Summary
Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.
Abstract
Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.
Introduction
Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter1 sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte2. Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregation Toxizität ausübt, schwer fassbar. Daher ist es zur Förderung von Forschungsprojekten im Zusammenhang mit der Proteinaggregation wichtig, Verfahren mit hohem Durchsatz einzuführen, um die Proteinaggregation einfach zu erkennen. Der Proteinaggregationsnachweis mit Antikörpern, die die Konformation von Proteinaggregation und aggregationsspezifischem Fluoreszenzfarbstoff erkennen, wurde weit verbreitet3. Es ist jedoch schwierig, die Aggregation zu erkennen, insbesondere in lebenden Zellen mit solchen klassischen Verfahren.
Förster Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Verfahren zur Erkennung von Proteinaggregation und Strukturwandel. FRET ist jedoch nicht in der Lage, die Proteindynamik zu analysieren (z. B. Diffusion und Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen)3. Daher führen wir hier ein einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinaggregation in Lösung (z.B. Zelllysat) und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ein, das die Diffusionseigenschaft und Helligkeit fluoreszierender Moleküle mit einzelmolekularer Empfindlichkeit4misst. FCS ist eine Photonenzählmethode mit einem Laserscan-Konfokalmikroskop (LSM). Mit Hilfe eines hochempfindlichen Photonendetektors und der Berechnung der Autokorrelationsfunktion (ACF) der Photonenankunftszeit wird der Durchlauf von Zeit und Helligkeit der Fluoreszenzmoleküle im Nachweisvolumen gemessen. Die Diffusion verlangsamt sich mit einer Erhöhung des Molekulargewichts; daher kann die intermolekulare Interaktion mit FCS geschätzt werden. Noch stärker ist, dass eine Erhöhung der Helligkeit des fluoreszierenden Moleküls auf eine Homo-Oligomerisierung der Moleküle hindeutet. Daher ist FCS ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine solche Proteinaggregation zu erkennen.
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Protocol
1. Materialien und Reagenzien
- Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).
- Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.
- Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.
- Plasmid-DNA
- Vorbereiten von pmeGFP-N15 für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP256 für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 für SOD1-G85R-GFP-Ausdruck; und pCAGGS8 als Träger.
HINWEIS: meGFP ist eine monomere Variante, die eine A206K-Mutation des verbesserten GFP (eGFP) trägt. TDP25 ist ein ALS-assoziiertes C-Terminal-Fragment von TDP-43. SOD1-G85R ist eine ALS-assoziierte Mutation von SOD1.
- Vorbereiten von pmeGFP-N15 für eGFP-Monomerexpression; pmeGFP-C1-TDP256 für GFP-TDP25-Ausdruck; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 für SOD1-G85R-GFP-Ausdruck; und pCAGGS8 als Träger.
- Zellstamm
- Verwenden Sie das murine Neuroblastom Neuro2a Zellen.
HINWEIS: Neuro2a-Zellen haben eine hohe Transfektionseffizienz und hochexpressige exogene Proteine. Für die TDP25-Expression sind Zellstämme mit hoher Expressionseffizienz erforderlich, z. B. Neuro2a- oder HEK293-Zellen. In HeLa-Zellen konnte TDP25 nicht effizient exprimiert werden.
- Verwenden Sie das murine Neuroblastom Neuro2a Zellen.
2. Zellkultur und Transfektion
- Bereiten Sie eine 100 mm Kunststoffschale, die Neuro2a-Zellen halbkonfluent in normalem Wachstumsmedium anwächst.
HINWEIS: Es ist notwendig, bei 37 °C für ca. 48-72 Stunden nach der vorherigen Aussaat zu inkubieren, bis die Halbkonfluenz erreicht ist. - Entfernen Sie das Medium.
- 0,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellkulturschale geben und bei 37 °C für 1 min inkubieren.
- Fügen Sie 9,5 ml normales Wachstumsmedium in die Schale und hängen die abgetrennten Zellen.
- Mit Trypan blue, um die abgestorbenen Zellen zu färben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler oder manuell. Verdünnen Sie dann die Zellen im Kulturmedium (1,0 × 105/ml).
- Fügen Sie 2 ml Zellsuspension in eine 35 mm Kunststoffschale für die Zelllyse oder eine Glas-Basisschale für die Live-Zell-Messung.
- Inkubieren Sie das Gericht bei 37 °C für 1 Tag.
- Beginnen Sie die folgenden Vorbereitungen 15 Minuten vor dem Tag der Transfektion.
- Bereiten Sie zwei 1,5 ml-Rohre vor und fügen Sie jedem Rohr 100 l Opti-MEM I hinzu.
- Mischen Sie in der ersten Röhre 1,0 g Plasmid-DNA (Lösung A). Mischen Sie in der zweiten Röhre 2,5 l Lipofectamin 2000 (Lösung B).
HINWEIS: Um die Transfektionseffizienz aufrechtzuerhalten, halten Sie die gesamte DNA-Menge gleich. Um den Expressionspegel für die FCS-Messung in lebenden Zellen zu reduzieren, sollte die Bruchmenge der Plasmid-DNA für die Proteinexpression abnehmen (z. B. 0,2 g pmeGFP-N1-SOD1-G85R und 0,8 g pCAGGS-Gemisch). Darüber hinaus halten Sie das gleiche Verhältnis zwischen dem Volumen von Lipofectamin 2000 und der Menge der Plasmid-DNA. - Mischen Sie Lösung A und B vorsichtig, indem Sie eine in eine der beiden Rohre geben, und inkubieren Sie sie dann 1 min bei Raumtemperatur (Lösung C).
- Fügen Sie die Lösung C zum Kulturmedium hinzu; und inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C.
3. Zelllyse & Mittlerer Austausch
- Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop.
- Entfernen Sie das Medium in der Schale.
- Fügen Sie 2 ml PBS bei 25 °C hinzu, um das Medium auszuwaschen. Entfernen Sie die PBS.
- Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf dem zerkleinerten Eis.
HINWEIS: Wir verwenden eine 1 mm dicke Aluminiumplatte, die in einem Sonntagswerkzeuggeschäft geschnitten oder kommerziell erhältlich ist, als Laborausrüstung. - Fügen Sie 200 L Lysepuffer bei 4 °C hinzu. Schütteln Sie die Schale leicht, so dass der Puffer gleichmäßig an der Unterseite der Schale verteilt ist.
- Zerkleinern Sie die Schale mit einem Zellschaber und erholen Sie das Lysat mit ungelöstem Zellabfall in einem neuen 1,5 ml Rohr.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.400 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
- Den Überstand in einem neuen 1,5 ml-Rohr wiederherstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
HINWEIS: Lassen Sie das Lysat nicht einfrieren. - Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Bestätigen Sie die Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.
4. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) Kalibrierung
- Starten Sie das System, und führen Sie die Betriebssoftware aus. Schalten Sie den Argon+ Laser ein (458/477/488/514 nm). Stabilisieren Sie das System mindestens für 30 min.
- Einrichten des optischen Pfads: Hauptstrahlteiler: HFT488; Dichroischer Spiegel: NFT600; Fluoreszenz-Barrierefilter: Bandpassfilter 505-540 (BP505-540); Detektor: Lawinenphotodiode (APD)).
- Stellen Sie die Lochgröße ein, indem Sie den Wert direkt eingeben (66 m; 1 luftige Einheit).
- Fügen Sie die Rhodamine 6G (Rh6G) Lösung in einen Brunnen der Abdeckung Glaskammer auf der Bühne.
- Fügen Sie das Tauch-Ultrareinstwasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Tauchöl nicht.
- Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe. Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position.
- Konzentrieren Sie sich auf die obere Glasoberfläche, indem Sie das Streulicht von der Glasoberfläche messen. Nachdem Sie die Objektivlinse nach unten gesenkt haben, drehen Sie den Fokusknopf im Uhrzeigersinn, um ihn anzupassen.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Drehrichtung des Fokusknopfes, da er sich gegenüber denen aus Japan und Deutschland befindet. - Heben Sie den Brennpunkt 200 m über der oberen Glasoberfläche an, um das Innere der Lösung zu beobachten.
- Klicken Sie auf die Zählrate, und überwachen Sie die Photonenanzahl.
- Schrittweise erhöhen Sie den akusto-optischen Abstimmfilterwert (AOTF) (z.B. Anregungslaserübertragung), so dass der Zählratewert mehr als 10 kHz beträgt.
- Klicken Sie auf die Pinhole-Anpassung und öffnen Sie den Pinhole-Anpassungs-Assistenten. Finden Sie die Lochposition mit der höchsten (Spitzen-) Anzahl von Photonen in der x- und y-Achse.
- Drehen Sie den Korrekturring der Objektivlinse so, dass die Anzahl pro Molekül (CPM) am höchsten ist.
HINWEIS: Da die Dicke des Abdeckglases der hier angegebenen Kammer 0,12-0,17 mm beträgt, ist der Korrekturring um sein Minimum oder nur wenige Umdrehungen von ihm entfernt, wo der CPM sein Maximum hat. - Verringern Sie den AOTF-Wert schrittweise, sodass der CPM-Wert zu 2-3 kHz wird.
- Erwerben Sie die Autokorrelationsfunktion (ACF) von Rh6G für 90 s.
- Sobald die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.
- Wählen Sie ein Modell für eine Komponente dreidimensionale (3D) Diffusion mit einem Triplet-Zustand.
HINWEIS: Der Rh6G ist monodisperse und einkomponentdiffierend mit einem Triplet-Zustand. - Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, und überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie nach der Kurvenanpassung sicher, dass die Diffusionszeit (DT) und der Strukturparameter (SP) ungefähr im Bereich von 20-30 s bzw. 4-8 liegen.
- Denken Sie an den Wert des strukturellen Parameters. Verwenden Sie den SP-Wert für die Kurvenanpassungsanalyse aller ACFs, die am selben Tag unter den gleichen optischen Bedingungen gemessen wurden, und verwenden Sie die gleiche Art von Glasgrundschale oder Kammerabdeckungsglas, das auf der Mikroskopbühne eingestellt ist.
5. FCS-Messung im Zelllysat
- Bereiten Sie die Zelllysate vor (siehe oben).
- Legen Sie das Lysat auf die Abdeckung Glaskammer. Legen Sie einen Deckel, um eine Trocknung zu vermeiden und den Bühnendeckel für die leichte Beschattung.
- Stellen Sie den Erfassungszustand, die Laserleistung, die Messzeit und Wiederholungen ein.
- Klicken Sie auf Count Rate, und passen Sie den AOTF-Wert des Lasers so an, dass der CPM-Wert mehr als 1 kHz wird.
- Führen Sie eine Testmessung für 1 min durch. Prüfen Sie, ob der berechnete ACF eine positive Amplitude und einen glatten Zerfall anzeigt.
- Führen Sie die Hauptmessung für 5 min durch.
HINWEIS: Die Gesamtmesszeit wird schrittweise erhöht, bis sich die Form des ACF nicht ändert, selbst wenn die Messzeit erhöht wird. - Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen.
- Wählen Sie ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Denken Sie daran, den SP-Wert einzugeben und ändern Sie seine Einstellung in "Fixed" nicht "Free", bevor Sie auf Alle anpassen klicken.
- Exportieren Sie die angepasste Tabelle als durch Tabulatoren getrennte Textdatei.
- Exportieren Sie ggf. den ACF- und Count-Rate-Datensatz als textdatei durch Tabs.
6. FCS-Messung in lebenden Zellen
- Ersetzen Sie das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium.
- Verwenden Sie einen Wärmestufen-Inkubator. Stellen Sie die Zellkulturschale auf die Mikroskopbühne.
- Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit der konfokalen Mikrope. Wählen Sie die Messzelle aus. Vergrößern Sie die Zellenposition, und passen Sie sie an. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder einer GFP-exezierenden Zelle im langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.
- Wählen Sie eine FCS-Messposition mit Position im Abschnitt "FCS" aus.
- Wählen Sie mindestens einen FCS-Messpunkt mit einem Fadenkreuz aus (Abbildung 1).
- Messen Sie den ACF für 1 min.
HINWEIS: Da fluoreszierende Proteine aufgrund einer langsamen Bewegung im Vergleich zur Lösung in lebenden Zellen photobleached werden, sollte die Messzeit minimal sein. Es ist in der Regel schwierig, ACF in der Zelle so reibungslos wie Lösungsmessungen zu erhalten, da eine längere Messung zu Photobleichungen von fluoreszierenden Proteinen führt. - Klicken Sie auf Anpassen, um eine Kurvenanpassungsanalyse mit einem Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand durchzuführen.
HINWEIS: Bei Live-Zellmessungen wäre ein Modell für die zweikomponentige 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand besser, da es empirisch schwierig ist, den Chi-Quadratwert mit einem Einkomponenten-3D-Diffusionsmodell zu verringern, da verschiedene mobile Komponenten in der Lebenden Zelle vorhanden sind. Aber auch bei einem Modell für die Dreikomponenten-3D-Diffusion sind die Diffusionskomponenten im Vergleich zur Verwendung des Modells für Zweikomponenten in der Regel nicht getrennt.
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Representative Results
Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung6zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung 2A, oben, Pfeil). Solche "Spikes (auch Burst genannt) wurden bei GFP-Monomeren und monodispersen chemischen Fluoreszenzfarbstofflösungen nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Spitzen auf oligomere Proteinehinweisen 9. Die Kurvenanpassungsanalyse mit einem Modell unter der Annahme einer zweikomponentigen 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand zeigte, dass die schnell diffundierenden Moleküle (DTFast = 186 s) 90 % und die restlichen 10 % 2,3 ms betrugen(Abbildung 2A, unten; und Tabelle 2).
Während der SOD1-G85R-GFP-Messung in lebenden Zellen zeigte der Photonenzählgeschwindigkeitsrekord eine allmähliche Abnahme, was auf eine Photobleiche im Nachweisvolumen hindeutet(Abbildung 2B, oben). Obwohl der Beitrag der Photobleaching in einem Bereich von mehr als 1 s im ACF gezeigt wurde, wurden eine positive Amplitude und ein glatter Zerfall des ACF beobachtet(Abbildung 2B, unten). Die Kurvenanpassungsanalyse mit einem Modell unter der Annahme einer zweikomponentigen 3D-Diffusion mit einem Triplet-Zustand zeigte, dass die schnell diffundierenden Moleküle (DTFast = 397 s) 93,4 % und die restlichen 6,6 % 12,3 ms betrugen (Tabelle 2). Die ALS-verknüpfte Mutation G85R in SOD1 erlaubte keinen dramatischen Unterschied in der Diffusionseigenschaft im Vergleich zum Wildtyp. Die Proteasomenhemmung verringerte jedoch die Diffusionsrate nur in der G85R-Mutation von SOD1 im Zytoplasma7.
Abbildung 1: Konfokales fluoreszierendes Bild von Neuro2a-Zellen, die SOD1-G85R-GFP exdrücken. Konfokales fluoreszierendes Bild von Neuro2a-Zellen, die SOD1-G85R-GFP exdrücken. Das Fadenkreuz zeigt die FCS-Messposition im Zytoplasma an. Bar = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Typische FCS-Ergebnisse und angepasste Kurven für die Autokorrelationsfunktionen. (A und B) Top: Aufgezeichnete Photonenanzahl im FCS-Messzeitbereich (Grüne Linie). Unten: Berechnete Autokorrelationsfunktionen (ACFs; Rohe, graue Linien) und angepasste ACF-Kurven mit einem Modell für zweikomponentige dreidimensionale Diffusion mit Einem Triplet-Zustand (Fit, Magenta-Linien). G()für Y-Achse zeigt die Amplitude von ACFs zum Zeitpunkt s. sec. für X-Achse an. Punktlinien zeigen passende Anfangs- und Endzeitpunktpunkte an. Dunkelblaue Pfeile zeigen die Spitze mit extrem hellen Proteinen, die das Nachweisvolumen durchlaufen (d. h. lösliche Oligomere/Aggregate). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Materials/Der Ausrüstung | Komponenten | Kommentare/Beschreibung |
| 0,1 mM Rhodamine 6G Lösung. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M Natriumchlorid (NaCl) | ||
| Lysis-Puffer | 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1× Protease-Hemmer-Cocktail | Protease-Hemmer-Cocktail sollte kurz vor der Zelllyse gemischt werden. |
| Normales Wachstumsmedium | DMEM ergänzt mit 10% FBS und 100 U/ml Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin | Eine Chargenprüfung für FBS sollte erforderlich sein. |
| Phosphatpuffer-Saline (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
Tabelle 1: Lösungszusammensetzungen
| CPM (kHz) | DTFast (ms) | Schnelle Komponente (%) | DTLangsam (ms) | Langsame Komponente (%) | |
| GFP-TDP25 in Lysat | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| SOD1-G85R-GFP in Derzelle | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tabelle 2: Typische einangepasste Werte für die Autokorrelationsfunktionen
Angepasste Werte für die Autokorrelationsfunktionen werden in Abbildung 2 mit einem Modell für die dreidimensionale Zwei-Komponenten-Diffusion mit einem Triplet-Zustand dargestellt. Zählungen pro Molekül (CPM), schnelle und langsame Diffusionszeit (DTFast bzw. DTSlow)und deren Komponenten (Schnelle und langsame Komponente) werden dargestellt.
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Discussion
In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müssen extrem hohe Photonenanzahlvermieden werden. Darüber hinaus ist die konzentrierte Lösung nicht für die Erfassung der Autokorrelationsfunktion geeignet (aufrechterhaltung weniger als 100 kHz). Die Kalibrierung der Lochposition ist wichtig. Wenn das optische System häufig verwendet wird, ist es selten für dramatische Dislokation des Lochs; Daher ist die Verwendung von "Fine" am Anfang oft kein Problem, die passende Position zu finden. Wenn keine Spitzenposition der Zählraten mit "Fein" gefunden wird, verwenden Sie das "Grob", um das Loch von einem Ende des Bewegungsbereichs an das andere vor der Positionsfindung mit "Fein" zu verschieben. Wenn die Amplitude des ACF flach war, überprüfen Sie, ob der Fokus und die Position angemessen sind.
Versuchen Sie nach der Rh6G-Messung und deren Montage, wenn der DT und/oder SP anicht im angegebenen Bereich liegt, die Pinhole- und Korrekturringeinstellung erneut. Wenn Sie noch a-range zeigen, empfehlen wir, den Support des Herstellers zu kontaktieren, da dies wahrscheinlich auf einen vermuteten Defekt des optischen Systems zurückzuführen ist. Mit dem gemessenen DT und SP kann zusätzlich zum bekannten Diffusionskoeffizienten von Rh6G (414 m2/s) in Wasser die effektive Strahltaille berechnet werden, da DT vom Strahl taille10abhängig ist. Da der SP das Verhältnis von Balkentaille und Höhe des effektiven Erfassungsvolumens ist, kann das Erfassungsvolumen berechnet werden. Die Volumenberechnung ist erforderlich, um die absolute Konzentration zu bestimmen. Weitere Beschreibungen des Prinzips und fehlerbehebung während der Kalibrierung sind auch in Protokollen verfügbar, wie zuvor berichtet11,12,13.
Einige Spitzen wurden bei der FCS-Messung von GFP-TDP25 im Zelllysat beobachtet(Abbildung 2A, oben). Wir zeigen, dass solche Spitzen bei der FCS-Messung von aggregierten Huntingtin einschließlich erweiterter Polyglutamin-Wiederholungen beobachtet wurden, die mit GFP oder gelbem fluoreszierendem Protein (YFP) (HttQ78 und HttQ143)9gekennzeichnet sind; es suggeriert daher lösliche Oligomere/Aggregate von GFP-TDP25 in der löslichen Fraktion des Zelllysats. Aber eine solche Spitze Bevölkerung war selten; Daher dürfen die ACF und ihr kurvenschlüssiges Ergebnis keinen wesentlichen Beitrag solcher Spitzen enthalten. Ein möglicher Grund dafür, dass nur eine geringe Menge an Aggregaten in den löslichen Bruch einbezogen wird, ist wahrscheinlich, da TDP25 sehr aggregationsanfällig ist und seine Aggregate in der unlöslichen Fraktion fraktioniert sind, wie mit einer Fraktionierung des Zelllysats gefolgt von der westlichen Fleckungsdetektion6dargestellt. Die Phänomene der Tendenz, sich zum unlöslichen Anteil des aggregationsanfälligen Proteins zu erholen, wurden oft beobachtet6,9. Solche löslichen Oligomere/Aggregate lassen sich mit herkömmlichen biochemischen Methoden wie SDS-PAGE, gefolgt von Western Blotting, nicht ohne weiteres erkennen; damit hat FCS einen Vorteil. Die Analyse von Multikomponenten mit konventionellem FCS ist jedoch schwierig, da die durchschnittliche Bevölkerung misst. Weitere Entwicklungsverfahren in Kombination mit der nichtparametrischen Bayesschen Analyse würden die Multikomponenten in der Stichprobe ohne Annahmen für die Komponenten14bestimmen.
Die Diffusionszeit in lebenden Zellen war im Vergleich zum Zelllysat relativ langsam. Da die Viskosität in der Zelle bekanntlich höher ist als bei Lösungen wie PBS und waschmittelhaltigem Puffer15, wird die Diffusionszeit in lebenden Zellen theoretisch 2,5-3 mal länger. Aufgrund dieser langsamen Diffusion in lebenden Zellen, die in Lösung verglichen werden, kann oft Photobleichung von fluoreszierenden Tags verursacht werden. Um den Photobleicheffekt auf ACFs zu korrigieren, wurden einige Verfahren wie exponentielle Zerfallsannahme16 und Rauschfilterung mit Wavelet-Funktion vorgeschlagen17. Obwohl solche Korrekturen geglaubt werden, um effektiv zu sein, es war immer noch nicht so einfach für allgemeine Benutzer, weil es Programmierkenntnisse erfordert. Darüber hinaus sollte bei Live-Zellmessungen der Anpassungsbereich sorgfältiger bestimmt werden, damit der Chi-Quadrat-Wert der angepassten Kurve klein wird. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, wurde der Bereich, in dem G(n) kleiner als 1 war, aus dem Anpassungsbereich ausgeschlossen. Alternativ sind mehr fototische Fluoreszenz-Tags erforderlich, um langsam diffundierende/sich bewegende Moleküle zu analysieren. GFP ist einfach als Etikettierungs-Tag zu verwenden, und seine Stabilität ist gut, aber es wird oft während FCS-Messungen photobleached. Um diese fotoierbare Eigenschaft zu überwinden, HaloTag mit Tetramethylrhodinin (TMR) als chemischer Fluoreszenzfarbstoff wurde18verfügbar. Eine unvollständige Kennzeichnung durch die fluoreszierenden Liganden (z. B. TMR-Ligand) und die eingeschlossenen Farbstoffbecken sind jedoch problematische Probleme für die spezifische Kennzeichnung von Proteinen von Interesse19; Daher wäre die exogene Expression von Protein-of-Interest, das mit fluoreszierenden Proteinen markiert ist, die erste Wahl für die fluoreszierende Kennzeichnung in lebenden Zellen.
Es gibt viele Arten von fluoreszierenden Proteinen, sowie chemische fluoreszierende Farbstoffe; Wie in diesem Artikel gezeigt, ist monomerverbessertes GFP (meGFP) jedoch ein einfach zu bedienendes Tag für FCS sowie andere Fluoreszenzmikroskopie, da seine biochemischen und fluoreszenzenden Eigenschaften bekannt sind. Daher ist meGFP in unseren Studien die erste Wahl und wird in der Regel verwendet, um die aggregationsanfälligen Proteine für FCS-Messungen6,7,9zu kennzeichnen.
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Disclosures
Diese Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
A.K. wurde von einer Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), durch ein Stipendium der Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, durch ein Stipendium des Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) und ein Stipendium der Hoansha Foundation unterstützt. M. K. wurde teilweise durch ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) und ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information Physics of living matters" (#20H05522) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
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