Summary
Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.
Abstract
La maggior parte dei virus vegetali in natura sono trasmessi da una pianta all'altra dagli insetti emitteri. Un'alta densità di popolazione di insetti vettori che sono altamente efficienti nella trasmissione del virus gioca un ruolo chiave nelle epidemie di virus nei campi. Lo studio delle interazioni virus-insetto vettore può far progredire la nostra comprensione della trasmissione del virus e delle epidemie con l'obiettivo di progettare nuove strategie per controllare i virus delle piante e i loro insetti vettori. La marcatura con immunofluorescenza è stata ampiamente utilizzata per analizzare le interazioni tra patogeni e ospiti ed è utilizzata qui nella cicalina dal dorso bianco (WBPH, Sogatella furcifera), che trasmette in modo efficiente il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), per localizzare i virioni e le proteine degli insetti nelle cellule epiteliali dell'intestino medio. Utilizzando la microscopia confocale a scansione laser, abbiamo studiato le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali dell'intestino medio, la localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e la colocalizzazione dei virioni e di una proteina dell'insetto. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le attività dei virus negli insetti, le funzioni delle proteine degli insetti e le interazioni tra virus e insetto vettore.
Introduction
I virus vegetali più descritti sono trasmessi dagli insetti dall'ordine Hemiptera che include afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi 1,2. L'apparato boccale penetrante-succhiatore degli insetti emitteri perfora il tessuto vegetale per nutrire e secernere la saliva, trasmettendo contemporaneamente in modo efficiente il virus2. Sono stati descritti diversi meccanismi di trasmissione dei virus vegetali da parte di insetti vettori. Questi includono non persistente, semipersistente e persistente. Il tipo persistente è non propagante o propagante3,4, ma per entrambi questi tipi, il virus trasmesso deve muoversi in tutto il corpo dell'insetto. Nella modalità persistente-propagativa, i virus inizialmente infettano e si replicano nelle cellule epiteliali dell'intestino dell'insetto, quindi si diffondono in diversi tessuti e infine nelle ghiandole salivari, da dove possono quindi essere introdotti in una pianta attraverso la saliva durante l'alimentazione degli insetti 5,6. I virus trasmessi persistenti si muovono attraverso diversi organi e si replicano nei loro insetti vettori, il che richiede interazioni specifiche tra virus e componenti vettoriali in diversi stadi 7,8.
Le proteine virali e le proteine degli insetti devono interagire per facilitare i processi critici per il riconoscimento, l'infezione, la replicazione o la diffusione del virus negli insetti vettori 9,10. Sebbene la microscopia ottica possa essere utilizzata per osservare le strutture cellulari negli insetti, non può mostrare la distribuzione dei virioni, la localizzazione cellulare o la colocalizzazione delle proteine virali e delle proteine degli insetti o l'ultrastruttura dei tessuti e delle cellule degli insetti. La marcatura con immunofluorescenza è stata eseguita per la prima volta da Coons et al. nelle cellule fagocitiche del topo mediante marcatura di anticorpi specifici contro la fluoresceina, e ora è ampiamente utilizzata11. La tecnica di immunofluorescenza, nota anche come tecnica degli anticorpi di fluorescenza, è una delle prime tecniche di marcatura immunologica sviluppate e si basa sulla specifica reazione di legame tra l'antigene e l'anticorpo11,12. L'anticorpo noto viene prima marcato con fluoresceina, che viene utilizzata come sonda per rilevare gli antigeni corrispondenti nelle cellule o nei tessuti13,14. Dopo che l'anticorpo marcato con fluoresceina si lega all'antigene corrispondente nelle cellule o nei tessuti, la sonda emetterà fluorescenza brillante quando irradiata con lunghezze d'onda di eccitazione e osservata con un microscopio a fluorescenza per localizzare l'antigene15.
La maggior parte degli insetti vettori dei virus vegetali sono emitteri. Una maggiore densità di popolazione di insetti vettori che hanno un'elevata efficienza di trasmissione del virus vegetale può portare a epidemie di virus5. Il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), uno dei patogeni più gravi del riso, si è rapidamente diffuso in tutte le aree di coltivazione del riso nell'Asia orientale e sudorientale e ha causato gravi perdite di resa dal 201016,17. Gli adulti e le ninfe della cavalletta dorsobianco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) trasmettono SRBSDV al riso in modo persistente-propagativo con alta efficienza. Studi sul campo hanno dimostrato che i focolai di malattia nana striata nera indotta da SRBSDV di solito coincidono con la migrazione di massa a lunga distanza di WBPHs, un fattore cruciale nelle epidemie di SRBSDV 7,8,18. La proteina di membrana 7 associata alla vescicola (VAMP7) è un recettore solubile della proteina di attaccamento del fattore N-etilmaleimmide sensibile (SNARE), che può mediare il trasporto di sostanze attraverso la fusione delle vescicole. VAMP7 interagisce con la proteina capside maggiore esterna di SRBSDV in vitro, il che indica che VAMP7 potrebbe essere strettamente associato alla trasmissione del virus16.
Nel protocollo qui presentato, abbiamo asportato l'intestino da WBPH virulifero come esempio per etichettare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali dell'intestino medio16. Come sito di invasione iniziale del virus, l'epitelio dell'intestino medio svolge ruoli vitali nell'infezione, nella replicazione e nella trasmissione del virus. In primo luogo, abbiamo dettagliato i passaggi per asportare l'intestino da ninfe e adulti di WBPHs. In secondo luogo, abbiamo utilizzato anticorpi specifici marcati con fluoresceina per marcare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali intestinali. Poi abbiamo osservato le cellule epiteliali e la posizione cellulare dei virioni e VAMP7 tramite un microscopio confocale a scansione laser. I risultati hanno mostrato che i virioni SRBSDV e VAMP7 potrebbero colocalizzarsi nel citoplasma delle cellule epiteliali dell'intestino medio, suggerendo che la funzione specifica di VAMP7 potrebbe essere correlata alla disseminazione di virioni dalle cellule epiteliali dell'intestino medio.
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Protocol
1. Allevamento di insetti non viruliferi
- Raccogliere WBPHs dalle risaie e retrocedere con piantine di riso in bicchieri di vetro da 1 L coperti con rete a prova di insetti in un'incubatrice a 28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio. Poiché SRBSDV non viene trasmesso attraverso le uova, le ninfe appena nate non sono virulifere.
- Con una penna, spazzola delicatamente gli insetti dal becher che alleva insetti in un nuovo becher di piantine di riso fresco ogni settimana fino a quando le ninfe WBPH non si sono schiuse. Continua ad allevare queste ninfe non virulifere tratteggiate a 2 o 3 pollici.
NOTA: Spazzolare con attenzione per evitare che i WBPH volino dal becher o li danneggino.
2. Acquisizione del virus e raccolta di insetti viruliferi
- Trasferire insetti non viruliferi dai bicchieri di vetro alle piante di riso fresche infette da SRBSDV coperte da una rete a prova di insetto per un periodo di accesso all'acquisizione del virus (AAP) di 2 d nutrendosi di piante. Quindi, raccogliere gli insetti in bicchieri di vetro contenenti piantine di riso fresco.
- Dopo 2 d, raccogliere gli insetti dai bicchieri di vetro con un aspiratore manuale per la dissezione e l'escissione dell'intestino.
NOTA: L'AAP minimo di SRBSDV è di 5 minuti sia per le ninfe WBPH che per gli adulti, ma gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un'efficienza di acquisizione fino all'80%.
3. Preparazione del reagente
- Sciogliere 8,5 g di NaCl, 3,5 g di Na 2 HPO 4·12H 2 O e 0,25 g di NaH 2 PO4 in 1 mL di ddH2O per preparare una soluzione salina tamponata con fosfato(PBS).
- Aggiungere 4 g di paraformaldeide a 100 ml di PBS per preparare il 4% (m/v) di paraformaldeide in PBS.
- Aggiungere 2 mL di Triton X-100 in 98 mL di PBS per preparare il 2% (v/v) di Triton X-100.
4. Dissezione degli adulti e asportazione delle viscere
- Utilizzare un pipettor per posizionare 100 μL di PBS su un vetrino. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.
- Raccogliere gli adulti infetti da SRBSDV dai bicchieri di vetro con un aspiratore manuale e metterli in tubi da 1,5 ml. Posizionare i tubi sul ghiaccio per paralizzare gli insetti, quindi trasferire un adulto paralizzato nei 100 μL di PBS sul vetrino con l'addome verso l'alto.
NOTA: Gli insetti saranno completamente paralizzati dopo 5 minuti sul ghiaccio. - Utilizzare una pinzetta in una mano per bloccare il corpo, quindi rimuovere la testa con un'altra serie di pinzette nell'altra mano.
- Bloccare i lati dell'addome con una serie di pinzette e bloccare l'ovopositore o l'organo copulatore della coda con l'altro set. Quindi allontanare attentamente la membrana intersegmentale di un segmento addominale ed esporre lentamente l'intestino nell'addome.
- Continuare a strappare via la membrana e gradualmente estrarre l'intestino completo dall'addome. Tirare delicatamente la coda, che è collegata alla fine dell'intestino, per rimuovere l'intestino completo.
NOTA: Tirare con molta attenzione o l'intestino sarà danneggiato. - Posizionare le budella asportate in una provetta da centrifuga da 200 μL, aggiungere 200 μL di PBS al tubo e aspirare delicatamente la soluzione con una pipetta per lavare accuratamente le budella.
5. Dissezione delle ninfe e escissione delle budella
NOTA: I corpi delle ninfe sono più fragili dei corpi adulti e l'intestino è facilmente danneggiato quando viene estratto dalla coda. Pertanto, il metodo più affidabile per asportare l'intestino della ninfa è tirando dalla testa.
- Utilizzare un pipettor per posizionare 100 μL di PBS su un vetrino. Posizionare il vetrino sul palco di un microscopio ottico.
- Raccogliere le ninfe infette da SRBSDV dai becher di vetro con un aspiratore manuale e posizionarle in tubi da 1,5 ml. Posizionare i tubi sul ghiaccio per paralizzare gli insetti. Quindi, trasferire una ninfa paralizzata nei 100 μL di tampone sul vetrino con l'addome rivolto verso l'alto.
- Usa una pinzetta per staccare la coda della ninfa. Quindi bloccare il corpo dell'insetto per fissare delicatamente e utilizzare l'altro set per bloccare la testa. Tirare delicatamente la testa lontano dal corpo pur mantenendo il suo attaccamento all'intestino in modo che la testa sia staccata dal corpo, ma l'intestino è ancora attaccato al torace e all'addome.
NOTA: Dopo che la testa è stata staccata, il corpo adiposo della ninfa defluirà, rendendo il PBS torbido. Rimuovere la soluzione torbida di PBS e sostituirla con 100 μL di PBS fresco. - Con le pinzette che ancora bloccano il corpo, usa l'altro set per muovere la testa con attenzione e gradualmente estrai l'intestino.
- Staccare delicatamente l'intestino dalla testa con una pinzetta e alla fine ottenere un intestino intatto senza danneggiare il corpo della cavalletta.
- Posizionare le budella asportate in una provetta da centrifuga da 200 μL, aggiungere 200 μL di PBS al tubo e aspirare delicatamente la soluzione con una pipetta per lavare accuratamente le budella.
NOTA: Le budella asportate devono essere pulite bene con PBS per rimuovere eventuali corpi grassi contaminanti dalla cavità addominale; Possono interferire con il protocollo di colorazione.
6. Protocolli di etichettatura per virioni SRBSDV e una proteina di insetto
- Preparare gli anticorpi e il mezzo di montaggio utilizzati in questo test. Gli anticorpi sono anticorpi anti-SRBSDV marcati con Dylight 549 (rosso) contro i virioni SRBSDV 18, anticorpi anti-VAMP7 marcati con Dylight 488 (verde) contro la proteina dell'insetto VAMP716,19, Dylight 633 falloidina (blu) e terreno di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, blu).
- Posizionare immediatamente le budella WBPH appena asportate e lavate con PBS in 100 μL di paraformaldeide al 4% (m/v) in una provetta da centrifuga da 200 μL e tenere premuto per 2 ore a temperatura ambiente.
NOTA: Le budella WBPH appena asportate non devono essere immerse in PBS per una durata più lunga, o le cellule epiteliali saranno danneggiate. - Rimuovere il 4% (m/v) di paraformaldeide con un pipettatore, quindi aggiungere 200 μL di PBS nella provetta da centrifuga da 200 μL. Dopo 10 minuti, rimuovere PBS utilizzando un pipettor per eliminare qualsiasi paraformaldeide.
- Ripetere questo passaggio di lavaggio PBS due volte.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di detergente non ionico Triton X-100 (2%, v/v). Permeabilizzare i campioni nel detergente non ionico per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere Triton X-100 al 2% (v/v) con un pipettatore, quindi lavare via il detergente rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS (vedere punti 6.3 e 6.4).
- Anticorpo diluito anti-SRBSDV marcato con Dylight 549 (rosso) e anticorpo anti-VAMP7 marcato con Dylight 488 (verde) 1:50 con 50 μL di albumina sierica del toro (3%, m/v).
- Aggiungere gli anticorpi diluiti alla provetta e incubare i campioni per una notte a 4 °C.
- Rimuovere il diluente anticorpale con un pipettor e quindi lavare via il diluente anticorpale rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS.
- Diluire 1 μL di falloidina Dylight 633 con 50 μL di PBS.
- Aggiungere 50 μL di falloidina diluita alla provetta e incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il diluente della falloidina con un pipettatore, quindi lavare via la falloidina rimanente con tre lavaggi di 10 minuti con 200 μL di PBS.
NOTA: lavaggi accurati sono fondamentali per ridurre lo sfondo e la rilegatura non specifica. - Posizionare una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI su un vetrino da microscopio e trasferire le budella sul supporto.
NOTA: aprire delicatamente ogni budello con una pinzetta ed evitare di creare bolle. Ci sono circa 15 budella per diapositiva. - Posizionare delicatamente un vetro di copertura sopra i campioni senza creare bolle.
NOTA: Il vetrino deve essere tenuto a 4 °C al buio per inibire la tempra della fluorescenza prima dell'osservazione con un microscopio confocale a scansione laser. - Visualizza tutti i campioni con un microscopio confocale a scansione laser. Cattura le immagini usando la luce blu e salva i file su un computer.
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Representative Results
La Figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, escissione dell'intestino, marcatura immunofluorescente e realizzazione del vetrino.
Le budella WBPH asportate dagli adulti sono state fissate in paraformaldeide al 4% (m/v), permeabilizzate con Triton X-100 al 2% (v/v) e quindi incubate con Dylight 633 falloidina10,18. La micrografia confocale a scansione laser nella Figura 2 mostra le tre parti dell'intestino asportato dopo la marcatura con falloidina, e sono rispettivamente l'intestino anteriore, l'intestino medio e l'intestino posteriore. Tra queste tre parti, il midgut è il sito di infezione iniziale di SRBSDV. La struttura cellulare epiteliale monostrato dell'intestino facilita lo studio della localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e della colocalizzazione delle proteine del virus e degli insetti.
Abbiamo anche asportato budella WBPH e incubato con anticorpi anti-VAMP7 marcati con Dylight 488 (verde) e virioni SRBSDV con anticorpi anti-SRBSDV marcati con Dylight 549 (rosso), rispettivamente17,18,19. La Figura 3 mostra VAMP7 nel citoplasma delle cellule epiteliali dell'intestino medio WBPH. I virioni VAMP7 e SRBSDV hanno dimostrato di colocalizzarsi nel citoplasma con un microscopio confocale a scansione laser, suggerendo che VAMP7 può svolgere un ruolo nella trasmissione del virus in vivo.
Figura 1: Panoramica delle fasi di allevamento degli insetti, asportando l'intestino e etichettando le proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Morfologia dell'intestino WBPH. La fluorescenza della falloidina Dylight 633 (blu, actina di marcatura) è stata osservata con un microscopio confocale a scansione laser. Barra scala, 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Marcatura a fluorescenza dei virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali dell'intestino medio WBPH osservate con un microscopio confocale a scansione laser. Le viscere sono state incubate con anticorpi anti-SRBSDV marcati con Dylight 549 (rosso) e anticorpi anti-VAMP7 marcati con Dylight 488 (verde). Barra scala, 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Per ottenere i migliori risultati, è necessario considerare alcuni punti chiave. In primo luogo, è necessario un alto rapporto di insetti viruliferi tra la popolazione totale. Sebbene l'AAP minimo per SRBSDV da parte di ninfe e adulti WBPH sia di 5 min17, gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un'efficienza di acquisizione fino all'80%. Poiché i virioni SRBSDV possono essere rilevati nell'80% delle viscere medie18, abbiamo asportato ed etichettato gli insetti viruliferi a 2 d dopo un AAP 2 d in questo protocollo. In secondo luogo, le viscere degli adulti e delle ninfe sono collegate alle ghiandole salivari nella testa e all'ovopositore o organo copulatore nella coda. Pertanto, l'intestino può essere accuratamente asportato mediante tirare dalla testa o dalla coda. Tuttavia, il tecnico deve scegliere un metodo appropriato per tirare in base alle dimensioni dell'insetto. L'intestino adulto può essere estratto in un pezzo intatto dalla coda dopo che la sua testa è stata rimossa, mentre l'intestino della ninfa più fragile si rompe facilmente quando viene estratto dalla coda20. Più affidabile, l'intestino della ninfa può essere rimosso tirando delicatamente la testa dopo aver staccato l'intestino dalla coda. Utilizzando questi metodi di dissezione / escissione, possiamo ottenere rapidamente budelli intatti e preservare l'ultrastruttura nativa delle cellule epiteliali intestinali. Inoltre, altri organi e il guscio esterno del corpo delle cavallette non vengono distrutti, mantenendo così l'integrità di altri tessuti e organi come le ghiandole salivari e l'emolinfa per esplorare le attività e le interazioni del virus21.
Anche se l'etichettatura con immunofluorescenza è ampiamente utilizzata, i segnali fluorescenti forti possono essere difficili da ottenere senza protocolli di etichettatura adeguati, con conseguente costoso spreco di materiali sperimentali e tempo22,23. Prima dell'etichettatura, le budella asportate devono essere pulite bene con PBS per escludere corpi grassi contaminanti dalla cavità addominale. I corpi grassi contaminanti potrebbero impedire agli anticorpi di entrare nella cellula e rendere poco chiaro il campo visivo se osservato con il microscopio confocale a scansione laser. Dopo questa pulizia, le budella devono essere fissate immediatamente per preservare la struttura cellulare. Assicurarsi che il tempo di trattamento di permeabilizzazione non sia troppo lungo per prevenire l'overflow dell'antigene. Inoltre, le budella permeabilizzate devono essere pulite accuratamente dopo l'incubazione con anticorpi coniugati con luciferina per ridurre lo sfondo e il legame non specifico. Prima che il vetro di copertura venga premuto, aprire delicatamente ogni budello con una pinzetta e cercare di evitare le bolle. Quando il vetrino è pronto, deve essere conservato a 4 °C senza luce per inibire la tempra della fluorescenza prima dell'osservazione con un microscopio confocale a scansione laser24,25.
La trasmissione del virus da parte dell'insetto vettore è un passo cruciale nell'epidemiologia di molte malattie dei virus delle piante. Interrompere questa trasmissione è quindi una strategia efficace contro le malattie virali7,8, quindi chiarire il meccanismo di trasmissione di questi virus è di grande importanza teorica e pratica. L'immunofluorescenza è quindi molto utile per localizzare virus vegetali trasmessi persistentemente e studiare la funzione delle loro proteine in vivo per comprendere le varie fasi della trasmissione del virus. Negli ultimi anni, l'immunofluorescenza e la microscopia confocale a scansione laser sono stati strumenti critici responsabili delle scoperte nella comprensione delle interazioni dei virus nelle cellule e nei tessuti vettoriali durante la trasmissione dei virus vegetali. Utilizzando il presente protocollo, siamo stati in grado di localizzare virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali di viscere medie di adulti e ninfe e determinare eventuali colocalizzazioni. La falloidina è stata utilizzata per marcare l'actina per visualizzare il contorno della membrana cellulare epiteliale dell'intestino medio e DAPI è stato utilizzato per etichettare il nucleo. Le strutture delle cellule epiteliali dell'intestino WBPH e dell'intestino medio sono distinte se osservate con microscopia confocale a scansione laser. Questo protocollo è un metodo affidabile per visualizzare l'anatomia del tratto digestivo degli insetti, localizzare virioni, altri patogeni e proteine degli insetti e studiare le attività dei patogeni negli insetti, le funzioni proteiche degli insetti e le interazioni tra agenti patogeni e proteine degli insetti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31630058 a X.W. e 31772134 a W.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
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