Этот протокол иммунофлуоресцентной маркировки как белков растительных вирусов, так и белков-векторов насекомых в иссеченных кишках насекомых может быть использован для изучения взаимодействий между вирусными и насекомыми-переносчиками, функций белков насекомых и молекулярных механизмов, лежащих в основе передачи вируса.
Большинство вирусов растений в природе передаются от одного растения к другому полужесткокрылыми насекомыми. Высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, которые очень эффективны при передаче вируса, играет ключевую роль в вирусных эпидемиях на полях. Изучение взаимодействия вирусов и насекомых-переносчиков может способствовать нашему пониманию передачи вирусов и эпидемий с целью разработки новых стратегий борьбы с вирусами растений и их насекомыми-переносчиками. Иммунофлуоресцентная маркировка широко используется для анализа взаимодействия между патогенами и хозяевами и используется здесь у белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera), который эффективно передает южный вирус черного карлика риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), чтобы найти вирионы и белки насекомых в эпителиальных клетках средней кишки. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изучены морфологические характеристики эпителиальных клеток средней кишки, клеточная локализация белков насекомых, колокализация вирионов и белка насекомого. Этот протокол может быть использован для изучения активности вирусов у насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком.
Большинство описанных вирусов растений передаются насекомыми из отряда Hemiptera, который включает тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов 1,2. Колюще-сосущий ротовой аппарат полужесткокрылых насекомых прокалывает растительную ткань для питания и выделения слюны, одновременно эффективно передавая вирус2. Описаны различные механизмы передачи вирусов растений насекомыми-переносчиками. К ним относятся нестойкие, полуперсистирующие и персистирующие. Персистирующий тип является либо неразмножающимся, либо размножающимся3,4, но для обоих этих типов передаваемый вирус должен перемещаться по всему телу насекомого. При персистирующе-размножении вирусы сначала заражают и размножаются в эпителиальных клетках кишечника насекомого, затем распространяются в различные ткани и, в конечном итоге, в слюнные железы, откуда затем могут быть введены в растение через слюну во время кормления насекомого 5,6. Персистирующие передаваемые вирусы перемещаются через разные органы и размножаются в своих насекомых-переносчиках, что требует специфических взаимодействий между компонентами вируса и вектора на разных стадиях 7,8.
Вирусные белки и белки насекомых должны взаимодействовать, чтобы облегчить критические процессы распознавания, заражения, репликации или распространения вирусов у насекомых-переносчиков 9,10. Хотя оптическая микроскопия может быть использована для наблюдения клеточных структур у насекомых, она не может показать распределение вирионов, клеточную локализацию или колокализацию вирусных белков и белка насекомых или ультраструктуру тканей и клеток насекомых. Иммунофлюоресцентное мечение было впервые выполнено Coons et al. в фагоцитарных клетках мыши посредством мечения специфических флуоресцеиновых антител, а теперь оно широко используется11. Метод иммунофлуоресценции, также известный как метод флуоресцентных антител, является одним из самых ранних разработанных методов иммунологической маркировки и основан на специфической реакции связывания между антигеном и антителом11,12. Известное антитело сначала мечают флуоресцеином, который используется в качестве зонда для обнаружения соответствующих антигенов в клетках или тканях13,14. После того, как меченное флуоресцеином антитело связывается с соответствующим антигеном в клетках или тканях, зонд будет излучать яркую флуоресценцию при облучении длинами волн возбуждения и просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа для локализации антигена15.
Большинство насекомых-переносчиков вирусов растений являются полужесткокрылыми. Более высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, обладающих высокой эффективностью передачи вируса растений, может привести к вирусным эпидемиям5. Южный вирус черного карликового риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), один из самых серьезных патогенов риса, быстро распространился по районам выращивания риса в Восточной и Юго-Восточной Азии и вызвал серьезные потери урожая с 2010 года16,17. Взрослые особи и нимфы белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) передают SRBSDV рису стойким способом размножения с высокой эффективностью. Полевые исследования показали, что вспышки SRBSDV-индуцированной болезни карликов риса с черными полосами обычно совпадают с массовой миграцией WBPH на большие расстояния, что является решающим фактором эпидемий SRBSDV 7,8,18. Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) представляет собой растворимый рецептор белка прикрепления N-этилмалеимида, чувствительного к фактору присоединения (SNARE), который может опосредовать транспорт веществ посредством слияния везикул. VAMP7 взаимодействует с внешним основным капсидным белком SRBSDV in vitro, что указывает на то, что VAMP7 может быть тесно связан с передачей вируса16.
В протоколе, представленном здесь, мы исключили кишечник из вирулиферного WBPH в качестве примера для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках средней кишки16. Эпителий средней кишки, как начальное место инвазии вируса, играет жизненно важную роль в заражении, репликации и передаче вируса. Во-первых, мы подробно описали шаги по удалению кишечника у нимф и взрослых особей WBPH. Во-вторых, мы использовали специфические антитела, меченные флуоресцеином, для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках кишечника. Затем мы наблюдали эпителиальные клетки и клеточное расположение вирионов и VAMP7 с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Результаты показали, что вирионы SRBSDV и VAMP7 могут колокализоваться в цитоплазме эпителиальных клеток средней кишки, предполагая, что специфическая функция VAMP7 может быть связана с распространением вирионов из эпителиальных клеток средней кишки.
Для достижения наилучших результатов следует учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо высокое соотношение вирулентных насекомых от общей численности населения. Несмотря на то, что минимальный AAP для SRBSDV нимфами и взрослыми особями WBPH составляет 5 мин17,…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31630058 по X.W. и 31772134 по W.L.).
3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |