Summary
절제된 곤충 내장에서 식물 바이러스 단백질과 벡터 곤충 단백질 모두의 면역형광 표지를 위한 이 프로토콜은 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용, 곤충 단백질 기능 및 바이러스 전파의 기초가 되는 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
자연계의 대부분의 식물 바이러스는 hemipteran 곤충에 의해 한 식물에서 다른 식물로 전염됩니다. 바이러스 전파에 매우 효율적인 벡터 곤충의 높은 개체군 밀도는 현장에서 바이러스 전염병에 중요한 역할을 합니다. 바이러스-곤충 벡터 상호 작용을 연구하면 식물 바이러스와 그 벡터 곤충을 제어하기 위한 새로운 전략을 설계하기 위해 바이러스 전파 및 전염병에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 면역형광 표지는 병원체와 숙주 간의 상호작용을 분석하는 데 널리 사용되어 왔으며, 중장 상피 세포에서 비리온과 곤충 단백질을 찾기 위해 남부 쌀 검은 줄무늬 왜성 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)를 효율적으로 전달하는 흰등받이 식물호(WBPH, Sogatella furcifera)에서 사용됩니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 중장 상피 세포의 형태학적 특성, 곤충 단백질의 세포 국소화, 비리온과 곤충 단백질의 공동 국소화를 연구했습니다. 이 프로토콜은 곤충의 바이러스 활동, 곤충 단백질의 기능, 바이러스와 벡터 곤충 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
대부분의 기술 된 식물 바이러스는 진딧물, 흰 파리, 딱정벌레, 식물 호퍼 및 thrips 1,2를 포함하는 Hemiptera 목의 곤충에 의해 전염됩니다. hemipteran 곤충의 피어싱 빨아 먹는 입 부분은 타액을 먹이고 분비하기 위해 식물 조직을 관통하여 바이러스를 효율적으로 전염시킵니다2. 벡터 곤충에 의한 식물 바이러스의 다양한 전염 메커니즘이 설명되었습니다. 여기에는 비지속적, 반지속적 및 영구가 포함됩니다. 영구 유형은 비 전파 성 또는 전파성 3,4이지만,이 두 유형 모두에 대해 전염 된 바이러스는 곤충의 몸 전체로 이동해야합니다. 영구 전파 모드에서, 바이러스는 처음에는 곤충의 내장의 상피 세포에서 감염 및 복제 된 다음 다른 조직으로 퍼지고 결국에는 타액선으로 퍼져 곤충 먹이 동안 타액을 통해 식물에 도입 될 수 있습니다 5,6. 지속성 전염 바이러스는 서로 다른 기관을 통해 이동하고 곤충 벡터에서 복제되며, 이는 서로 다른 단계에서 바이러스와 벡터 구성 요소 간의 특정 상호 작용을 필요로 합니다 7,8.
바이러스 단백질과 곤충 단백질은 벡터 곤충에서 바이러스 인식, 감염, 복제 또는 보급을 위한 중요한 과정을 촉진하기 위해 상호 작용해야 합니다 9,10. 광학 현미경은 곤충의 세포 구조를 관찰하는 데 사용할 수 있지만 비리온 분포, 바이러스 단백질과 곤충 단백질의 세포 국소화 또는 공동 국소화, 곤충 조직 및 세포의 미세 구조를 보여줄 수 없습니다. 면역형광 표지는 Coons et al.에 의해 특이적 플루오레세인 항체를 표지하는 방법으로 마우스의 식세포에서 처음 수행되었으며 현재는 널리 사용되고 있다11. 형광 항체 기술로도 알려진 면역 형광 기술은 개발 된 최초의 면역 학적 표지 기술 중 하나이며 항원과 항체11,12 사이의 특이 적 결합 반응을 기반으로합니다. 공지된 항체는 먼저 플루오레세인으로 표지되며, 이는 세포 또는 조직13,14에서 상응하는 항원을 검출하기 위한 프로브로서 사용된다. 플루오레세인 표지 항체가 세포 또는 조직의 해당 항원에 결합한 후 여기 파장을 조사하고 형광 현미경으로 볼 때 프로브는 밝은 형광을 방출하여 항원을 국소화합니다15.
식물 바이러스의 대부분의 벡터 곤충은 hemipterans입니다. 식물 바이러스에 대한 전염 효율이 높은 벡터 곤충의 개체군 밀도가 높을수록 바이러스 전염병이 발생할 수 있다5. 벼의 가장 심각한 병원균 중 하나인 남방벼 흑줄무늬난쟁이 바이러스(SRBSDV, 피지바이러스 속, Reoviridae과)는 동아시아와 동남아시아의 벼 재배 지역에 빠르게 퍼져 2010년 이후 심각한 수확량 손실을 초래했습니다16,17. 흰등받이식물호퍼(WBPH, Sogatella furcifera Horváth)의 성충과 님프는 SRBSDV를 고효율로 지속적으로 번식하는 방식으로 벼에 전달합니다. 현장 연구에 따르면 SRBSDV에 의해 유발된 벼 검은 줄무늬 왜소병의 발병은 일반적으로 SRBSDV 전염병의 중요한 요소인 WBPH의 대규모 장거리 이동과 일치합니다 7,8,18. VESICLE-associated membrane protein 7(VAMP7)은 소포 융합을 통해 물질의 수송을 매개할 수 있는 가용성 N-에틸말레이미드 민감 인자 부착 단백질 수용체(SNARE)입니다. VAMP7은 시험관 내에서 SRBSDV의 외부 주요 캡시드 단백질과 상호 작용하며, 이는 VAMP7이 바이러스 전파와 밀접하게 연관되어 있음을 나타냅니다16.
여기에 제시된 프로토콜에서 우리는 중장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지하기 위한 예로 독성 WBPH에서 장을 절제했습니다16. 바이러스의 초기 침입 부위인 중장 상피는 바이러스 감염, 복제 및 전파에 중요한 역할을 합니다. 먼저, 우리는 WBPH의 님프와 성인의 내장을 절제하는 단계를 자세히 설명했습니다. 둘째, 특정 플루오레세인 표지 항체를 사용하여 장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 표지했습니다. 그런 다음 레이저 주사 컨포칼 현미경을 통해 상피 세포와 비리온 및 VAMP7의 세포 위치를 관찰했습니다. 결과는 SRBSDV 비리온과 VAMP7이 중장 상피 세포의 세포질에서 공동 국소화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 VAMP7의 특정 기능이 중장 상피 세포에서 비리온의 보급과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.
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Protocol
1. 무독성 곤충 사육
- 논에서 WBPH를 수집하고 16시간 밝기와 8시간 어두운 28°C의 인큐베이터에서 방충망으로 덮인 1L 유리 비커에 벼 묘목과 함께 후면에 채취합니다. SRBSDV는 알을 통해 전염되지 않기 때문에 새로 부화한 님프는 독성이 없습니다.
- 브러시 펜을 사용하여 WBPH 님프가 부화할 때까지 매주 신선한 벼 묘목의 새 비커에 곤충을 기르는 비커에서 곤충을 부드럽게 빗어냅니다. 이 부화하지 않은 무독성 님프를 2 또는 3 인스타로 계속 키우십시오.
알림: WBPH가 비커에서 날아가거나 손상되지 않도록 조심스럽게 솔질하십시오.
2. 바이러스 획득 및 독성 곤충 수집
- 유리 비커에서 독성이 없는 곤충을 식물에 먹이를 주어 2일 바이러스 획득 접근 기간(AAP) 동안 방충망으로 덮인 신선한 SRBSDV 감염 벼로 옮깁니다. 그런 다음 신선한 벼 묘목이 들어있는 유리 비커에 곤충을 모으십시오.
- 2 일 후, 장의 해부 및 절제를위한 수동 흡인기로 유리 비커에서 곤충을 수집하십시오.
참고: SRBSDV의 최소 AAP는 WBPH 님프와 성인 모두 5분이지만 곤충은 최대 80%의 획득 효율을 달성하기 위해 2일 동안 신선한 SRBSDV에 감염된 벼를 먹일 수 있어야 합니다.
3. 시약 준비
- 8.5 g의 NaCl, 3.5 g의Na2HPO4·12H2O 및 0.25 g의 NaH2PO4를 1 mL의ddH2O에 녹여 0.01 M 인산완충식염수(PBS) 용액을 제조하였다.
- 4 mL의 PBS에 100 g의 파라 포름 알데히드를 첨가하여 PBS에서 4 % (m / v) 파라 포름 알데히드를 제조한다.
- 2mL의 Triton X-100을 98mL의 PBS에 첨가하여 2%(v/v) Triton X-100을 준비합니다.
4. 성인의 해부 및 내장 절제
- 피펫터를 사용하여 유리 슬라이드에 PBS 100μL를 놓습니다. 광학 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 수동 흡인기로 유리 비커에서 SRBSDV에 감염된 성인을 수집하여 1.5mL 튜브에 넣습니다. 곤충을 마비시키기 위해 튜브를 얼음 위에 놓은 다음 마비 된 성인을 복부가 위로 향하게하여 슬라이드의 PBS 100 μL에 옮깁니다.
알림: 곤충은 얼음 위에서 5분 후에 완전히 마비됩니다. - 한 손에는 핀셋을 사용하여 몸을 고정한 다음 다른 손에는 다른 핀셋 세트로 머리를 제거합니다.
- 한 세트의 핀셋으로 복부의 측면을 고정하고 다른 세트로 꼬리의 산란기 또는 교합 기관을 고정하십시오. 그런 다음 한 복부 부분의 분절 간 막을 조심스럽게 빼내고 복부의 내장을 천천히 노출시킵니다.
- 막을 계속 찢어 내고 복부에서 완전한 내장을 서서히 빼냅니다. 내장 끝에 연결된 꼬리를 부드럽게 당겨 전체 내장을 제거합니다.
알림: 매우 조심스럽게 당기지 않으면 내장이 손상될 수 있습니다. - 절제된 내장을 200μL 원심분리기 튜브에 넣고 200μL의 PBS를 튜브에 추가한 다음 피펫으로 용액을 부드럽게 빨아들여 내장을 완전히 씻습니다.
5. 님프의 해부와 내장의 절제
참고: 님프의 몸은 성인의 몸보다 더 연약하며 꼬리에서 잡아당기면 내장이 쉽게 손상됩니다. 그러므로, 님프 내장을 소비하는 가장 신뢰할 수있는 방법은 머리에서 당기는 것입니다.
- 피펫터를 사용하여 유리 슬라이드에 PBS 100μL를 놓습니다. 광학 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 수동 흡인기로 유리 비커에서 SRBSDV에 감염된 님프를 수집하여 1.5mL 튜브에 넣습니다. 곤충을 마비시키기 위해 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 마비된 요정을 복부가 위를 향하도록 하여 슬라이드의 완충액 100μL에 옮깁니다.
- 핀셋을 사용하여 님프의 꼬리를 분리하십시오. 그런 다음 곤충 몸체를 고정하여 부드럽게 고정하고 다른 세트를 사용하여 머리를 고정합니다. 머리가 몸에서 분리되더라도 내장은 여전히 흉부와 복부에 붙어 있도록 장에 부착된 상태를 유지하면서 머리를 몸에서 부드럽게 잡아당깁니다.
참고: 머리가 분리된 후 요정의 지방체가 흘러나와 PBS를 혼탁하게 만듭니다. 탁한 PBS 용액을 제거하고 100μL의 신선한 PBS로 교체합니다. - 핀셋이 여전히 몸을 고정하고 있는 상태에서 다른 세트를 사용하여 머리를 조심스럽게 움직이고 점차적으로 내장을 빼냅니다.
- 핀셋으로 머리에서 내장을 부드럽게 떼어내고 결국 화분호퍼의 몸을 손상시키지 않고 온전한 내장을 얻습니다.
- 절제된 내장을 200μL 원심분리기 튜브에 넣고 200μL의 PBS를 튜브에 추가한 다음 피펫으로 용액을 부드럽게 빨아들여 내장을 완전히 씻습니다.
참고: 절제된 내장은 복강에서 오염된 지방체를 제거하기 위해 PBS로 잘 세척해야 합니다. 염색 프로토콜을 방해할 수 있습니다.
6. SRBSDV 비리온 및 곤충 단백질에 대한 라벨링 프로토콜
- 이 분석에 사용된 항체와 마운팅 배지를 준비합니다. 항체는 SRBSDV 비리온 18에 대해 Dylight 549(빨간색)로 표지된 항-SRBSDV 항체, 곤충 단백질 VAMP716,19에 대해 Dylight488(녹색)로 표지된 항-VAMP7 항체, Dylight 633 팔로이딘(파란색) 및 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 파란색)을 포함하는 장착 배지입니다.
- 갓 절제하고 PBS로 세척한 WBPH 내장을 100μL 원심분리기 튜브에 4%(m/v) 파라포름알데히드 200μL에 즉시 넣고 실온에서 2시간 동안 유지합니다.
참고: 갓 절제한 WBPH 내장을 PBS에 장기간 담가두면 상피 세포가 손상됩니다. - 피펫터로 4%(m/v) 파라포름알데히드를 제거한 다음 200μL의 PBS를 200μL 원심분리기 튜브에 추가합니다. 10분 후 피펫터를 사용하여 PBS를 제거하여 파라포름알데히드를 제거합니다.
- 이 PBS 세척 단계를 두 번 반복합니다.
- PBS를 제거하고 200μL의 비이온성 세제 Triton X-100(2%, v/v)을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 비이온성 세제에 샘플을 투과시킵니다.
- 피펫터로 2%(v/v) Triton X-100을 제거한 다음 200μL의 PBS로 10분 동안 세 번 세척하여 남아 있는 세제를 씻어냅니다(6.3 및 6.4단계 참조).
- Dylight 549(빨간색)로 표지된 항-SRBSDV 항체와 Dylight 488(녹색)로 표지된 항-VAMP7 항체를 1:50으로 50μL의 황소 혈청 알부민(3%, m/v)으로 희석합니다.
- 희석된 항체를 튜브에 넣고 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
- 항체 희석제를 피펫터로 제거한 후, 200 μL의 PBS로 10분간 3회 세척하여 나머지 항체 희석제를 씻어낸다.
- 1 μL의 Dylight 633 팔로이딘을 50 μL의 PBS로 희석합니다.
- 희석된 팔로이딘 50μL를 튜브에 넣고 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다.
- 피펫터로 팔로이딘 희석제를 제거한 후 200 μL의 PBS로 10분간 3회 세척하여 남은 팔로이딘을 씻어낸다.
알림: 철저한 세척은 배경과 비특이적 바인딩을 줄이는 데 중요합니다. - DAPI가 포함된 장착 매체 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓고 내장을 매체로 옮깁니다.
알림: 핀셋으로 각 내장을 부드럽게 펼치고 거품이 생기지 않도록 합니다. 슬라이드 당 약 15 개의 내장이 있습니다. - 기포를 만들지 않고 샘플 위에 커버 글라스를 부드럽게 놓습니다.
참고: 슬라이드는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 관찰하기 전에 형광 소광을 억제하기 위해 어두운 곳에서 4°C로 유지해야 합니다. - 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 모든 샘플을 볼 수 있습니다. 청색광을 사용하여 이미지를 캡처하고 파일을 컴퓨터에 저장합니다.
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Representative Results
그림 1은 곤충 사육, 바이러스 획득, 장 절제, 면역형광 표지 및 슬라이드 제작과 같은 이 프로토콜의 모든 단계를 보여줍니다.
성인에서 절제된 WBPH 내장을 4%(m/v) 파라포름알데히드로 고정하고 2%(v/v) Triton X-100으로 투과시킨 다음 Dylight 633 팔로이딘10,18로 배양했습니다. 그림 2의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 사진은 팔로이딘으로 표지한 후 절제된 장의 세 부분을 보여주며, 각각 전장, 중장 및 후장입니다. 이 세 부분 중 중장은 SRBSDV의 초기 감염 부위입니다. 장의 단층 상피 세포 구조는 곤충 단백질의 세포 국소화 및 바이러스 및 곤충 단백질의 공동 국소화 연구를 용이하게합니다.
우리는 또한 WBPH 내장을 절제하고 Dylight 488(녹색) 표지 항-VAMP7 항체 및 SRBSDV 비리온과 Dylight 549(빨간색) 표지 항-SRBSDV 항체(각각17,18,19)와 함께 배양했습니다. 도 3은 WBPH 중장 상피 세포의 세포질에서의 VAMP7을 보여준다. VAMP7 및 SRBSDV 비리온은 레이저 주사 컨포칼 현미경으로 세포질에서 공동 국소화되는 것으로 나타났으며, 이는 VAMP7이 생체 내에서 바이러스 전파에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
그림 1: 곤충 사육, 내장 절제 및 단백질 표시 단계 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: WBPH 장의 형태. Dylight 633 팔로이딘(파란색, 표지 액틴)의 형광을 레이저 주사 공초점 현미경으로 관찰했습니다. 스케일 바, 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 본 WBPH 중장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온 및 VAMP7의 형광 표지. 내장은 Dylight 549(빨간색)로 표지된 항-SRBSDV 항체 및 Dylight 488(녹색)로 표지된 항-VAMP7 항체와 함께 배양되었습니다. 스케일 바, 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최상의 결과를 얻으려면 몇 가지 핵심 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 전체 인구 중 독성 곤충의 비율이 높아야합니다. WBPH 님프와 성인에 의한 SRBSDV의 최소 AAP는 5 분17 초이지만, 곤충은 최대 80 %의 획득 효율을 달성하기 위해 2 일 동안 신선한 SRBSDV에 감염된 벼를 먹일 수 있어야합니다. SRBSDV 비리온은 중장18의 80%에서 검출될 수 있기 때문에, 우리는 이 프로토콜에서 2d AAP 후 2d에서 독성 곤충을 절제하고 라벨링했습니다. 둘째, 성충과 애벌레의 내장은 머리의 침샘과 꼬리의 산란관 또는 교합 기관과 연결되어 있습니다. 따라서 내장은 머리나 꼬리에서 잡아당겨 조심스럽게 절제할 수 있습니다. 그러나 기술자는 곤충의 크기에 따라 적절한 당기는 방법을 선택해야 합니다. 성체 내장은 머리를 제거한 후 꼬리에서 온전한 한 조각으로 뽑을 수 있는 반면, 더 연약한 요정의 내장은 꼬리에서 잡아당기면 쉽게 부러집니다(20). 보다 확실하게, 님프 내장은 꼬리에서 내장을 분리 한 후 머리를 부드럽게 잡아 당겨 제거 할 수 있습니다. 이러한 해부/절제 방법을 사용하여 온전한 내장을 신속하게 얻고 장 상피 세포의 기본 미세 구조를 보존할 수 있습니다. 또한, 다른 기관과 식물 호퍼의 외피는 파괴되지 않으므로 침샘 및 체액과 같은 다른 조직 및 기관의 무결성을 유지하여 바이러스 활동 및 상호 작용을 탐색합니다21.
면역형광 표지가 널리 사용되지만, 적절한 표지 프로토콜 없이는 강한 형광 신호를 얻기 어려울 수 있으며, 그 결과 실험 재료와 시간이 낭비될 수 있다22,23. 라벨을 붙이기 전에 절제된 내장을 PBS로 잘 세척하여 복강에서 오염된 지방체를 제거해야 합니다. 오염 된 지방체는 항체가 세포에 들어가는 것을 방지하고 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 관찰 할 때 시야를 불분명하게 만듭니다. 이 청소 후에는 세포 구조를 보존하기 위해 내장을 즉시 고정해야합니다. 투과화 처리 시간이 항원 오버플로를 방지하기 위해 너무 길지 않은지 확인하십시오. 또한, 투과화된 내장은 루시페린 결합 항체로 배양한 후 철저히 세척하여 배경 및 비특이적 결합을 줄여야 합니다. 커버 글라스를 누르기 전에 핀셋으로 각 내장을 부드럽게 펼치고 거품을 피하십시오. 슬라이드가 준비되면, 레이저 주사 공초점 현미경24,25로 관찰하기 전에 형광 소광을 억제하기 위해 빛 없이 4°C에서 보관해야 한다.
곤충 벡터에 의한 바이러스 전파는 많은 식물 바이러스 질병의 역학에서 중요한 단계입니다. 따라서 이러한 전파를 차단하는 것은바이러스 질병에 대한 효과적인 전략이므로 7,8, 따라서 이러한 바이러스의 전파 메커니즘을 설명하는 것은 이론적으로나 실제적으로 매우 중요합니다. 따라서 면역형광법은 지속적으로 전염되는 식물 바이러스의 국소화를 하고 바이러스 전파의 다양한 단계를 이해하기 위해 생체 내에서 단백질의 기능을 연구하는 데 매우 유용합니다. 최근 몇 년 동안 면역형광 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경은 식물 바이러스 전파 중 벡터 세포 및 조직에서 바이러스 상호 작용을 이해하는 데 획기적인 역할을 하는 중요한 도구였습니다. 현재 프로토콜을 사용하여 성인과 님프의 중장 상피 세포에서 SRBSDV 비리온과 VAMP7을 국소화하고 모든 공동 국소화를 결정할 수 있었습니다. Phalloidin은 중장 상피 세포막의 윤곽을 보기 위해 액틴을 표지하는 데 사용되었으며 DAPI는 핵을 표지하는 데 사용되었습니다. WBPH 장 및 중장 상피 세포의 구조는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 볼 때 뚜렷합니다. 이 프로토콜은 곤충의 소화관 해부학을 보고, 비리온, 기타 병원체 및 곤충 단백질의 위치를 파악하고, 곤충의 병원체 활동, 곤충 단백질 기능, 병원체와 곤충 단백질 간의 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (National Natural Science Foundation of China)의 보조금으로 지원되었습니다 (31630058에서 X.W.로, 31772134에서 WL로).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
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