Este protocolo para el etiquetado inmunofluorescente de proteínas de virus vegetales y proteínas de insectos vectores en intestinos de insectos extirpados se puede utilizar para estudiar las interacciones entre virus e insectos vectores, las funciones de las proteínas de insectos y los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del virus.
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Artículo de método
Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros
En este artículo
Resumen
Resumen
La mayoría de los virus vegetales en la naturaleza se transmiten de una planta a otra por insectos hemípteros. Una alta densidad de población de insectos vectores que son altamente eficientes en la transmisión de virus juega un papel clave en las epidemias de virus en los campos. El estudio de las interacciones entre vectores virus-insectos puede avanzar en nuestra comprensión de la transmisión de virus y las epidemias con el objetivo de diseñar nuevas estrategias para controlar los virus de las plantas y sus insectos vectores. El etiquetado de inmunofluorescencia se ha utilizado ampliamente para analizar las interacciones entre patógenos y huéspedes y se usa aquí en el saltamontes de lomo blanco (WBPH, Sogatella furcifera), que transmite eficientemente el virus enano rayado negro del arroz del sur (SRBSDV, género Fijivirus, familia Reoviridae), para localizar los viriones y las proteínas de insectos en las células epiteliales del intestino medio. Usando microscopía confocal de barrido láser, estudiamos las características morfológicas de las células epiteliales del intestino medio, la localización celular de proteínas de insectos y la colocalización de viriones y una proteína de insecto. Este protocolo se puede utilizar para estudiar las actividades virales en insectos, las funciones de las proteínas de los insectos y las interacciones entre el virus y el insecto vector.
Introducción
La mayoría de los virus vegetales descritos son transmitidos por insectos del orden Hemíptera que incluye pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips 1,2. Las piezas bucales perforadoras y chupadoras de los insectos hemípteros perforan el tejido vegetal para alimentar y secretar saliva, transmitiendo el virus de manera concomitantemente eficiente2. Se han descrito diferentes mecanismos de transmisión de virus vegetales por insectos vectores. Estos incluyen no persistente, semipersistente y persistente. El tipo persistente es no propagativo o propagativo3,....
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Protocolo
1. Cría de insectos no virulíferos
- Recolectar WBPH de los campos de arroz y criar con plántulas de arroz en vasos de vidrio de 1 L cubiertos con una red a prueba de insectos en una incubadora a 28 °C con 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Debido a que el SRBSDV no se transmite a través de los huevos, las ninfas recién nacidas no son viruliferas.
- Con un bolígrafo, cepille suavemente los insectos de los insectos que crían vasos de precipitados en un nuevo vaso de precipitados de plántulas de arroz fresco cada semana hasta que las ninfas WBPH hayan eclosionado. Continúe criando estas ninfas no virúferas eclosionadas a 2 o 3 estrellas.
NOTA: Cepíllese ....
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Resultados
La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: cría de insectos, adquisición de virus, escisión del intestino, etiquetado inmunofluorescente y realización del portaobjetos.
Las tripas de WBPH extirpadas de adultos se fijaron en paraformaldehído al 4% (m/v), se permeabilizaron con Triton X-100 al 2% (v/v) y luego se incubaron con Dylight 633 faloidina10,18. La micrografía confocal de escaneo láser e.......
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Discusión
Para obtener los mejores resultados, se deben considerar algunos puntos clave. En primer lugar, es necesaria una alta proporción de insectos virulíferos entre la población total. Aunque el AAP mínimo para SRBSDV por ninfas y adultos de WBPH es de 5 min17, se debe permitir que los insectos se alimenten de plantas de arroz frescas infectadas con SRBSDV durante 2 d para lograr una eficiencia de adquisición de hasta el 80%. Dado que los viriones SRBSDV se pueden detectar en el 80% de los intestinos me.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630058 a X.W. y 31772134 a W.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3% Albúmina sérica de toro (BSA) | Coolaber | SL1331 | Anticuerpos diluidos |
| Cubreobjetos | Solarbio | YA0771-18*18mm | Para la fabricación de portaobjetos |
| Microscopio de disección | Beitja | XTL-7045B1 | Para la disección de insectos |
| Microscopio confocal de barrido láser | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observar señal de fluorescencia |
| Portaobjetos de microscopio | Solarbio | ZBP-7105 | Para la fabricación de portaobjetos |
| Medio de montaje con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Abcam | AB104139 | Etiqueta celda necleus |
| Paraformaldehído | Sigma | 158127 | Para la fijación de tejidos |
| Faloidina | Invitrogen | A22284 | Etiqueta actina de epithilos del intestino medio |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | Para permeabilidad de tejidos |
| Pinzas (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | Para disección de insectos |
Referencias
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2....
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Reimpresiones y permisos
