Summary
Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
Protein toplama, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) vb. Çözünür veya yaygın protein oligomerlerini veya agregalarını tespit etmek ve analiz etmek için, tek bir molekül hassasiyetine sahip tek bir parçacığın difüzyon hızını ve parlaklığını tespit debilen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, protein toplama tespiti için uygun prosedür ve know-how yaygın olarak paylaşılamamıştır. Burada, hücre lysate ve canlı hücrelerde toplama eğilimli proteinlerin difüzyon özellikleri için fcs ölçümünün standart bir prosedürünü gösteriyoruz: TAR DNA/ RNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP25) ve süperoksit dismutaz 1'in (SOD1) ALS ilişkili 25 kDa karboksil terminal parçası. Temsili sonuçlar, yeşil floresan protein (GFP) etiketli TDP25 agregalarının bir kısmının murine nöroblastom Neuro2a hücre lisatının çözünür kısmına biraz dahil edildiğini göstermektedir. Ayrıca, ALS ile ilişkili mutasyon taşıyan GFP etiketli SOD1 canlı hücrelerde daha yavaş bir difüzyon göstermektedir. Buna göre, burada FCS kullanarak difüzyon özelliği aracılığıyla protein toplamayı tespit etmek için prosedürü tanıtıyoruz.
Introduction
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukları içeren proteintoplamalarının toksik olduğu ve hücre ve organlarda protein homeostazını (proteostaz) rahatsız edeceği bilinmektedir, bu da yaşlanmaya yol açabilir2. Protein toplamanın temizlenmesi terapötik bir strateji olarak beklenmiştir; bununla birlikte, protein toplama oluşumunu engelleyen ve protein agregalarını bozan kimyasallar (örneğin, küçük moleküller veya ilaçlar) henüz tespit edilmiştir. Ayrıca, protein toplamanın toksisiteyi nasıl uyguladığı zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, protein toplama ile ilgili araştırma projelerini teşvik etmek için, protein toplamayı basitçe tespit etmek için yüksek verim prosedürlerinin getirilmesi önemlidir. Protein toplama ve toplama spesifik floresan boyanın konformasyonunu tanıyan antikorlar kullanılarak protein toplama tespiti yaygın olarak kullanılmıştır3. Bununla birlikte, özellikle bu tür klasik prosedürleri kullanarak canlı hücrelerde toplamayı tespit etmek zordur.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), protein toplama ve yapısal değişimi tespit etmek için yapılan bir prosedürdür. Bununla birlikte, FRET protein dinamiklerini analiz edemez (örneğin, canlı hücrelerde proteinin difüzyonu ve oligomerizasyonu)3. Bu nedenle, burada, tek molekül hassasiyetine sahip floresan moleküllerin difüzyon özelliğini ve parlaklığını ölçen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanarak çözeltideki (örneğin hücre lisat) ve canlı hücreleri tespit etmek için basit bir protokol sunuyoruz4. FCS, lazer tarama konfokal mikroskobu (LSM) kullanılarak yapılan foton sayma yöntemidir. Son derece hassas bir foton dedektörü ve foton varış süresinin otomatik ilişki işlevinin (ACF) hesaplanması kullanılarak, algılama hacmindeki floresan moleküllerin zaman ve parlaklığından geçiş ölçülür. Difüzyon moleküler ağırlığın artmasıyla yavaşlar; bu nedenle, intermoleküler etkileşim FCS kullanılarak tahmin edilebilir. Daha da güçlü bir şekilde, floresan molekülün parlaklığındaki artış moleküllerin homo-oligomerizasyonunu gösterir. Bu nedenle, FCS bu tür protein toplamayı tespit etmek için güçlü bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malzemeler ve reaktifler
- Hücre kültürü için pirojenik içermeyen çözümler ve ortam kullanın (Tablo 1).
- Ultra saf su kullanarak biyokimyasal deney için çözümler hazırlayın ve DNase/RNase free olarak kullanın.
- Çok denetim işlemine sahip hücre kültürü için uygun bir FBS seçin. Seçilen FBS lotları düzenli olarak değiştiğinden, FBS için katalog ve lot numarası burada temsil edilemez.
- Plazmid DNA
- eGFP monomer ifadesi için pmeGFP-N15'i hazırlayın; GFP-TDP25 ifadesi için pmeGFP-C1-TDP256; SOD1-G85R-GFP ekspresyörü için pmeGFP-N1-SOD1-G85R7; ve taşıyıcı olarak pCAGGS8.
NOT: meGFP, gelişmiş GFP'nin (eGFP) A206K mutasyonunu taşıyan monomerik bir varyanttır. TDP25, TDP-43'ün ALS ile ilişkili bir C-terminal parçası. SOD1-G85R, SOD1'in ALS ile ilişkili bir mutanttır.
- eGFP monomer ifadesi için pmeGFP-N15'i hazırlayın; GFP-TDP25 ifadesi için pmeGFP-C1-TDP256; SOD1-G85R-GFP ekspresyörü için pmeGFP-N1-SOD1-G85R7; ve taşıyıcı olarak pCAGGS8.
- Hücre zorlanması
- Murine nöroblastom Neuro2a hücrelerini kullanın.
NOT: Nöro2a hücreleri yüksek transfeksiyon verimliliğine ve yüksek ekspres eksojen proteinlere sahiptir. TDP25 ekspresyolü için Neuro2a veya HEK293 hücreleri gibi yüksek ekspresyon verimliliğine sahip hücre suşları gereklidir. HeLa hücrelerinde TDP25 verimli bir şekilde ifade edilememektedir.
- Murine nöroblastom Neuro2a hücrelerini kullanın.
2. Hücre kültürü ve transfection
- Normal büyüme ortamında yarı bir araya gelen Neuro2a hücrelerini yetiştiren 100 mm'lik plastik bir tabak hazırlayın.
NOT: Yarı izdiah edilene kadar önceki tohumlamadan sonra yaklaşık 48-72 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatmak gerekir. - Ortamı çıkarın.
- Hücre kültürü kabına 0,5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yemeğe 9,5 mL normal büyüme ortamı ekleyin ve ayrılmış hücreleri askıya alın.
- Ölü hücreleri boyamak için Trypan mavisini kullanma, hücre sayacı kullanarak veya el ile hücre sayısını sayma. Daha sonra hücreleri kültür ortamında seyreltin (1.0 × 105/mL).
- Hücre lizisi için 35 mm'lik plastik bir kabın içine 2 mL hücre süspansiyonu veya canlı hücre ölçümü için bir cam taban kabı ekleyin.
- Yemeği 1 gün boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Transfeksiyon gününden 15 dakika önce aşağıdaki hazırlıklara başlayın.
- İki adet 1,5 mL tüp hazırlayın ve her tüpe 100 μL Opti-MEM I ekleyin.
- İlk tüpte, 1.0 μg plazmid DNA'sını (Çözelti A) karıştırın. İkinci tüpte, 2,5 μL Lipofectamin 2000 'i karıştırın (Çözüm B).
NOT: Transfeksiyon verimliliğini korumak için toplam DNA miktarını aynı tutun. Canlı hücrelerde FCS ölçümü için ifade düzeyini azaltmak için, protein ekspresyörü için plazmid DNA'nın fraksiyon miktarı azalmalıdır (örneğin, 0.2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R ve 0.8 μg pCAGGS karışımı). Ayrıca, Lipofectamine 2000 hacmi ile plazmid DNA miktarı arasında aynı oranı koruyun. - Çözelti A ve B'yi her iki tüpe de ekleyerek hafifçe karıştırın ve ardından oda sıcaklığında (Çözelti C) 1 dakika kuluçkaya yatırın.
- Çözüm C'yi kültür ortamına ekleyin; ve hücreleri 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. Hücre lizisi ve orta değişim
- Rutin bir mikroskop kullanarak GFP ifadesini denetleyin.
- Tabaktaki ortamı çıkarın.
- Ortamı yıkamak için 25 °C'de 2 mL PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın.
- Tabağı ezilmiş buzun üzerine alüminyum bir tabağa yerleştirin.
NOT: Pazar alet mağazasında veya ticari olarak laboratuvar ekipmanı olarak mevcut olan 1 mm kalınlığında alüminyum plaka kullanıyoruz. - 4 °C'de 200 μL lizis tamponu ekleyin. Tabağı hafifçe çalkalayın, böylece tampon yemeğin altına eşit olarak dağıtılır.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak çanağı kazıyın ve 1,5 mL'lik yeni bir tüpte çözülmemiş hücre kalıntıları ile lisatı kurtarın.
- Çözeltiyi 20.400 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatant'ı yeni bir 1,5 mL tüpte kurtarın ve 4 °C'de veya buzda tutun.
NOT: Lisatı dondurmayın. - Canlı hücre ölçümleri için, ölçümden önce ortamı değiştirin. Faz kontrastı mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Floresan mikroskop kullanarak ifadeyi onaylayın.
4. Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kalibrasyonu
- Sistemi başlatın ve işlem yazılımını çalıştırın. Argon+ lazeri açın (458/477/488/514 nm). Sistemi en az 30 dakika sabitleyin.
- Optik yolu ayarlama: Ana ışın ayırıcı: HFT488; Dikroik ayna: NFT600; Floresan bariyer filtresi: bir bandpass filtresi 505-540 (BP505-540); Dedektör: çığ fotodiyot (APD)).
- Değeri doğrudan girerek iğne deliği boyutunu ayarlayın (66 μm; 1 havadar ünite).
- Rhodamine 6G (Rh6G) sokumunun içine sahnedeki kapak cam haznesinin bir kuyusuna ekleyin.
- Hedefe daldırma ultra saf suyunu ekleyin. Daldırma yağını kullanmayın.
- Odayı mikroskop aşamasına getirin. Sahneyi uygun konuma getirin.
- Cam yüzeyinden dağınık ışığı ölçerek üst cam yüzeye odaklanın. Objektif lensi alta indirdikten sonra, ayarlamak için odak düğmesini saat yönünde çevirin.
NOT: Japonya ve Almanya'da yapılanlar arasında zıt olduğundan, odak düğmesinin dönüş yönünü kontrol edin. - Çözeltinin içini gözlemlemek için odak noktasını üst cam yüzeyin 200 μm üzerine kaldırın.
- Sayım oranına tıklayın ve foton sayım oranını izleyin.
- Sayma hızı değerinin 10 kHz'den fazla olması için acousto-optik ayarlanabilir filtrelerin (AOTF) değerini (örneğin, heyecan lazer iletimi) kademeli olarak artırın.
- Pim Deliği Ayarı'nı tıklatın ve iğne deliği ayarlama sihirbazını açın. Hem x hem de y eksenindeki en yüksek (tepe) foton sayısına sahip iğne deliği konumunu bulun.
- Molekül başına sayım (BGBM) değeri en yüksek olacak şekilde objektif lensin düzeltme halkasını çevirin.
NOT: Burada belirtilen haznenin kapak camının kalınlığı 0,12-0,17 mm olduğundan, düzeltme halkası minimum civarındadır veya CPM'nin maksimumda olduğu yerden sadece birkaç tur uzaktadır. - BGBM değerinin 2-3 kHz olması için AOTF değerini kademeli olarak azaltın.
- 90 s için Rh6G'nin otomatik ilişki işlevini (ACF) unun.
- Ölçüm tamamlandıktan sonra, eğri sığdırma analizi yapmak için Sığdır'ı tıklatın.
- Üçüz durumuna sahip tek bileşenli üç boyutlu (3B) difüzyon için bir model seçin.
NOT: Rh6G monodisperse ve üçüz bir duruma sahip tek bileşenli dağınıktır. - Kırmızı çizgiyi hareket ettirerek montaj başlangıç saatini ayarlayın. Tüme Sığdır'ı tıklatın ve sığdırma sapması denetleyin. Eğri montajını gerçekleştirdikten sonra, difüzyon süresinin (DT) ve yapı parametresinin (SP) kabaca sırasıyla 20-30 μs ve 4-8 aralığında olduğundan emin olun.
- Yapısal parametre değerini unutmayın. Aynı gün, aynı optik koşullar altında ölçülen tüm AFL'lerin eğri uydurma analizi ve mikroskop aşamasında aynı tip cam taban kabı veya odalı kapak camı seti için SP değerini kullanın.
5. Hücre lisatında FCS ölçümü
- Hücre lysates hazırlamak (yukarıya bakın).
- Listi kapak cam odasına yerleştirin. Kurumasını önlemek için bir kapak ve hafif gölgelendirme için sahne kapağı yerleştirin.
- Alım durumunu, lazer gücünü, ölçüm süresini ve tekrarları ayarlayın.
- Sayma hızı'nı tıklatın ve lazerin AOTF değerini CPM değerinin 1 kHz'den fazla olması için ayarlayın.
- 1 dakika boyunca deneme ölçümü gerçekleştirin. Hesaplanan ACF'nin pozitif genlik ve pürüzsüz bir çürüme gösterip göstermediğini kontrol edin.
- Ana ölçümü 5 dakika boyunca gerçekleştirin.
NOT: Ölçüm süresi artırılsa bile ACF'nin şekli değişmeyene kadar toplam ölçüm süresi kademeli olarak artırilir. - Eğri sığdırma çözümlemesi gerçekleştirmek için Sığdır'ı tıklatın.
- Üçüz durumuna sahip iki bileşenli 3B difüzyon için bir model seçin. Sp değerini girmeyi ve tümünü sığdır'ı tıklatmadan önce ayarını "Boş" değil "Sabit" olarak değiştirmeyi unutmayın.
- Takılan tabloyu sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktar.
- Gerekirse, ACF ve Count rate kaydını sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak verin.
6. Canlı hücrelerde FCS ölçümü
- Ölçümden önce ortamı yenisiyle değiştirin.
- Isı aşaması inkübatörü kullanın. Mikroskop sahnesinde hücre kültürü çanasını ayarlayın.
- Konfokal mikrop kullanarak odağı ve konumu onaylayın. Ölçüm hücresini seçin. Yakınlaştırın ve hücre konumunu ayarlayın. Yavaş tarama hızı modunu kullanarak GFP ifade eden bir hücrenin floresan görüntülerini alın.
- "FCS" bölümündeki Konum'u kullanarak bir FCS ölçüm pozisyonu seçin.
- Bir çapraz çizgi kullanarak en az bir FCS ölçüm noktası seçin (Şekil 1).
- ACF'ye 1 dakika ölçün.
NOT: Floresan proteinler çözeltiye göre yavaş hareket nedeniyle canlı hücrelerde fotobleachlanma eğiliminde olduğundan, ölçüm süresi minimum olmalıdır. Hücrede çözelti ölçümleri kadar sorunsuz bir şekilde ACF elde etmek genellikle zordur, çünkü uzun süreli ölçüm floresan proteinlerin fotobleachingine yol açacaktır. - Üçüz durumdaki iki bileşenli 3B difüzyon için bir model kullanarak eğri sığdırma analizi gerçekleştirmek için Sığdır'ı tıklatın.
NOT: Canlı hücre ölçümleri için, üçüz durumdaki iki bileşenli 3D difüzyon için bir model daha iyi olacaktır, çünkü canlı hücrede çeşitli mobil bileşenlerin varlığı nedeniyle tek bileşenli bir 3D difüzyon modeliyle ki-kare değerini azaltmak ampirik olarak zordur. Ancak, üç bileşenli 3D difüzyon için bir model kullanılsa bile, difüzyon bileşenleri genellikle modeli iki bileşenli için kullanmaya kıyasla ayrılmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı hücrelerde hücre lisat ve SOD1-G85R-GFP'de GFP-TDP25 FCS ölçümü yaptık. Her iki durumda da pozitif genlik ve pürüzsüz ACL'ler elde edilebildi. Neuro2a hücrelerinde ifade edilen GFP-TDP25'in bir kısmının çözünür fraksiyonda belirtilen durum altında kurtarıldığini gösterdik6. Hücre lisatının çözünür fraksiyonunda, FCS(Şekil 2A, üst, ok) kullanılarak foton sayım oranı kaydında son derece parlak floresan molekülleri tespit edildi. Bu tür "sivri uçlar (patlama olarak da adlandırılır)" GFP monomerlerinde ve monodisperz kimyasal floresan boya çözeltisinde gözlenmedi, bu da sivri uçların oligomerik proteinleri gösterdiğini düşündürdü9. Üçüz durumdaki iki bileşenli 3D difüzyon varsayarak bir model kullanarak eğri montaj analizi, hızlı difüzyon moleküllerinin (DTFast = 186 μs) ~% 90 ve kalan% 10'un 2.3 ms (Şekil 2A, alt; ve Tablo 2)olduğunu gösterdi.
Canlı hücrelerde SOD1-G85R-GFP ölçümü sırasında, foton sayım oranı kaydı kademeli bir düşüş gösterdi ve algılama hacmindeki fotobleachingini düşündürdü(Şekil 2B, üst). Fotobleaching katkısı ACF'de 1 s'den daha uzun bir aralıkta gösterilmesine rağmen, ACF'nin pozitif genliği ve pürüzsüz bir çürümesi gözlenmiştir(Şekil 2B, alt). Üçüz durumdaki iki bileşenli 3D difüzyon varsayarak bir model kullanarak eğri montaj analizi, hızlı difüzyon moleküllerinin (DTFast = 397 μs) ~% 93.4 ve kalan% 6.6'nın 12.3 ms olduğunu gösterdi (Tablo 2). SOD1'deki ALS bağlantılı mutasyon G85R, difüzyon özelliğinde vahşi tipe kıyasla dramatik bir farka izin vermedi. Bununla birlikte, proteazom inhibisyonu difüzyon oranını sadece sitoplazma7'dekiSOD1'in G85R mutantında azalttı.
Şekil 1: NEURO2a hücrelerinin SOD1-G85R-GFP'yi ifade eden konfokal floresan görüntüsü. SOD1-G85R-GFP'yi ifade eden Neuro2a hücrelerinin konfokal floresan görüntüsü. Çapraz çizgi sitoplazmdaki FCS ölçüm konumunu gösterir. Çubuk = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tipik FCS sonuçları ve otomatik ilişki işlevleri için takılmış eğriler. (A ve B) Üst: FCS ölçüm zaman aralığında (Yeşil çizgi) kaydedilen foton sayısı oranı. Alt: Hesaplanan otomatik ilişki işlevleri (AFE'ler; Ham, gri çizgiler) ve üç katlı (Sığdır, macenta çizgileri) iki bileşenli üç boyutlu difüzyon için bir model kullanarak acf eğrileri monte. Y ekseni için G(δ), X ekseni için AF'lerin genliğini gösterir. Nokta çizgileri uygun başlangıç ve bitiş zaman noktalarını gösterir. Koyu mavi oklar, algılama hacminden geçen son derece parlak proteinlerle (yani çözünür oligomerler/ agregalar) sivriliği gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Malzeme/Ekipman Adı | Bileşen | Açıklamalar/Açıklama |
| 0.1 mM Rhodamine 6G çözümü. | ||
| 1 M HEPES-KOH pH 7,5 | ||
| 2 M Sodyum klorür (NaCl) | ||
| Lizis arabelleği | 50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, %1 Triton X-100, 1× proteaz inhibitörü kokteyli | Proteaz inhibitörü kokteyli hücre lizizden hemen önce karıştırılmalıdır. |
| Normal büyüme ortamı | %10 FBS ve 100 U/mL penisilin G ve 100 mg/mL Streptomistin ile desteklenmiş DMEM | FBS için lot kontrolü yapılmalıdır. |
| Fosfat tampon salin (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4 |
Tablo 1: Çözelti kompozisyonları
| BGBM (kHz) | DTHızlı (ms) | Hızlı bileşen (%) | DTYavaş (ms) | Yavaş bileşen (%) | |
| Lisatta GFP-TDP25 | 7.9 | 186 | 89.7 | 2.3 | 10.3 |
| Canlı hücrede SOD1-G85R-GFP | 6.3 | 397 | 93.4 | 12.3 | 6.6 |
Tablo 2: Otomatik ilişki işlevleri için tipik takılmış değerler
Otomatik ilişki işlevleri için takılan değerler Şekil 2'de üçüz durumdaki iki bileşenli üç boyutlu difüzyon için bir model kullanılarak temsil edilir. Molekül başına sayımlar (CPM), hızlı ve yavaş difüzyon süresi (sırasıyla DTHızlı ve DTYavaş)ve bileşenleri (Hızlı ve Yavaş bileşen) temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ölçümlerden önce sistem kalibrasyonu ile ilgili olarak, numuneyi ölçmek için kullanılanla aynı cam eşyalar kullanılmalıdır (örneğin, hücre lisat için 8 kuyulu kapak cam odası ve canlı hücreler için 35 mm cam taban kabı). Camdaki Rh6G adsorpsiyonu nedeniyle, etkili konsantrasyonu bazen azalabilir. Öyleyse, sadece iğne deliği ayarı için 1 μM gibi yüksek konsantre bir Rh6G çözeltisi kullanılmalıdır. Dedektörü korumak için son derece yüksek foton sayısı oranlarından kaçınılmalıdır (örneğin, 1000 kHz'den fazla). Ayrıca, konsantre çözüm otomatik ilişki işlevinin alınması için uygun değildir (100 kHz'den az koruyun). İğne deliği pozisyonunun kalibrasyonu önemlidir. Optik sistem sık kullanılıyorsa, iğne deliğinin dramatik bir şekilde yerinden çıkması nadirdir; bu nedenle, başlangıçta "İyi" kullanmak genellikle uygun pozisyonu bulmak için sorun değildir. "İnce" kullanarak sayım oranlarının en yüksek konumu bulunamazsa, iğne deliğini hareket aralığının bir ucundan diğerine taşımak için "İnce" kullanarak pozisyon bulmadan önce "Kaba"yı kullanın. ACF'nin genliği düzse, odağın ve konumun uygun olup olmadığını kontrol edin.
Rh6G ölçümü ve takılması sonrasında, DT ve/veya SP belirtilen aralığın dışındaysa, iğne deliği ve düzeltme halkası ayarını yeniden deneyin. Hala aralık dışında gösterirken, optik sistemin arızalandığından şüphelenilmesinden dolayı üreticinin desteğine başvurmanızı öneririz. Sudaki bilinen Rh6G (414 μm2/s) difüzyon katsayısına ek olarak ölçülen DT ve SP kullanılarak, DT kiriş beline bağlı olduğu için etkili ışın belihesaplanabilir 10. Ayrıca, SP kiriş bel oranı ve etkili algılama hacminin yüksekliği olduğu için algılama hacmi hesaplanabilir. Mutlak konsantrasyonu belirlemek için hacim hesaplaması gereklidir. Kalibrasyon sırasında prensibin ve sorun gidermenin daha fazla açıklaması, daha önce bildirilen protokollerde de mevcuttur11,12,13.
Hücre lisatında GFP-TDP25 FCS ölçümünde bazı ani artışlar gözlenmiştir(Şekil 2A, üst). GFP veya sarı floresan protein (YFP) (HttQ78 ve HttQ143)9ile etiketlenmiş genişletilmiş poliglutamin tekrarları da dahil olmak üzere agregaya eğilimli huntingtin FCS ölçümünde bu tür sivri uçların gözlendiğini gösteriyoruz; bu nedenle hücre lisatının çözünür fraksiyonunda çözünür oligomerler / GFP-TDP25 agregaları önerir. Ancak böyle bir ani nüfus nadirdi; bu nedenle, ACF ve eğri uydurma sonucu bu tür ani artışların büyük bir katkısını içermeyebilir. Çözünür kesirde sadece az miktarda agreganın yer alma olasılığı yüksektir, çünkü TDP25 yüksek toplama eğilimlidir ve agregaları, hücre lisatının bir kesirlenmesi ve ardından batı şişkinlikalgılaması 6kullanılarak gösterildiği gibi çözünmeyen fraksiyonda kesirlenir. Toplama eğilimli proteinin çözünmeyen kısmına geri kazanma eğiliminin fenomeni sıklıkla gözlenmiştir6,9. Bu tür çözünür oligomerler / agregalar, SDS-PAGE ve ardından batı şişkinliği gibi geleneksel biyokimyasal yöntemler kullanılarak kolayca tespit edilemez; bu nedenle, FCS bir avantaja sahiptir. Bununla birlikte, geleneksel FCS kullanarak çok bileşenlileri analiz etmek zordur, çünkü ortalama popülasyonu ölçmektedir. Bayes nonparametrik analizi ile birlikte daha fazla gelişimsel prosedür, bileşenler için herhangi bir varsayımda bulunmadan numunedeki çok bileşenli bileşenleri belirleyecektir14.
Canlı hücrelerde difüzyon süresi hücre lisatlarına göre nispeten yavaştı. Hücredeki viskozitenin PBS ve deterjan içeren tampon15gibi çözeltilerde olduğundan, canlı hücrelerdeki difüzyon süresi teorik olarak 2,5-3 kat daha uzun olur. Çözeltide karşılaştıran canlı hücrelerdeki bu yavaş difüzyon nedeniyle, floresan etiketlerin fotobleachingine sıklıkla neden olabilir. ACL'ler üzerindeki fotobleaching etkisini düzeltmek için, üstel bozunma varsayımı16 ve dalgacık işlevini kullanarak gürültü filtreleme gibi bazı prosedürler önerilmiştir17. Bu tür düzeltmelerin etkili olduğuna inanılsa da, programlama becerileri gerektirdiğinden genel kullanıcılar için hala bu kadar basit olmamıştır. Ayrıca, canlı hücre ölçümlerinde, montaj aralığı daha dikkatli belirlenmelidir, böylece takılan eğrinin ki-kare değeri küçülür. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, G(φ) öğesinin 1'den küçük olduğu aralık bağlantı aralığının dışında tutulmuştır. Alternatif olarak, yavaşça yayılan /hareket eden molekülleri analiz etmek için daha fazla fotostable floresan etiketi gerekir. GFP'nin etiketleme etiketi olarak kullanımı kolaydır ve kararlılığı iyi, ancak FCS ölçümleri sırasında genellikle fotobleached. Bu fotoğraflanabilir özelliğin üstesinden gelmek için, kimyasal floresan boya olarak tetrametilrhodamin (TMR) ile HaloTag18. Bununla birlikte, floresan ligandlar (örneğin, TMR-ligand) ve sıkışmış boya havuzları tarafından eksik etiketleme, ilgi çekici proteinlerin belirli etiketlemesi için sorunlu konulardır19; bu nedenle, floresan proteinlerle etiketlenmiş ilgi çekici proteinin eksojen ifadesi, canlı hücrelerde floresan etiketleme için ilk tercih olacaktır.
Kimyasal floresan boyaların yanı sıra birçok floresan protein türü vardır; Bununla birlikte, bu makalede gösterildiği gibi, monomerik geliştirilmiş GFP (meGFP), FCS ve diğer floresan mikroskopisi için kullanımı kolay bir etikettir, çünkü biyokimyasal ve floresan özellikleri iyi bilinmektedir. Bu nedenle, çalışmalarımızda, meGFP ilk tercihtir ve genellikle FCS ölçümleri için toplama eğilimli proteinleri etiketlemek için kullanılır6,7,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
A.K., Japonya Bilim Geliştirme Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) (#18K06201), Nakatani Yeni Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Önlemler Vakfı'ndan hibe, Hokkaido Üniversitesi Gelecekteki Araştırma Liderlerini Geliştirme Ofisi 'nden (L-Station) hibe ve Hoansha Vakfı'ndan bir hibe yardımı ile desteklendi. M. K., "Multimoleküler Kalabalık Biyosistemleri için Kimya" (#20H04686) yenilikçi alanlar üzerine bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid ve "Yaşamsal konuların bilgi fiziği" (#20H05522) üzerinde Bilimsel Araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
References
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
