद्रित Rh6G समाधान का उपयोग सिर्फ पिनहोल समायोजन के लिए किया जाना चाहिए। डिटेक्टर (जैसे, 1000 किलोहर्ट्ज से अधिक) की सुरक्षा के लिए बेहद उच्च फोटॉन गिनती दरों से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, केंद्रित समाधान ऑटोकोरिएलेशन फ़ंक्शन के अधिग्रहण के लिए उपयुक्त नहीं है (100 किलोहर्ट्ज से कम बनाए रखें)। पिनहोल स्थिति का अंशांकन महत्वपूर्ण है। यदि ऑप्टिकल प्रणाली का उपयोग अक्सर किया जाता है, तो पिनहोल के नाटकीय रूप से अव्यवस्था के लिए यह दुर्लभ है; इस प्रकार, शुरुआत में "ठीक" का उपयोग करना अक्सर उचित स्थिति खोजने में कोई समस्या नहीं होती है। यदि "ठीक" का उपयोग करके गिनती दरों की कोई पीक स्थिति नहीं पाई जाती है, तो "ठीक" का उपयोग करके स्थिति-खोज से पहले गति की सीमा के एक छोर से दूसरे में पिनहोल को स्थानांतरित करने के लिए "मोटे" का उपयोग करें। यदि एसीएफ का आयाम सपाट था, तो जांच करें कि ध्यान और स्थिति उपयुक्त है या नहीं।

Rh6G माप और इसकी फिटिंग के बाद, यदि डीटी और/या एसपी संकेत सीमा से बाहर है, तो पिनहोल और सुधार रिंग समायोजन को फिर से आजमाएं। जब अभी भी सीमा से बाहर दिखा, हम निर्माता के समर्थन से संपर्क करने की सलाह देते हैं क्योंकि ऑप्टिकल सिस्टम के संदिग्ध दलबदल के कारण इसकी संभावना है। पानी में Rh6G (414 माइक्रोन2/s) के ज्ञात प्रसार गुणांक के अलावा मापा डीटी और एसपी का उपयोग करना, प्रभावी बीम कमर की गणना की जा सकती है क्योंकि डीटी बीम कमर10पर निर्भर है। इसके अलावा, चूंकि एसपी बीम कमर का अनुपात और प्रभावी डिटेक्शन वॉल्यूम की ऊंचाई है, इसलिए डिटेक्शन वॉल्यूम की गणना की जा सकती है। पूर्ण एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मात्रा गणना की आवश्यकता होती है। अंशांकन के दौरान सिद्धांत और समस्या निवारण का अधिक विवरण प्रोटोकॉल में भी उपलब्ध है जैसा कि पहले11,12,13बताया गया था ।

सेल lysate(चित्रा 2A,शीर्ष) में GFP-TDP25 के एफसीएस माप में कुछ स्पाइक्स देखे गए। हम बताते हैं कि इस तरह के स्पाइक्स को कुल-प्रवण हंटिंगटिन के एफसीएस माप में देखा गया था जिसमें जीएफपी या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) (एचटीक्यू 143)9के साथ लेबल किए गए विस्तारित पॉलीग्लूटामाइन रिपीट्स शामिल हैं; इस प्रकार यह कोशिका के घुलनशील अंश में जीएफपी-टीडीपी25 के घुलनशील ओलिगोमर/एग्रीगेट का सुझाव देता है । लेकिन इस तरह की स्पाइक आबादी दुर्लभ थी; इस प्रकार, एसीएफ और इसके वक्र-फिटिंग परिणाम में ऐसे स्पाइक्स का बड़ा योगदान शामिल नहीं हो सकता है। घुलनशील अंश में केवल थोड़ी मात्रा में कुल-प्राप्त होने का संभावित कारण होने की संभावना है क्योंकि टीडीपी 25 अत्यधिक एकत्रीकरण-प्रवण है और इसके समुच्चय को अघुलनशील अंश में आंशिक किया जाता है जैसा कि कोशिका के एक अंश का उपयोग करके दिखाया गया है 6 पश्चिमी ब्लॉटिंग डिटेक्शन6के बाद। एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के अघुलनशील अंश तक ठीक होने की प्रवृत्ति की घटनाएं अक्सर6,9देखी जाती हैं । इस तरह के घुलनशील ओलिगोमर/समुच्चय को पश्चिमी ब्लॉटिंग के बाद एसडीएस-पेज जैसे पारंपरिक जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग करके आसानी से पता नहीं लगाया जा सकता है; इस प्रकार, एफसीएस का एक फायदा है। हालांकि, पारंपरिक एफसीएस का उपयोग करके बहु-घटकों का विश्लेषण करना मुश्किल है क्योंकि यह औसत जनसंख्या को मापता है। बायसियन नॉनपैरामेट्रिक विश्लेषण के साथ संयुक्त अधिक विकासात्मक प्रक्रियाएं घटकों के लिए बिना किसी मान्यता के नमूने में बहु-घटकों का निर्धारणकरेंगी 14।

कोशिकाओं में प्रसार का समय कोशिका के लिसेट की तुलना में अपेक्षाकृत धीमा था। चूंकि कोशिका में चिपचिपाहट पीबीएस और डिटर्जेंट युक्त बफर15जैसे समाधानों में उससे अधिक होने के लिए जाना जाता है, इसलिए जीवित कोशिकाओं में प्रसार समय सैद्धांतिक रूप से 2.5-3 गुना लंबा हो जाता है। समाधान में तुलना करने वाली जीवित कोशिकाओं में इस धीमी प्रसार के कारण, फ्लोरोसेंट टैग की फोटोब्लेचिंग अक्सर हो सकती है। एसीएफ पर फोटोब्लैचिंग प्रभाव को सही करने के लिए, कुछ प्रक्रियाएं जैसे घातीय क्षय धारणा16 और तरंग समारोह का उपयोग करके शोर फ़िल्टरिंग17प्रस्तावित किए गए हैं। हालांकि इस तरह के सुधार प्रभावी माना जाता है, यह अभी भी सामांय उपयोगकर्ताओं के लिए इतना आसान नहीं किया गया है क्योंकि यह प्रोग्रामिंग कौशल की आवश्यकता है । इसके अलावा, लाइव सेल मापन में, फिटिंग रेंज को अधिक सावधानी से निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि फिट वक्र का ची-स्क्वायर मूल्य छोटा हो जाए। जैसा कि चित्रा 2Bमें दिखाया गया है, जिस सीमा में जी (1) से कम था, उसे फिटिंग रेंज से बाहर रखा गया था। वैकल्पिक रूप से, अधिक फोटोस्टेबल फ्लोरोसेंट टैग धीरे से फैलाना/चलती अणुओं का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं । जीएफपी लेबलिंग टैग के रूप में उपयोग करना आसान है, और इसकी स्थिरता अच्छी तरह से है, लेकिन एफसीएस माप के दौरान अक्सर इसे फोटोब्लैच किया जाता है। इस फोटोस्टेबल संपत्ति को दूर करने के लिए, रासायनिक फ्लोरोसेंट डाई के रूप में टेट्रामेथाइलरोडमाइन (टीएमआर) के साथ हेलोटैग18उपलब्ध है। हालांकि, फ्लोरोसेंट लिगांड (जैसे, टीएमआर-लिगांड) और फंसे डाई पूल द्वारा अधूरी लेबलिंग ब्याज19के प्रोटीन की विशिष्ट लेबलिंग के लिए समस्याग्रस्त मुद्दे हैं; इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए प्रोटीन-ऑफ-इंटरेस्ट की एक्सोजेनस अभिव्यक्ति जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए पहली पसंद होगी।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कई प्रकार हैं, साथ ही रासायनिक फ्लोरोसेंट रंग; हालांकि, जैसा कि इस लेख में दिखाया गया है, मोनोमेरिक एन्हांस्ड जीएफपी (मेगएफपी) एफसीएस के साथ-साथ अन्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक आसान-से-उपयोग टैग है क्योंकि इसके जैव रासायनिक और फ्लोरेसेंस गुण अच्छी तरह से ज्ञात हैं। इसलिए, हमारे अध्ययनों में, मेघएफपी पहली पसंद है और आम तौर पर एफसीएस माप6, 7, 9के लिए एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन को लेबल करने के लिए उपयोग कियाजाताहै।

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Disclosures

इन लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

एके को जापान सोसायटी फॉर प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) (#18K06201) द्वारा नॉवल कोरोनावायरस संक्रमणों के खिलाफ प्रतिकार के लिए नाकातानी फाउंडेशन से अनुदान-सहायता द्वारा, होक्काइडो विश्वविद्यालय कार्यालय से भविष्य के अनुसंधान नेताओं (एल-स्टेशन) के विकास के लिए अनुदान और होनशा फाउंडेशन से अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था । एम के आंशिक रूप से अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक JSPS अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था "बहुमॉलिक्यूलर क्राउडिंग बायोसिस्टम्स के लिए रसायन विज्ञान" (#20H04686), और एक जेएसएसपीएस ग्रांट-इन-एड अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए "जीवित मामलों की सूचना भौतिकी" (#20H05522) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 201-16945
100-mm plastic dishes CORNING 430167
35-mm glass base dish IWAKI 3910-035 For live cell measurement
35-mm plastic dishes Thermo Fisher Scientific 150460
Aluminum plate Bio-Bik AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 Carl Zeiss Objective
Cell scraper Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) Advantech Toyo 25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells IWAKI 5232-008 For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796 basal medium
Fetal bovine serum (FBS) biosera Lot check required
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019
LSM510 META + ConfoCor3 Carl Zeiss FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells ATCC CCL-131 Cell line
Opti-MEM I Thermo Fisher Scientific 31985070
pCAGGS RIKEN RDB08938 Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. 168-23191
pmeGFP-C1-TDP25 Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1 Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8304

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References

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जीव विज्ञान अंक 170
फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना
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Kitamura, A., Fujimoto, A., Kinjo, M. Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (170), e62576, doi:10.3791/62576 (2021).

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