Summary
ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。
Abstract
タンパク質凝集は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)などの神経変性疾患の特徴である。可溶性または拡散性タンパク質オリゴマーまたは凝集体を検出および分析するために、単一分子感度で単一粒子の拡散速度および明るさを検出できる蛍光相関分光法(FCS)が使用されている。しかし、タンパク質凝集検出のための適切な手順とノウハウは広く共有されていません。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞における凝集しやすいタンパク質の拡散特性に関するFCS測定の標準的な手順を示す:ALS関連25 kDaカルボキシル末端断片のTAR DNA/RNA結合タンパク質43kDa(TDP25)およびスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)を示す。代表的な結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きTDP25の凝集物の一部が、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞溶解物の可溶性画分にわずかに含まれていたことを示している。さらに、ALS関連変異を運ぶGFPタグ付きSOD1は、生細胞における拡散が遅い。そこで、FCSを用いた拡散特性を介してタンパク質凝集を検出する手順を紹介します。
Introduction
筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含むタンパク質凝集は毒性 が知られており、細胞や臓器のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)を乱し、その後老化につながる可能性がある。タンパク質凝集のクリアランスは、治療戦略として期待されています;しかし、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質凝集体(例えば、小分子や薬物)を分解する化学物質はまだ確立されていません。さらに、タンパク質凝集が毒性を発揮する方法は、依然として不可解です。したがって、タンパク質凝集に関する研究プロジェクトを推進するためには、単にタンパク質凝集を検出する高スループット手順を導入することが重要です。タンパク質凝集および凝集特異的蛍光色素の立体構造を認識する抗体を用いたタンパク質凝集検出は広く用いられている3。しかし、このような古典的な手順を用いた生細胞において特に、凝集を検出することは困難である。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質凝集および構造変化を検出する手順である。しかし、FRETはタンパク質のダイナミクス(例えば、生細胞におけるタンパク質の拡散およびオリゴマー化)を分析することができない3。そこで、ここでは、単一分子感度4で蛍光分子の拡散特性と明るさを測定する蛍光相関分光法(FCS)を用いて、溶液中のタンパク質凝集(例えば、細胞溶解物)および生細胞を検出する簡単なプロトコルを紹介する。FCSは、レーザースキャン共焦点顕微鏡(LSM)を用いた光子計法である。高感度光子検出器と光子到着時間の自己相関関数(ACF)の計算を用いて、検出体積中の蛍光分子の通過時間と明るさが測定される。拡散は分子量の増加と共に遅くなる。従って、FCSを用いて分子間相互作用を推定することができる。さらに強力に、蛍光分子の明るさの増加は、分子のホモオリゴマー化を示す。したがって、FCSは、このようなタンパク質凝集を検出するための強力なツールである。
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Protocol
1. 材料・試薬
- 細胞培養用の発熱性フリー溶液および培地を使用する(表1)。
- 超純水を用いた生化学実験用のソリューションを準備し、DNase/RNaseフリーとして使用します。
- ロットチェックプロセスで細胞培養に適したFBSを選択します。選択した FBS ロットは定期的に変更されるため、FBS のカタログとロット番号はここでは表すことができません。
- プラスミドDNA
- eGFP モノマー発現用の pmeGFP-N15を準備します。GFP-TDP25 表現のための pmeGFP-C1-TDP256;SOD1-G85R-GFP 発現のための pmeGFP-N1-SOD1-G85R7;キャリアとしてpCAGGS8。
注:meGFPは、強化されたGFP(eGFP)のA206K突然変異を運ぶ単量体変異体です。TDP25は、TDP-43のALS関連C末端フラグメントである。SOD1-G85Rは、SOD1のALS関連変異体である。
- eGFP モノマー発現用の pmeGFP-N15を準備します。GFP-TDP25 表現のための pmeGFP-C1-TDP256;SOD1-G85R-GFP 発現のための pmeGFP-N1-SOD1-G85R7;キャリアとしてpCAGGS8。
- 細胞株
- マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞を使用してください。
注意:Neuro2a細胞はトランスフェクション効率が高く、外因性タンパク質を高発現しています。TDP25発現の場合、Neuro2aやHEK293細胞などの高い発現効率を有する細胞株が必要である。HeLa細胞では、TDP25は効率的に発現できなかった。
- マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞を使用してください。
2. 細胞培養とトランスフェクション
- Neuro2a細胞を通常の成長培地で半流暢に成長させる100mmプラスチック皿を準備する。
注:半合流に達するまで、前の播種後約48〜72時間、37°Cでインキュベートする必要があります。 - メディアを取り外します。
- 0.5 mLのトリプシン-EDTA溶液を細胞培養皿に加え、37°Cで1分間インキュベートします。
- 通常の成長培地を9.5mLを皿に加え、剥離した細胞を一時停止します。
- Trypan blueを使用して死んだセルを染色し、セルカウンターを使用するか手動でセル数をカウントします。次いで、培養培地中の細胞を希釈する(1.0×10 5/mL)。
- 細胞のリシスのための35のmmのプラスチック皿またはライブ細胞測定のためのガラスベース皿に細胞懸濁液の2 mLを加える。
- 37°Cで1日インキュベートします。
- トランスフェクションの1日の15分前に、次の準備を開始します。
- 2つの1.5 mLチューブを準備し、各チューブにオプティ-MEM Iの100 μLを追加します。
- 最初のチューブに、プラスミドDNA(溶液A)を1.0μg混合します。第2の管に、リポフェクトアミン2000(溶液B)の2.5 μLを混合する。
注:トランスフェクション効率を維持するために、DNAの総量は同じに保ちます。生細胞におけるFCS測定の発現量を減らすには、タンパク質発現に対するプラスミドDNAの割合が減少するはずです(例えば、pmeGFP-N1-SOD1-G85Rの0.2 μgおよびpCAGGS混合物の0.8 μg)。さらに、リポフェクトアミン2000の体積とプラスミドDNAの量との比率を同じに保つ。 - 溶液AとBをいずれかのチューブに加えて穏やかに混合し、室温(溶液C)で1分間インキュベートします。
- ソリューション C を培地に追加します。37°Cで24時間培養した。
3. 細胞のリシスと中程度の交換
- 日常的な顕微鏡を使用してGFP表現を確認します。
- 皿の中の媒体を取り除きます。
- 25°Cで2mLのPBSを加え、培地を洗い流します。PBS を取り出します。
- 砕いた氷の上にアルミニウム板の上に皿を置きます。
注:私たちは、日曜日のツールストアまたは市販の1つの実験室機器としてカット1ミリメートル厚いアルミニウム板を使用しています。 - 4°Cで200μLのリシスバッファーを加えます。 皿の底にバッファーが均等に分配されるように、皿を穏やかに振ります。
- セルスクレーパーを使用して皿を削り、新しい1.5 mLチューブに未溶解細胞の破片で溶解物を回収します。
- 4°Cで5分間20,400 x g で溶液を遠心分離する。
- 新しい1.5 mLチューブに上清を回収し、4°Cまたは氷上に保管してください。
注:ライセートを凍結しないでください。 - ライブセル測定の場合は、測定前に培地を交換してください。位相コントラスト顕微鏡を使用して細胞の取り付けを確認します。蛍光顕微鏡で発現を確認します。
4. 蛍光相関分光法(FCS)キャリブレーション
- システムを起動し、操作ソフトウェアを実行します。アルゴン+ レーザー(458/477/488/514 nm)をオンにします。少なくとも30分間システムを安定させます。
- 光路を設定する:メインビームスプリッター:HFT488;ディクロイックミラー:NFT600;蛍光バリアフィルター:バンドパスフィルタ505-540(BP505-540);検出器:雪崩フォトダイオード(APD)。
- 値を直接入力してピンホールサイズを設定します(66 μm;1風通しのユニット)。
- ローダミン6G(Rh6G)溶液をステージ上のカバーガラスチャンバーの井戸に加えます。
- 目的に浸漬超純水を追加します。浸漬油は使用しないでください。
- 顕微鏡のステージにチャンバーをセットします。ステージを適切な位置に移動します。
- ガラス表面からの散乱光を測定することで、ガラス上面に焦点を当てます。対物レンズを底面に下げた後、フォーカスノブを時計回りに回して調整します。
注意:フォーカスノブの旋回方向は日本とドイツの間で反対なので確認してください。 - 焦点を上げて上ガラス表面の上に200μm上げて、溶液の内部を観察します。
- [カウント] レートをクリックし、フォトン数を監視します。
- 徐々にカウント率値が10 kHz以上になるようにアクースト視チューナブルフィルタ(AOTF)値(例えば、励起レーザー伝送)を増加させます。
- [ピンホール調整]をクリックし、ピンホール調整ウィザードを開きます。x 軸と y 軸の両方で、フォトンの最大数 (ピーク) を持つピンホール位置を見つけます。
- 対物レンズの補正リングを、分子あたりの数(CPM)値が最も高くなるようにします。
注:ここで指定したチャンバのカバーガラスの厚さは0.12-0.17ミリメートルであるため、補正リングは、CPMが最大である、その最小値またはそれからほんの数ターンの周りにあります。 - AOTF 値を徐々に小さくして、CPM 値が 2 ~ 3 kHz になるようにします。
- 90 s の Rh6G の自己相関関数 (ACF) を取得します。
- 計測が完了したら、[ フィット ]をクリックしてカーブフィッティング解析を実行します。
- トリプレット状態の 1 成分 3 次元 (3D) 拡散のモデルを選択します。
注: Rh6G は単分散型であり、1 成分拡散はトリプレット状態です。 - 赤い線を動かしてフィッティング開始時間を設定します。[ すべてフィット] をクリックし、適合偏差を確認します。カーブフィッティングを行った後、拡散時間(DT)と構造パラメータ(SP)がそれぞれ20〜30μsと4-8の範囲であることを確認します。
- 構造パラメータ値を覚えておいてください。同じ日に測定されたすべてのAMFのカーブフィッティング分析に、同じ光学条件下で、顕微鏡ステージにセットされた同じタイプのガラスベースディッシュまたはチャンバーカバーガラスを使用して、SP値を使用します。
5. 細胞のリセートのFCSの測定
- 細胞のライセートを準備します(上記参照)。
- カバーガラスチャンバーにライセートを置きます。乾燥を避けるために蓋をし、薄いシェーディング用のステージふたを置きます。
- 取得条件、レーザーパワー、測定時間、繰り返しを設定します。
- [カウント]をクリックし、レーザーの AOTF 値を調整して、CPM 値が 1 kHz を超える値になるようにします。
- 1分間の試験測定を行います。計算された ACF が正の振幅と滑らかな減衰を示しているかどうかを確認します。
- 5分間の主な測定を行います。
メモ:測定時間が増えてもACFの形状が変わらないまで、合計測定時間は徐々に増加します。 - カーブ フィット解析を実行するには、[フィット]をクリックします。
- トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを選択します。SP値を入力し、設定を「すべて調整」をクリックする前に「Free」ではなく「固定」に変更することを忘れないでください。
- 適合テーブルをタブ区切りテキストファイルとしてエクスポートします。
- 必要に応じて、ACF および Count レート レコードをタブ区切りのテキスト ファイルとしてエクスポートします。
6. 生細胞におけるFCS測定
- 測定前に、新鮮な媒体に交換してください。
- ヒートステージインキュベーターを使用します。顕微鏡ステージに細胞培養皿をセットします。
- 共焦点マイクロペを使用して焦点と位置を確認します。測定セルを選択します。セルの位置を拡大して調整します。低速走査速度モードを使用して、GFP発現セルの蛍光画像を取得します。
- 「FCS」セクションの位置を使用してFCS測定 位置 を選択します。
- 十字線を使用して少なくとも 1 つの FCS 測定ポイントを選択します (図 1)。
- ACFを1分間測定します。
注:蛍光タンパク質は、溶液に比べて動きが遅いため、生細胞で光漂白される傾向があるため、測定時間は最小限に抑える必要があります。長時間の測定は蛍光タンパク質の光化につながるため、一般に、溶液測定と同じくらいスムーズに細胞内のACFを得ることは困難です。 - [ フィット] をクリックして、トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを使用してカーブ フィット解析を実行します。
注: ライブセルの測定では、1成分3D拡散モデルでは、生細胞にさまざまな移動成分が存在するため、カイ二乗値を減少させることが経験的に困難であるため、三重項状態の2成分3D拡散のモデルの方が良いでしょう。しかし、3成分3D拡散のモデルを使用しても、拡散成分は通常、2成分のモデルを使用する場合と比較して分離されません。
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Representative Results
細胞ライセートとSOD1-G85R-GFPのFCS測定を生細胞で行いました。どちらの場合も、正の振幅と滑らかなADFを獲得することができました。Neuro2a細胞で発現したGFP-TDP25の一部が、示された条件6の下で可溶性分率で回収されたことを示した。細胞溶解液の可溶性分率では、FCSを用いた光子カウント率記録において極めて明るい蛍光分子が検出された(図2A、上、矢印)。このような「スパイク(バーストとも呼ばれる)」は、GFPモノマーおよび単分散化学蛍光色素溶液では認められず、スパイクがオリゴマータンパク質9を示していることを示唆している。三重項状態の2成分3D拡散を想定したモデルを用いた曲線フィッティング解析は、高速拡散分子(DTFast = 186 μs)が〜90%、残りの10%が2.3ms(図2A、底部、表 2)であることを示した。
生細胞におけるSOD1-G85R-GFP測定の間、光子カウント率記録は緩やかな減少を示し、検出体積におけるその光の切り落ちを示唆した(図2B、上)。ACFでは1s以上の範囲で光漂白の寄与が示されたが、ACFの正の振幅と滑らかな減衰が認められた(図2B、下)。三重項状態の2成分3D拡散を想定したモデルを用いた曲線フィッティング解析は、高速拡散分子(DTFast = 397 μs)が~93.4%、残りの6.6%が12.3msであることを示した(表2)。ALS結合変異は、G85R、SOD1では、野生型と比較して拡散性に劇的な差を認めなかった。しかしながら、プロテアソーム阻害は、細胞質7におけるSOD1のG85R変異体における拡散率のみ低下した。
図1: SOD1-G85R-GFPを発現するNeuro2a細胞の共焦点蛍光像 SOD1-G85R-GFPを発現するNeuro2a細胞の共焦点蛍光像十字線は、細胞質におけるFCS測定位置を示します。バー = 10 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:自己相関関数の典型的なFCS結果および適合曲線(AおよびB)上:FCS測定時間範囲(グリーンライン)に記録されたフォトン数率。下:計算された自己相関関数(ADF;生の、灰色の線)および三重項状態(フィット、マゼンタ線)を持つ2成分3次元拡散のためのモデルを使用してACF曲線を適合させた。Y軸のG(τ)は、X軸の時間τ秒でのADFの振幅を示します。ドットラインは、フィッティング開始時間と終了時間ポイントを示します。濃い青色の矢印は、検出体積(すなわち、可溶性オリゴマー/凝集体)を通過する非常に明るいタンパク質を有するスパイクを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 材料/機器の名称 | コンポーネント | コメント/説明 |
| 0.1 mMローダミン6G溶液。 | ||
| 1 M ヘペス-コー pH 7.5 | ||
| 2 M 塩化ナトリウム (NaCl) | ||
| リシスバッファー | 50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% トリトン X-100, 1×プロテアーゼ阻害剤カクテル | プロテアーゼ阻害剤カクテルは、細胞の分解の直前に混合する必要があります。 |
| 正常な成長媒体 | DMEMは10%FBSと100 U/mLペニシリンGおよび100 mg /mLストレプトマイシンを補充した | FBS のロットチェックが必要です。 |
| リン酸緩衝塩(PBS) | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4 |
表1:ソリューション構成
| CPM (kHz) | DTファスト (ミリ秒) | 高速コンポーネント (%) | DTスロー (ミリ秒) | 遅いコンポーネント (%) | |
| 糖のGFP-TDP25 | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| 生細胞の SOD1-G85R-GFP | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
表2:自己相関関数の典型的適合値
自己相関関数の適合値は、トリプレット状態の 2 成分 3 次元拡散のモデルを使用して 図 2 に示されています。分子あたりのカウント(CPM)、高速および低速拡散時間(それぞれDTFast とDT低速)、およびそれらの成分(高速および低速成分)が表されます。
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Discussion
測定前のシステム校正に関しては、サンプルを測定するために使用されたものと同じガラス製品を使用する必要があります(例えば、8ウェルは、細胞のライセートのためのガラスチャンバーと生細胞用の35mmガラスベースディッシュをカバーする)。ガラス上のRh6Gの吸着のために、その有効濃度が低下することがあります。その場合は、1 μMのような高濃度のRh6G溶液をピンホール調整のためだけに使用する必要があります。非常に高い光子数率は、検出器を保護するために避ける必要があります(例えば、1000 kHz以上)。また、濃縮溶液は自己相関関数の獲得には適さない(100kHz未満を維持する)。ピンホール位置のキャリブレーションは重要です。光学系が頻繁に使用される場合、ピンホールの劇的な脱臼はまれです。したがって、最初に「ファイン」を使用することは、多くの場合、適切な位置を見つけるのに問題ありません。「ファイン」を使用してカウント率のピーク位置が見つからない場合は、「粗い」を使用して、動きの範囲の一方の端から「ファイン」を使用して位置を見つける前にピンホールを移動します。ACFの振幅が平坦であった場合は、焦点と位置が適切かどうかを確認してください。
Rh6G測定とそのフィッティングの後、DTおよび/またはSPが指定された範囲外の場合は、ピンホールと補正リングの調整を再試行します。まだ範囲外に表示されている場合は、光学系の欠陥の疑いがあるため、メーカーのサポートに連絡することをお勧めします。測定されたDTおよびSPを用いて、水中のRh6G(414μm2/s)の公知の拡散係数に加えて、DTがビームウエスト10に依存するため、有効なビームウエストを計算することができる。また、SPがビームウエストの比と有効検出容積の高さとなるように、検出容積を算出できる。絶対濃度を決定するには、体積の計算が必要です。キャリブレーション中の原理とトラブルシューティングの詳細については、前述のプロトコルで 11 、12、13を参照してください。
細胞のライセートにおけるGFP-TDP25のFCS測定でいくつかのスパイクが観察された(図2A、上)。我々は、GFPまたは黄色蛍光タンパク質(YFP)で標識された拡大されたポリグルタミン反復を含む凝集しやすいハンチンチンのFCS測定においてそのようなスパイクが観察されたことを示す(HttQ78およびHttQ143)。したがって、細胞溶解物の可溶性分率におけるGFP-TDP25の可溶性オリゴマー/凝集体を示唆する。しかし、このようなスパイク人口はまれでした。したがって、ACFおよびその曲線適合結果は、そのようなスパイクの主要な寄与を含まないかもしれない。可溶性分画に含まれる少量の凝集物のみが可能な理由は、TDP25が凝集しやすいためであり、その凝集体は、細胞溶解物の分画を使用して示すように不溶性の分画で分画され、その後にウェスタンブロッティング検出6が続くためである。凝集しやすいタンパク質の不溶性分画に回復する傾向の現象は、しばしば6,9に見られてきた。このような可溶性オリゴマー/凝集体は、SDS-PAGEなどの従来の生化学的方法を使用して、ウェスタンブロッティングを続けて簡単に検出することはできません。したがって、FCSには利点があります。しかし、従来のFCSを用いてマルチコンポーネントを解析することは、平均個体数を測定するため困難である。ベイズノンパラメトリック分析と組み合わせたより多くの開発手順は、成分14について何の仮定もなく、サンプル中のマルチコンポーネントを決定するだろう。
生細胞における拡散時間は、細胞のライセートに比べて比較的遅かった。細胞内の粘度はPBSや洗剤含有緩衝液15などの溶液中の粘度よりも高いことが知られているので、生細胞における拡散時間は理論的には2.5〜3倍長くなる。この溶液中の生細胞の拡散が遅いため、蛍光タグの光の切り落としがしばしば起こる可能性があります。ADFに対する光漂白効果を補正するために、指数減衰仮定16 やウェーブレット関数を用いたノイズフィルタリングなどのいくつかの手順が提案されている。このような修正は効果的であると考えられていますが、プログラミングスキルが必要なため、一般ユーザーにとってはそれほど単純ではありませんでした。また、ライブセル測定では、適合曲線のカイ二乗値が小さくなるように、フィッティング範囲をより慎重に決定する必要があります。 図2Bに示すように、G(τ)が1より小さい範囲は、フィッティング範囲から除外された。あるいは、ゆっくりと拡散/移動する分子を分析するために、より多くのフォト可能な蛍光タグが必要です。GFPはラベルタグとして使いやすく、安定性は良好ですが、FCS測定時にしばしばフォトブリーチされます。このフォトテーブル性を克服するために、化学的蛍光色素としてテトラメチルrhodamine(TMR)を用いたハロタグが18個利用可能になっている。しかし、蛍光リガンドによる不完全な標識(例えば、TMR-リガンド)および閉じ込められた色素プールは、目的のタンパク質の特異的標識化に関して問題となる。したがって、蛍光タンパク質でタグ付けされた関心タンパク質の外因性発現は、生細胞における蛍光標識の第一選択となるであろう。
蛍光タンパク質には化学蛍光色素と同様、多くの種類があります。しかし、この記事に示すように、単量体強化GFP(meGFP)は、その生化学的および蛍光特性がよく知られているため、FCSだけでなく他の蛍光顕微鏡の使いやすいタグです。したがって、我々の研究では、meGFPは最初の選択肢であり、一般的にFCS測定のための凝集しやすいタンパク質をラベル付けするために使用される6、7、9。
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Disclosures
これらの著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
A.K.は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成(C)(#18K06201)の支援を受け、中谷財団の新しいコロナウイルス感染対策助成金、北海道大学未来研究リーダー事務所(Lステーション)からの助成金、ホアンシャ財団からの助成によって支援されました。M.K.は、革新的領域に関する科学研究のためのJSPS助成援助「多分子混雑バイオシステムのための化学」(#20H04686)と、革新的分野に関する科学研究のためのJSPS助成助成「生き物の情報物理学」(#20H05522)によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
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