Summary
我们在这里介绍了一个程序，以测量蛋白质寡聚物和聚合在细胞溶解和活细胞使用荧光相关性光谱。
Abstract
蛋白质聚集是神经退行性疾病（如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）、帕金森病 （PD）、亨廷顿舞蹈症 （HD） 等的标志。为了检测和分析可溶性或扩散的蛋白质寡聚物或聚合物，已经使用了荧光相关光谱（FCS），它可以检测具有单分子灵敏度的单个粒子的扩散速度和亮度。然而，蛋白质聚合检测的适当程序和专有知识尚未得到广泛推广。在这里，我们展示了FCS测量细胞裂解和活细胞中容易聚集的蛋白质扩散特性的标准程序：TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa（TDP25）和超氧化物分解酶1（SOD1）的ALS相关25 kDa盒式终端片段。代表性结果表明，绿色荧光蛋白（GFP）标签TDP25的聚合部分被稍微包含在穆林神经母细胞神经母细胞核糖核酸的可溶性部分。此外，带有ALS相关突变的GFP标记SD1显示活细胞的扩散速度较慢。因此，我们介绍使用FCS通过其扩散特性检测蛋白质聚合的程序。
Introduction
蛋白质聚集涉及神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS），阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症等1 已知是有毒的，并会扰乱蛋白质平衡（蛋白酶），然后可能导致老化2。蛋白质聚集的清除有望作为一种治疗策略：然而，防止蛋白质聚集形成和降解蛋白质聚合物（如小分子或药物）的化学物质尚未确定。此外，蛋白质聚合如何产生毒性仍然难以捉摸。因此，为了促进与蛋白质聚集相关的研究项目，必须引入高吞吐量程序，以简单地检测蛋白质聚合。蛋白质聚合检测使用抗体识别蛋白质聚合和聚合特异性荧光染料的一致性已被广泛使用3。然而，很难检测聚合，特别是在使用这种经典程序的活细胞中。
弗斯特共振能量转移 （FRET） 是检测蛋白质聚合和结构变化的程序。然而，FRET无法分析蛋白质动力学（例如，活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化）3。因此，我们在这里引入了一个简单的协议，使用荧光相关光谱（FCS）检测溶液（如细胞裂解）和活细胞中的蛋白质聚合，该光谱学测量荧光分子的扩散特性和亮度，具有单分子灵敏度4。FCS 是一种使用激光扫描对焦显微镜 （LSM） 进行光子计数的方法。利用高度灵敏的光子探测器和光子到达时间的自相关函数（ACF）计算，测量检测体积中荧光分子的通过时间和亮度。随着分子量的增加，扩散速度变慢：因此，可以使用 FCS 估计分子间相互作用。更有力的是，荧光分子亮度的增加表明分子的同质化。因此，FCS 是检测此类蛋白质聚合的强大工具。
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Protocol
1. 材料和试剂
- 使用热源性免费解决方案和细胞培养介质 （表 1）。
- 使用超纯水为生化实验准备解决方案，并作为无 DNase/RNase 使用。
- 选择适合细胞培养的 FBS，并具有大量的检查过程。由于所选的 FBS 批次会定期更改，此处无法在此处表示 FBS 的目录和批号。
- 普拉斯米德DNA
- 为电子GFP单体表达准备pmeGFP-N15; pmeGFP-C1-TDP256 表示 GFP-TDP25 表示：pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 表示 SOD1-G85R-GFP 表达：和pCAGGS8 作为载体。
注：meGFP是携带增强GFP（eGFP）A206K突变的单体变种。TDP25 是 TDP-43 的 ALS 相关 C 端片段。SOD1-G85R 是 SOD1 的 ALS 相关突变体。
- 为电子GFP单体表达准备pmeGFP-N15; pmeGFP-C1-TDP256 表示 GFP-TDP25 表示：pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 表示 SOD1-G85R-GFP 表达：和pCAGGS8 作为载体。
- 细胞应变
- 使用穆林神经母细胞神经2a细胞。
注：Neuro2a细胞具有很高的转染效率和高度表达的外源性蛋白质。对于TDP25表达，需要具有高表达效率的细胞菌株，如神经2a或 HEK293细胞。在 HeLa 细胞中，TDP25 无法有效表达。
- 使用穆林神经母细胞神经2a细胞。
2. 细胞培养和转化
- 准备一个100毫米塑料盘生长神经2a细胞半汇合在正常生长介质。
注意：在上一次播种后约 48-72 小时，在 37 °C 下孵育，直到达到半汇流。 - 删除介质。
- 将 0.5 mL 的 trypsin-EDTA 溶液添加到细胞培养盘中，并在 37 °C 下孵育 1 分钟。
- 将 9.5 mL 的正常生长介质添加到菜中，并暂停分离的细胞。
- 使用Trypan蓝色来染色死细胞，使用细胞计数器或手动计算细胞数量。然后稀释培养介质中的细胞（1.0 × 105/mL）。
- 将 2 mL 的细胞悬浮加入 35 mm 塑料盘中，用于细胞裂解或用于活细胞测量的玻璃底盘。
- 在37°C下孵化菜肴1天。
- 在转染前 15 分钟开始以下准备。
- 准备两个 1.5 mL 管，并在每个管中添加 100 μL 的 Opti-MEM I。
- 在第一个管中，混合1.0微克质粒DNA（解决方案A）。在第二个管中，混合2.5微升的脂胺2000（解决方案B）。
注意：为了保持输血效率，保持DNA总量不变。为了降低活细胞中FCS测量的表达水平，蛋白质表达的质粒DNA的分数量应减少（例如，pmeGFP-N1-SOD1-G85R的0.2微克和pCAGGS混合物的0.8微克）。此外，在2000年脂胺量和质粒DNA量之间保持相同的比例。 - 通过在任一管中加入一个，然后在室温（解决方案 C）下孵育 1 分钟，轻轻混合解决方案 A 和 B。
- 将解决方案 C 添加到文化介质中：并在37°C下孵育细胞24小时。
3. 细胞裂解和中等交换
- 使用常规显微镜检查 GFP 表达式。
- 取出盘中的介质。
- 在25°C时添加2 mL的PBS以冲洗介质。删除 PBS。
- 将盘子放在碎冰上的铝板上。
注：我们在周日工具商店使用1毫米厚的铝板切割或市售的铝板作为实验室设备。 - 在 4 °C 时添加 200 μL 的裂解缓冲区。 稍微摇动一下盘子，使缓冲区均匀地分布在盘子的底部。
- 使用细胞刮刀刮盘，并在新的 1.5 mL 管中用未溶解的细胞碎片回收溶解物。
- 在 20，400 x g 下将溶液离心，在 4 °C 下 5 分钟。
- 在新的 1.5 mL 管中恢复超自然，并将其保持在 4 °C 或冰上。
注意：不要冷冻利萨特。 - 对于活细胞测量，请在测量前更换介质。使用相位对比显微镜检查细胞附件。使用荧光显微镜确认表达。
4. 荧光相关性光谱 （FCS） 校准
- 启动系统并运行操作软件。打开 Argon+ 激光 （458/477/488/514 nm）。稳定系统至少30分钟。
- 设置光学路径：主光束分路器：HFT488：迪克罗克镜子：NFT600;荧光屏障过滤器：带状通道过滤器 505-540 （BP505-540）;探测器：雪崩光迪奥德（APD）。
- 通过直接输入值（66 μm;1 通风单元）设置针孔大小。
- 将罗达明 6G （Rh6G） 溶液添加到舞台上盖玻璃室的井中。
- 在目标上加入浸入式超纯水。不要使用浸入式油。
- 将腔室设置在显微镜舞台上。将舞台移动到适当的位置。
- 通过测量玻璃表面的散射光，聚焦在上层玻璃表面。将目标镜头降低到底部后，顺时针转动对焦旋钮进行调整。
注意：检查焦点旋钮的转向方向，因为它与日本和德国制造的旋钮相反。 - 将焦点提升至上层玻璃表面上方 200 μm，以观察溶液内部。
- 单击 计数速率 并监控光人计数速率。
- 逐步增加光电可调滤镜 （AOTF） 值（例如激发激光传输），使计数速率值超过 10 kHz。
- 单击 针孔调整 并打开针孔调整向导。查找 x 轴和 y 轴中光子数量最高的（峰值）针孔位置。
- 转动目标透镜的校正环，使每个分子 （CPM） 值的计数最高。
注意：由于此处指定的腔室盖玻璃的厚度为 0.12-0.17 mm，因此校正环处于最小或离其仅几圈左右，CPM 处于最大值。 - 逐渐降低 AOTF 值，使 CPM 值变为 2-3 kHz。
- 在90年代获得Rh6G的自动关系功能（ACF）。
- 测量完成后，单击 Fit 执行曲线拟合分析。
- 选择具有三元状态的单组件三维 （3D） 扩散模型。
注：Rh6G 是单分散和单组件扩散，具有三胞胎状态。 - 通过移动红线设置合适的启动时间。单击 "适合所有" 并检查拟合偏差。执行曲线拟合后，确保扩散时间 （DT） 和结构参数 （SP） 大致在 20-30 μs 和 4-8 的范围内。
- 记住结构参数值。使用 SP 值对在同一光学条件下在同一光学条件下测量的所有 ACF 进行曲线拟合分析，并使用显微镜舞台上设置的相同类型的玻璃底盘或分庭盖玻璃。
5. 细胞裂解体中的 FCS 测量
- 准备细胞解体（见上文）。
- 将利萨特放在盖玻璃室上。放置盖子以避免干燥和舞台盖的浅色阴影。
- 设置采集条件、激光功率、测量时间和重复。
- 单击 计数速率 并调整激光的 AOTF 值，使 CPM 值超过 1 kHz。
- 进行1分钟的试用测量。检查计算的 ACF 是否显示正振幅和平稳衰变。
- 执行5分钟的主要测量。
注：总测量时间逐渐增加，直到ACF的形状不变，即使测量时间增加。 - 单击 Fit 执行曲线拟合分析。
- 选择具有三元状态的双组件 3D 扩散模型。请记住输入SP值，并在单击"适合所有"之前将其设置更改为"固定"而不是"免费"。
- 导出已安装的表作为标签分界文本文件。
- 如有必要，将 ACF 和计数速率记录导出为选项卡划定的文本文件。
6. 活细胞中的FCS测量
- 在测量前将介质替换为新介质。
- 使用热阶段孵化器。将细胞培养盘设置在显微镜舞台上。
- 使用对焦微电子确认焦点和位置。选择测量单元。放大并调整单元格位置。使用慢速扫描速度模式获取 GFP 表达单元的荧光图像。
- 使用"FCS"部分 中的位置 选择 FCS 测量位置。
- 使用十字线（图 1）选择至少一个 FCS 测量点。
- 测量 ACF 1 分钟。
注意：由于荧光蛋白由于与溶液相比运动缓慢，往往在活细胞中发生光漂白，因此测量时间应最短。通常很难像溶液测量那样顺利地在细胞中获得ACF，因为长时间的测量会导致荧光蛋白的光漂白。 - 单击 Fit 使用具有三胞胎状态的双组件 3D 扩散模型执行曲线拟合分析。
注意：对于活细胞测量，具有三胞胎状态的双组件 3D 扩散模型会更好，因为由于活单元中存在各种移动组件，因此很难通过单组件 3D 扩散模型降低气方值。但是，即使使用三元组件 3D 扩散的模型，与使用两个组件的模型相比，扩散组件通常也不会分离。
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Representative Results
我们在活细胞中对细胞裂解剂中的GFP-TDP25和SOD1-G85R-GFP进行了FCS测量。在这两种情况下，都能够获得正振幅和光滑的ACF。我们已经表明，在神经2a细胞中表达的GFP-TDP25的一部分在指示条件6下的可溶性部分被恢复。在细胞裂解物的可溶性部分，使用FCS（图2A，顶部，箭头）在光子计数速率记录中检测到极亮的荧光分子。在GFP单体和单散射化学荧光染料溶液中未观察到这种"尖峰（也称为爆裂）"，这表明尖峰表示寡糖蛋白9。曲线拟合分析使用模型假设双组件3D扩散与三胞胎状态显示，快速扩散分子（DT快速= 186 μs）是~90%，其余10%是2.3毫秒（图2A，底部;表2）。
在活细胞的SOT1-G85R-GFP测量过程中，光子计数率记录显示逐渐下降，表明其光在检测量（图2B，顶部）。虽然在ACF中，照片出血的贡献显示在超过1的范围内，但观察到ACF的正振幅和平稳衰变（图2B，底部）。使用假设具有三胞胎状态的双组件 3D 扩散模型进行的曲线拟合分析显示，快速扩散分子（DTFast = 397 μs）为 +93.4%，其余 6.6% 为 12.3 毫秒（表 2）。与野生类型相比，SOD1 中的 ALS 相关突变 G85R 不允许扩散特性发生巨大差异。然而，蛋白酶抑制只降低了细胞质7中SD1的G85R突变体的扩散率。
图1：神经2a细胞表达SOD1-G85R-GFP的聚焦荧光图像。 神经2a细胞表达SOD1-G85R-GFP的聚焦荧光图像。十字线表示细胞质中的FCS测量位置。酒吧=10微米。请单击此处查看此图的更大版本。
图2：典型的FCS结果和自动关系功能的安装曲线。 （A 和 B） 顶部： FCS 测量时间范围内记录的光子计数速率 （绿线）。底部：计算自相关功能（ACF：原始、灰色线条）并使用具有三元状态的双组件三维扩散模型（Fit，洋红色线）安装 ACF 曲线。 Y轴的 G（τ）表示 X 轴在时间τ秒内表示 ACF 的振幅。点线显示合适的开始和结束时间点。深蓝色箭头显示尖峰，极亮的蛋白质通过检测体积（即可溶性寡聚合物/聚合物）。 请单击此处查看此图的更大版本。
| 材料/设备名称 | 组件 | 评论/说明 |
| 0.1 m 罗达明 6G 解决方案。 | ||
| 1 米赫佩斯 - 科赫 ph 7.5 | ||
| 2 M 氯化钠（纳克） | ||
| 裂解缓冲区 | 50 米赫佩斯 - KOH pH 7.5， 150 mM 纳克， 1% 特里顿 X-100， 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒 | 蛋白酶抑制剂鸡尾酒应在细胞裂解前混合。 |
| 正常增长介质 | DMEM 补充 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素 G 和 100 毫克/毫升链霉素 | 应要求对FBS进行批次检查。 |
| 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） | 137 毫米纳克， 2.7 米 Kcl， 10 米纳2Hpo4，1.8 米 Kh2PO4 |
表1：解决方案构图
| 下午 （khz） | DT快速 （毫秒） | 快速组件（%） | DT慢 速（毫秒） | 慢组件（%） | |
| 在利萨特的 Gfp - tdp25 | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| 活细胞中的 SOD1-G85R-GFP | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
表2：自动关系功能的典型拟合值
图 2 中使用具有三元状态的双组件三维扩散模型表示自动关系功能的拟合值。表示每个分子 （CPM）、快速和缓慢的扩散时间（分别为 DT快速 和 DT慢）及其组件（快速和慢组件）的计数。
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Discussion
关于测量前的系统校准，应使用与用于测量样品的玻璃器皿相同的玻璃器皿（例如，8 井盖玻璃室用于细胞测定，35 毫米玻璃底盘用于活细胞）。由于 Rh6G 吸附在玻璃上，其有效浓度有时可能会降低。如果是这样，应该只用于针孔调整的高度浓缩 Rh6G 解决方案，如 1 μM。必须避免极高的光子计数率以保护探测器（例如，超过 1000 kHz）。此外，集中解决方案不适用于获取自动关系功能（保持小于 100 kHz）。针孔位置的校准很重要。如果频繁使用光学系统，针孔的戏剧性错位是罕见的：因此，在开始使用"精细"往往没有问题，找到合适的位置。如果未找到使用"精细"的计数速率的峰值位置，则使用"粗"将针孔从运动范围的一端移动到另一端，然后使用"精细"进行位置查找。如果 ACF 的振幅为平缓，请检查焦点和位置是否合适。
在 Rh6G 测量及其安装后，如果 DT 和/或 SP 未达到指示范围，请重新尝试针孔和校正环调整。当仍然显示范围外时，我们建议联系制造商的支持，因为它可能是由于光学系统的疑似缺陷。使用测量的DT和SP，除了已知的Rh6G（414μm2/s）在水中的扩散系数，有效的梁腰可以计算，因为DT取决于梁腰10。此外，由于SP是梁腰的比例和有效检测量的高度，因此可以计算检测体积。需要体积计算才能确定绝对浓度。在校准过程中，还可以在协议中提供更多有关该原理和故障排除的描述，如先前报道的 11、12、13。
在细胞裂解剂中 GFP-TDP25 的 FCS 测量中观察到一些尖峰（图 2A，顶部）。我们表明，在FCS对易聚合亨廷廷素的测量中观察到这样的峰值，包括标有GFP或黄色荧光蛋白（YFP）（HttQ78和HttQ143）9的扩大聚糖胺重复：因此，它建议在细胞溶解剂的可溶性部分中溶性寡聚物/GFP-TDP25的聚合物/ 聚合物。但这种人口激增是罕见的：因此，ACF 及其曲线拟合结果可能不包括此类峰值的重大贡献。之所以在可溶性分数中只包含少量聚合物，可能是因为 TDP25 极易聚合，其聚合物在不溶性分数中分馏，如使用细胞溶解剂的分馏，然后是西方印迹检测6。经常观察到容易聚集的蛋白质的不溶性部分的恢复现象。这种可溶性寡聚物/聚合物不能轻易地使用传统的生化方法（如SDS-PAGE，然后是西方印迹）来检测：因此，FCS具有优势。然而，使用传统的FCS分析多组件是很困难的，因为它测量了平均人口。更多的发育过程结合贝叶斯非参数分析将确定样品中的多组件，而没有任何假设的组件14。
与细胞解体相比，活细胞的扩散时间相对较慢。由于已知细胞中的粘度高于 PBS 和含洗涤剂缓冲器 15等溶液中的粘度，因此从理论上讲，活细胞的扩散时间会延长 2.5-3 倍。由于这种缓慢的扩散在活细胞比较溶液，荧光标签的光漂白往往可以造成。为了纠正对ACF的光漂白作用，提出了一些程序，如指数衰减假设16 和噪声过滤使用波子功能。虽然这种更正被认为是有效的，但对于一般用户来说，它仍然不是那么简单，因为它需要编程技能。此外，在活细胞测量中，应更仔细地确定拟合范围，使安装曲线的奇方值变小。如图 2B所示，G（τ）小于 1 的范围被排除在拟合范围之外。或者，需要更多的可拍照荧光标签来分析缓慢扩散/移动的分子。GFP 易于用作标签标签，其稳定性良好，但在 FCS 测量期间经常发生照片出血。为了克服这种可拍照的特性，以四甲基霍达明（TMR）作为化学荧光染料的光晕塔格已经提供18。然而，荧光配体（如TMR-ligand）和被困染料池的不完全标签是有关蛋白质的具体标签的问题。因此，用荧光蛋白标记的感兴趣蛋白质的外源表达将是活细胞中荧光标签的首选。
有许多种类的荧光蛋白，以及化学荧光染料：然而，如本文所示，单体增强 GFP （meGFP） 是 FCS 和其他荧光显微镜的易于使用的标签，因为它的生化和荧光特性是众所周知的。因此，在我们的研究中，meGFP是第一选择，通常用来标记FCS测量6，7，9的聚合容易蛋白质。
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Disclosures
这些作者没有利益冲突。
Acknowledgments
A.K.得到了日本科学促进会（JSPS）科研补助金（C）（#18K06201）的支持，得到了中田尼预防新型冠状病毒感染对策基金会的资助，得到了北海道大学未来研究领导者发展办公室（L-Station）的资助，以及Hoansha基金会的赠款援助。M. K. 部分得到了 JSPS 创新领域"多分子拥挤生物系统化学"（#20H04686）和 JSPS 创新领域"生物物质信息物理"（#20H05522）科学研究资助部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
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