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Summary
本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤，在预定的时间范围内维持细胞生长，以及检索支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析以及下游应用，可适应满足一系列实验目标。
Abstract
神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，占儿童癌症死亡总数的15%。天然肿瘤组织是一个复杂的三维 （3D） 微环境，涉及被细胞外基质 （ECM） 包围的癌细胞和非癌细胞层。ECM 提供物理和生物支持，并有助于疾病进展、患者预后和治疗反应。
本文描述了一种组装基于3D支架的系统的方案，以使用神经母细胞瘤细胞系和基于胶原的支架模拟神经母细胞瘤微环境。支架补充有纳米羟基磷灰石 （nHA） 或糖胺聚糖 （GAG），这些聚糖天然存在于骨骼和骨髓中，是神经母细胞瘤最常见的转移部位。这些支架的 3D 多孔结构允许神经母细胞瘤细胞附着、增殖和迁移，以及细胞簇的形成。在这个3D基质中，细胞对治疗的反应更能反映 体内 情况。
与传统的二维 （2D） 细胞培养相比，基于支架的培养系统可以保持更高的细胞密度。因此，初始接种细胞数量的优化方案取决于所需的实验时间范围。该模型通过DNA定量评估细胞生长，通过代谢测定评估细胞活力，以及通过组织学染色评估支架内的细胞分布来监测。
该模型的应用包括评估基因和蛋白质表达谱，以及使用常规药物和miRNA进行细胞毒性测试。3D 培养系统允许精确操作细胞和 ECM 成分，从而创造一个在生理上与天然肿瘤组织更相似的环境。因此，这种3D 体外 模型将促进对疾病发病机制的理解，并改善 在体外、 动物模型和 人类受试者中获得的结果之间的相关性。
Introduction
神经母细胞瘤是一种交感神经系统的小儿癌症，在胚胎发育或出生后早期由于神经嵴细胞的转化而引起1。它是儿童中最常见的实体性颅外肿瘤，占 15 岁以下患者诊断出的恶性肿瘤的 8%，占所有儿童癌症死亡的 15%。由于特定的染色体、遗传和表观遗传改变以及组织病理学特征，该疾病表现出高度异质的临床行为。
这些改变导致神经母细胞瘤的侵袭性和儿科患者的不良预后。因此，从长远来看，目前的疗法对近 80% 的临床侵袭性疾病患者无效2，这凸显了对这组患者的治疗仍然具有挑战性的事实。这可能是由于神经母细胞瘤异质性和转移的机制仍未完全了解。然而，肿瘤微环境 （TME） 现在被广泛认为在许多癌症的进展中起作用;然而，它在神经母细胞瘤中的研究仍然不足 3,4。
天然TME是一个复杂的3D微环境，涉及被ECM包围的癌细胞和非癌细胞。ECM 是指组织的脱细胞成分，它为其细胞居民提供结构和生化支持，并有助于疾病进展、患者预后和治疗反应5。这种疾病进展的促进是由于细胞和ECM之间的“动态互惠”或持续的双向通讯6,7,8。随着癌症的进展，基质胶原蛋白通常以垂直于基质-癌界面的线性模式进行重组，癌细胞将其用作转移的迁移途径 9,10,11。
这种天然功能性生物支架的主要成分包括I型和II型胶原蛋白和其他蛋白质的纤维网络，包括弹性蛋白、糖蛋白（如层粘连蛋白）以及一系列蛋白聚糖和其他可溶性成分12,13。这些天然ECM的蛋白质现在已成为开发3D体外模型的有吸引力的天然生物分子3。由于与传统的 2D 单层培养相比，3D 支架具有更强的 TME 生理表现，因此在体外细胞培养中的应用越来越受欢迎。制造的 3D 支架有助于细胞附着、增殖、迁移、代谢和对体内生物系统中观察到的刺激的反应。
这些 3D 支架的主要成分是胶原蛋白，胶原蛋白是许多正常生物过程的关键参与者，包括组织修复、血管生成、组织形态发生、细胞粘附和迁移11。基于胶原蛋白的 3D 基质已显示出其强大的 ECM 建模功能，可作为体外仿生微环境，同时实现细胞-ECM 相互作用以及细胞迁移和侵袭。在许多癌症模型 14,15,16（包括神经母细胞瘤17,18）中，这些 3D 基质还比传统的 2D 或“平面”培养物更准确地分析了细胞对化疗药物的反应 14,15,16。据报道，即使与动物模型相比，3D 细胞培养物的遗传分析也与人体组织图谱具有更高的相关性19。总体而言，这些 3D 支架的基石是为细胞提供合适的体外环境，这概括了天然组织结构并促进了双向分子串扰8。
为了增加基于胶原蛋白的模型的复杂性，在组织工程过程中加入了其他常见的ECM成分，从而创建了更具生理学相关性的模型，以反映不同组织的生态位TME。例如，GAGs，存在于所有哺乳动物组织中的带负电荷的多糖20，促进细胞附着、迁移、增殖和分化。硫酸软骨素是在骨骼和软骨中发现的一种特殊类型的 GAG，以前已用于骨修复的组织工程应用 21,22,23,24,25。纳米羟基磷灰石（nHA）是人体骨组织矿物质成分的主要无机成分，占骨骼重量的65%26，因此广泛用于骨替代和再生27。因此，GAG 和 nHA 是重建原发性神经母细胞瘤 ECM 和模拟神经母细胞瘤、骨髓 （70.5%） 和骨 （55.7%） 最常见的转移部位的有吸引力的复合材料28。
包含这些 ECM 组件的支架最初是为骨组织工程应用而开发的，对其生物相容性、毒性以及骨传导和骨诱导特征进行了广泛分析29,30。它们是多孔的胶原蛋白基质，使用冷冻干燥技术生产，以控制其物理和生物特性。补充有 nHA （Coll-I-nHA） 或软骨素-6-硫酸盐 （Coll-I-GAG） 的胶原支架在模拟乳腺癌31 的原发性 TME 和前列腺癌15 以及神经母细胞瘤17 的骨转移方面显示出成功。用于制造这些复合支架的冷冻干燥技术在支架内的孔径和孔隙率方面产生了可重复的均匀性22,23,24。简而言之，通过将纤维状胶原蛋白与0.05M乙酸混合来制备胶原蛋白浆液（0.5wt%）。对于Coll-I-GAG，在混合时将0.05wt%的从鲨鱼软骨中分离出的chrondoitin-6-sulfate添加到胶原浆液中。对于复合Coll-I-nHA支架，如前所述合成纳米级羟基磷灰石颗粒27，并在混合过程中以与胶原重量的2：1比例添加到胶原浆液中。所有支架均进行物理交联，并使用105°C的脱水热处理灭菌24小时25。使用活检打孔器获得圆柱形支架（直径6mm，高度4mm），并且可以在蒸馏水（dH2O）中与3mM N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和5.5mM N-羟基琥珀酰亚胺（EDAC / NHS）化学交联，以改善构建体的机械性能30。这种由两个胶原支架精心优化的制造工艺创造了具有可重复机械性能的支架，包括孔径、孔隙率和刚度 （kPa）。Coll-I-GAG 和 Coll-I-nHA 支架具有不同的物理特性，从而产生不同的环境条件。每个脚手架的属性如表 1 所示。
| COLL-I-GAG系列 | Coll-I-nHA型 | |
| 脚手架尺寸 （直径 [mm] x 高度 [mm]） |
6 x 4 17 | 6 x 4 17 |
| 胶原蛋白浓度 （wt. %） | 0.5 17 | 0.5 17 |
| 底物浓度 （wt. %） [基于胶原蛋白的重量] |
0.05 15.17 | 200 17 |
| 平均孔径 （mm） | 96 22 | 96 – 120 29 |
| 孔隙率 （%） | 99.5 23 | 98.9 – 99.4 27 |
| 刚度 （kPa） | 1,5 27 | 5.5 - 8.63 29 |
表 1：用于研究神经母细胞瘤生物学的两种支架的机械性能概述。
本文描述了一种组装基于 3D 支架的系统的方案，以使用神经母细胞瘤细胞系和先前描述的补充有 nHA （Coll-I-nHA） 或软骨素-6-硫酸盐 （Coll-I-GAG） 的基于胶原的支架更好地模拟神经母细胞瘤微环境。该协议包括下游方法，使用先前优化的、廉价的方法在更具生理相关性的环境中分析神经母细胞瘤细胞的生长机制，这些方法改编自2D单层培养 图1。
图 1：整体协议工作流程。 （A） 细胞生长到足够数量，分裂、计数并重悬于适当体积的培养基中。（B） 然后对该细胞原液进行连续稀释，以制备总共 4 种不同密度的细胞悬液。（C）将基于胶原的支架无菌接种在非贴壁的24孔板中，并将（D）将20μL细胞悬液添加到每个支架的中心，并在37°C，5%CO2和95%湿度下孵育3-5小时。 （E）然后将完全生长培养基（1mL）缓慢添加到每个支架中，并将板放回培养箱中以使细胞在所需的时间范围内生长。（F）在每个预定时间点，取回几个支架进行细胞活力和生长评估、基因表达分析和组织学染色。 请点击这里查看此图的较大版本.
Protocol
1. 实验设计
注意：每个实验所需的支架和细胞的数量将取决于实验的规模，可以使用本节中关于实验设计的工具进行计算。
- 所需脚手架数量
- 确定细胞生物学变化（例如，细胞生长和代谢）的总体实验时间表和评估间隔。
注意：例如，实验时间为 14 天，每 7 天评估一次细胞生长。因此，实验时间点是第 1、7、14 天，总共有 3 个时间点。 - 接下来，确定每个时间点要应用的实验应用程序数量。尝试在每个时间点完成相同的分析以监视更改。
注：支架上细胞生长的典型分析包括细胞活力测定、DNA 定量、组织学染色和成像以及基因表达分析。这些将在第5节中进一步讨论。 - 决定何时将同一支架用于多个下游应用，例如，在使用适当的测定方法进行细胞活力评估后，重复使用支架进行 DNA/RNA 分离（在 5.1.11 中讨论）。
- 每次应用至少保留 3 个生物学重复，例如，3 个支架用于细胞活力和 DNA 定量，3 个支架用于组织学，3 个支架用于基因表达分析。由于这相当于每个时间点 9 个脚手架，因此计划在 3 个时间点使用 27 个脚手架。
- 最后，将该数字乘以实验参数或条件的数量（例如，评估多个细胞系、初始接种密度、支架组成）。
注：在该协议中，正在评估一个细胞系的4种不同的初始接种密度，从而需要108个（27个支架x 4个条件）支架。为了解决人为错误并提供额外的覆盖范围，请在此数字上增加 ~10%，例如，如果需要 108 个支架，请准备 120 个支架。
- 确定细胞生物学变化（例如，细胞生长和代谢）的总体实验时间表和评估间隔。
- 所需单元数
注：建议在第 0 天将 20 μL 体积的细胞悬液接种到圆柱形支架（直径 6 mm，高度 4 mm）上。根据实验设计调整每20μL细胞悬液的细胞数，在第1.1节中计算。常见的初始接种密度为每 20 μL 2 × 105 个细胞，用作以下方案的示例。- 要计算实验所需的细胞总量，请将每 20 μL 的初始 2 × 105 个细胞乘以所需的支架数量。
注：例如，30 个支架乘以 20 μL 得到 600 μL 的总体积。如果每个支架需要 2 个× 105 个细胞，则 600 μL 悬浮液总共包含 6 个× 10 6 个细胞（2 × 105 × 30），最终需要 6 个细胞× 106 个细胞，共 600 μL。实验参数的数量将决定所需的细胞总数。因此，该协议概述了使用多层细胞培养瓶的细胞培养，该培养瓶可以处理与10个传统175cm2烧瓶相同数量的细胞。
- 要计算实验所需的细胞总量，请将每 20 μL 的初始 2 × 105 个细胞乘以所需的支架数量。
2. 胶原基支架的制备
注：使用既定方法15,21,27制备Coll-I-nHA和Coll-I-GAG圆柱形支架（直径6mm，高度4mm）。一旦按照先前发表的方法17 进行化学交联，支架必须在 1 周内使用。
- 在制造具有所需机械性能的支架后，确保支架完全水化并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 彻底洗涤。
注意：这通常在支架交联后需要~12小时，并且可以在4°C的100mL组织培养废物容器中进行，每个容器最多50个支架，每个支架最多2mL PBS。 - 将支架储存在4°C的PBS中，直至准备使用。
3. 在多层细胞培养瓶中繁殖神经母细胞瘤细胞
注意：多层烧瓶的最佳接种密度会有所不同。对于本实验中使用的烧瓶，根据制造商的说明，最佳密度为 1 × 107 个细胞。在接种多层烧瓶之前，在适当的组织培养瓶（例如，T175 cm2 组织培养瓶）中将细胞增殖至 1 × 107 个细胞或更高的密度。要将细胞接种到多层烧瓶中（第 3.1 节），将它们生长至 70-80% 汇合，收获并计数每毫升的细胞数，参考步骤 3.2.16-3.2.20 进行细胞计数。一旦细胞悬液被计数，立即进行多层烧瓶的接种。细胞培养工作必须在层流罩中进行，以保持无菌。
- 接种多层细胞培养瓶
- 在37°C水浴中预热550mL完全生长培养基（取决于使用的细胞系）和100mL无菌PBS，预热20分钟。
- 使用收获的细胞悬液，使用公式（1）计算达到1×107个细胞的最佳接种密度所需的细胞悬液体积，其中WANT是指接种多层烧瓶所需的细胞数，HAVE是指细胞悬液中的细胞数/ mL：
（一）
例如，
- 将所需体积的细胞悬液加入 100 mL 预热的生长培养基中。
- 在引擎盖中取出一个新的多层烧瓶，取下盖子，然后以 60° 角握住烧瓶。缓慢地将所有 100 mL 细胞悬液移液到烧瓶中，沿着颈部的倾斜侧向下移液。盖上烧瓶的盖子并将其侧放，以使细胞均匀分布在整个层中。
- 以 60° 角，将 400 mL 预热的生长培养基加入多层烧瓶中，方法是缓慢倒入或移液到颈部的倾斜侧。如果颈部变满，请将烧瓶放回直立位置，或盖上烧瓶盖并将其侧放，然后再返回倾倒。
注意： 缓慢倒入以避免形成过多的气泡。在直立位置轻轻敲击烧瓶，使所有气泡上升到顶部，然后用 10 mL 移液管将其除去。确保烧瓶装满到颈部的底部螺纹;如有必要，添加更多介质来实现此目的。 - 盖上多层烧瓶的盖子，并在37°C，5%CO2和95%湿度下孵育，使倾斜的颈部朝下孵育。
- 每 2-3 天检查一次生长是否汇合。要检查多层烧瓶底部两层的汇合度，请在倒置显微镜的 4 倍物镜下观察它们。
注意：当接种 1 × 107 个神经母细胞瘤细胞时，10 层烧瓶通常需要一周时间才能汇合——尽管这可能因所使用的细胞系而异。
- 多层烧瓶中细胞的日常维护
- 在37°C水浴中预热550mL完全生长培养基（取决于使用的细胞系），50-100mL胰蛋白酶和300mL无菌PBS20分钟。
- 检查多层烧瓶的汇合度是否为 70-80%。
- 将多层烧瓶放入层流罩中，然后倒出烧瓶中的用过的培养基。最初，倾斜烧瓶，使介质从气坝上倒入废物容器中。倒入时，将烧瓶旋转 180°，直到培养基沿着烧瓶的倾斜颈部流下。沿此轴来回旋转烧瓶以消除任何残留的液体。
- 通过在倾斜的颈部缓慢加入 100 mL 预热的无菌 PBS 来洗涤细胞。盖上烧瓶盖，将其侧放以使PBS均匀分布，然后前后旋转烧瓶以洗涤细胞。
- 以与 3.2.3 相同的方式丢弃 PBS 洗涤液。重复洗涤步骤。
- 将 50 mL 预热的胰蛋白酶稀释在 50 mL 预热的无菌 PBS 中。将 100 mL 稀释的胰蛋白酶溶液加入多层烧瓶中，盖上盖子，将烧瓶侧放，使胰蛋白酶均匀分布。如果细胞系贴壁高，则使用 100 mL 未稀释的胰蛋白酶。
- 将烧瓶在37°C，5%CO 2和95%湿度下孵育2-5分钟，在显微镜下监测细胞分离。如有必要，用力敲击烧瓶以帮助分离或将其放回培养箱中再放置一分钟。
- 将多层烧瓶置于层流罩中，并用 100 mL 生长培养基中和胰蛋白酶。盖上烧瓶的盖子，将其侧放，前后摇晃以确保完全中和。
- 将中和的细胞悬液倒入 4 x 50 mL 锥形离心管中。
注意：如果需要完全收获细胞，请用 100 mL 无菌 PBS 再次洗涤多层烧瓶，并将其倒入 2 x 50 mL 离心管中。 - 将细胞悬液在 50 mL 离心管中以 340 × g 离心 3-4 分钟以沉淀细胞。
- 将离心管放回层流罩，小心地从每个沉淀中丢弃尽可能多的上清液。
注意：颗粒会很大且相对松散，因此很容易被破坏。 - 向每个沉淀中加入 1-5 mL 生长培养基，并通过上下移液数次将其重悬。
- 将 4 个重悬的沉淀汇集在一个 50 mL 离心管中，将它们与移液器充分混合，并注意总体积。
- 适当稀释细胞悬液进行细胞计数，使血细胞计数器上的每个外方包含30-100个细胞。
注意：合适的起始稀释度为 1：100;为此，将 10 μL 细胞悬液移液到新鲜的 15 mL 锥形离心管中，并用 990 μL 无菌 PBS 稀释。将混合物上下移液数次以充分混合。 - 计数时将装有细胞原液的 50 mL 离心管放入培养箱中。
- 取干净的血细胞计数器，将干净的盖玻片放在网格上， 如图2所示。
- 将 10 μL 稀释的细胞悬液移入血细胞计数器室。如果腔室在分配所有 10 μL 之前变满，请停止移液。
- 将血细胞计数器置于光学显微镜的4倍物镜下。调整粗焦和细焦以可视化细胞。
- 计算腔室四个外角方格中的细胞数， 如图 2 所示。将四个计数相加并除以 4 以计算每个平方的平均单元格。
（一）
图 2：使用血细胞计数器进行细胞计数。 将10微升细胞悬液加入到盖玻片下方的血细胞计数器中。然后将腔室置于显微镜的4倍物镜下，并计算网格四个外角中的细胞数。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 使用公式（2）将平均计数乘以稀释因子（例如，100），然后将该数字乘以10,000，以获得每mL的细胞数。
（二） - 通过乘以细胞原液的总体积来计算储备液中的细胞总数（例如，如果将 4 个重悬的沉淀合并成 20 mL 溶液，则将细胞/mL 乘以 20）。
- 为了保持多层烧瓶，使用步骤 3.1.2 中概述的公式 （1） 计算将 1 × 107 个细胞接种回烧瓶中所需的细胞储备液体积，并执行步骤 3.1.3-3.1.6 重新接种烧瓶。如果准备好为脚手架设定种子，请继续下一部分。
（二）4. 将神经母细胞瘤细胞接种在支架上
- 准备原液细胞悬浮液
注意：该协议将概述创建四种不同接种密度的神经母细胞瘤细胞的步骤，每个密度之间的乘法因子为2。因此，将使用连续稀释从储备液中再产生三种细胞悬浮液。细胞培养工作必须在层流罩中进行，以保持无菌。- 使用公式（3）从多层烧瓶中的细胞总数（在第3.2.19节中计数）计算制备第一接种密度或细胞储备液悬浮液所需的细胞体积。
（三）
注：例如，如果 30 个支架所需的每个支架的最高接种密度为 6 个× 10 5 个细胞，每个支架接受 20 μL 细胞悬液，则储备细胞悬液将需要 1.8 × 107 个细胞（6 × 105 个细胞× 30 个支架），总体积为 600 μL（20 μL × 30 个支架）。
由于将从该制剂中进行连续稀释，因此这些数字必须加倍，即总体积为 1200 μL 的 3.6 ×10 7 个细胞。将其转换为每毫升细胞数的 WANT;将 3.6 × 107 除以 1200 μL，然后乘以 1000 μL，每毫升得到 3 个× 10个 7 个细胞。
- 将所需体积的细胞储备液加入无菌 2 mL 或 15 mL 离心管中，并用生长培养基达到 1200 μL 的最终体积。将该管标记为密度 1（图 3）。
- 使用公式（3）从多层烧瓶中的细胞总数（在第3.2.19节中计数）计算制备第一接种密度或细胞储备液悬浮液所需的细胞体积。
- 进行连续稀释以创建多个接种密度的细胞悬液。
- 从步骤4.1.1中制备的密度1中，如图3所示，通过连续稀释再制备三种密度的细胞悬液。
- 在生长培养基中将每个密度稀释 2 倍。首先，将所需的最终体积（来自上一个示例的 600 μL）添加到三个无菌 2 mL 或 15 mL 离心管中。
- 将 密度 1 的一半 （600 μL） 转移到其中一个试管中，将细胞悬液与培养基彻底混合以稀释。将此试管标记为 密度 2。
- 将 密度 2 的一半 （600 μL） 转移到下一个试管中，将细胞悬液与培养基充分混合以稀释。将该管标记为 密度 3。
- 将 密度 3 的一半 （600 μL） 转移到下一个试管中，将细胞悬液与培养基充分混合以稀释。将此管标记为 密度 4。
- 从密度 4 中弃去 600 μL，使所有四种制剂的最终体积为 600 μL。
- 作为阴性对照，仅向无菌 2 mL 离心管中加入 600 μL 生长培养基。有关连续稀释过程的示意图，请参见 图3 。
（三）
图 3：连续稀释细胞原液以制备 4 种悬浮液，用于 4 种不同的支架接种密度。 （A） 可以调整数量以适应每个支架所需的接种密度，并且 （B） 乘以每个密度的支架总数，每个支架接受 20 μL 细胞悬液。在本例中，密度 1 每个支架需要 6 × 105 个细胞，相当于 30 个支架的 600 μL 中 1.8 ×10 7 个细胞。将该数字加倍以开始连续稀释，因为随后将 600 μL 转移并在下一个试管中的 600 μL 生长培养基中稀释。这个过程一直持续到有 4 个细胞悬液，每个细胞悬液之间的系数为 2。通过仅在试管中加入 600 μL 培养基来制备阴性对照。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 将细胞悬液添加到支架中
注意：从冰箱中取出支架（储存在 PBS 中），并在添加细胞之前让它们达到室温 （RT）。- 将PBS中的支架带入层流罩中。
- 使用无菌镊子，将支架放置在非粘附的24孔板中，每孔一个支架（图1C）。轻轻抬起支架的角，然后轻轻将它们压在容器的侧面，以去除多余的 PBS。将支架皮肤面朝下（支架的闪亮层侧，面朝下进入塑料 24 孔板）的孔中心。
- 用细胞系的详细信息、相关参数（例如接种密度）和时间点标记 24 孔板。一次使用一种细胞接种密度，将剩余密度保持在37°C培养箱中，直到准备使用。
- 在层流罩中，使用P20移液器和无菌吸头将20μL相关细胞悬浮液轻轻加入到每个支架的中心（图1D）。将细胞添加到支架中时充分混合，使细胞彻底悬浮。确保悬浮液保持在支架顶部，不会滑落到孔的底部，因为这不会让细胞附着在支架上。
- 加入细胞后，将板孵育3-5小时（37°C，5%CO2和95%湿度）以使大多数细胞附着。
- 孵育后，缓慢而温和地向每个孔中加入1 mL预热的生长培养基（图1E）。使用 P1000 移液器添加培养基，以允许更缓慢和可控的运动，防止支架移位。如果使用非常多的支架，请使用 10 mL 移液器，并将移液器枪设置为“下降”和“低”。
- 将24孔板孵育过夜（37°C，5%CO2和95%湿度）。
- 支架上细胞的维护
- 在细胞附着的前24小时（第1天）后，将接种的支架转移到新的非贴壁24孔板上，并加入1-2mL新鲜生长培养基。
注意：此步骤去除掉落到塑料 24 孔板底部的细胞，而不是让它们在支架上生长。如第 5 节所述，指定为第 1 天的支架复制将在 24 小时后取下;因此，维护不适用于这些脚手架。 - 最初每 2-3 天监测一次支架，以了解生长培养基颜色的变化。随着时间的流逝和细胞在支架内的增殖，更频繁地喂养细胞。
- 使用 10 mL 移液器喷枪，在慢速模式下，取出 1 mL 用过的培养基并丢弃。如果进行需要条件培养基的实验，则将生物重复的用过的培养基收集在15mL离心管中，以340× g 离心2分钟以沉淀细胞碎片，将上清液转移到新鲜管中，并储存在-80°C。
- 轻轻地向支架中加入2mL预热的生长培养基，再次使用移液器上的滴注功能，并将24孔板放回培养箱（37°C，5%CO2和95%湿度）。每当培养基在所需生长期内花费时，重复上述步骤。
- 在细胞附着的前24小时（第1天）后，将接种的支架转移到新的非贴壁24孔板上，并加入1-2mL新鲜生长培养基。
5. 脚手架检索和应用
注：在每个时间点，可以使用多种应用来监测支架上的细胞生长或评估基因和蛋白质表达谱。支架检索的条件将取决于要执行的分析，以下各小节概述了多种检索方法， 如图 4 所示。
- 评估支架内的细胞活力
- 通过0.2μm无菌过滤器过滤到层流罩中的离心管中，对适当的细胞活力测定试剂进行灭菌。在37°C水浴中预热该无菌溶液以及完全生长培养基和无菌PBS。
- 在层流罩中，使用无菌镊子将要分析的支架转移到新鲜的 24 孔板中。在盘子上贴上所有相关细节的标签。
注意：执行分析一式三份。 - 向每个孔中加入 900 μL 预热的生长培养基，然后加入 100 μL 无菌细胞活力试剂。通过向没有支架的孔中加入 900 μL 培养基和 100 μL 无菌细胞活力试剂，包括阴性对照。盖上板上的盖子，轻轻摇动板~3分钟，使稀释的细胞活力试剂均匀分布在整个孔中。将板在37°C，5%CO2和95%湿度下孵育。
注意：需要针对每个细胞系优化孵育时间;请参阅制造商的指南。对于神经母细胞瘤细胞系，4-6小时的孵育似乎是最佳的。 - 孵育后，从培养箱中取出培养板并轻轻摇晃几秒钟。
- 在层流罩中，打开一个新的半透明 96 孔板。从 24 孔板中的每个孔中，将孵育的培养基和试剂转移到 96 孔板的三个孔中，每孔 100 μL，给予技术一式三份。
注意：这种转移将在 24 孔板的孔中留下 700 μL。 - 用铝箔覆盖 96 孔板，以保护细胞活力试剂免受光线照射。
- 从24孔板的每个支架中取出并丢弃剩余的700μL孔内容物。用 1 mL 无菌 PBS 洗涤每个支架两次。
注意： 所有颜色都不会从脚手架上移除。然后，这些支架可用于进一步的应用，例如DNA定量，方法是将它们置于0.1M碳酸氢钠（NaHCO3）溶液中的1mL 1%Triton X-100中，并将它们储存在-80°C下（参见第5.2节， 图4B）。 - 从层流罩上取下96孔板，并使用酶标仪测量每个孔在570nm和600nm波长下的吸光度。记录两个波长处的吸光度值，并按照制造商的说明计算细胞活力试剂被细胞降低的百分比。
- 使用适当的软件绘制细胞活力结果并对其进行统计分析。输入生物一式三份值以产生误差线并指示测定变异性。
- 为了检查实验时间范围内细胞活力的变化，使用适当的生物统计学软件进行单因素方差分析（ANOVA）检验，并对均值进行多次比较。
- 将图上时间点之间的显著差异表示为 ns （P>0.05）、* （P≤0.05）、** （P≤0.01）、*** （P≤0.001） 和 **** （P≤0.0001）。
图 4：在每个时间点检索用于不同分析的支架。 （A） 检索三个支架重复用于细胞活力分析。（B）然后可以将这些支架在PBS中洗涤，置于0.1M NaHCO3中的1%Triton X-100中，并储存在-80°C下进行DNA定量。（C）将另外三个重复在10%PFA中固定15分钟，在PBS中和，并储存在4°C用于组织学染色和成像。（D）最后，将3个重复样品加入到基于苯酚/胍的细胞裂解试剂中，并储存在-20°C用于基因表达分析。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲盐水;PFA = 多聚甲醛。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 从支架中细胞中定量 DNA
注：如步骤5.1.7之后的注释中所述，用于DNA定量的支架的检索包括将支架放入含有1mL 1%Triton X-100的2mL离心管中，在0.1M NaHCO3 溶液中储存，然后储存在-80°C。 在进行DNA分析之前，细胞必须经历三个冻融循环，以适当地裂解神经母细胞瘤细胞并释放DNA进行定量。- 从-80°C取出先前储存在Triton X-100中的样品。 将样品在室温下放置1-3小时或直到解冻。
- 将样品涡旋10-20秒，并将样品放回-80°C下18-24小时或直至完全冷冻。重复此过程，总共三个冻融循环。
- 为了最大限度地提高 DNA 产量，使用组织裂解器破坏支架中的细胞。
- 将金属珠放入含有Triton X-100支架的2mL离心管中，并将管置于适配器内，以50次振荡/秒振荡样品2-3分钟。
注意： 使用圆底离心管，因为金属珠可能会卡在锥底管中。
- 将金属珠放入含有Triton X-100支架的2mL离心管中，并将管置于适配器内，以50次振荡/秒振荡样品2-3分钟。
- 通过应用荧光双链 DNA （dsDNA） 染色剂来定量 Triton X-100 溶液中的 DNA，并使用酶标仪测量发射。请参阅制造商的指南;在三乙二胺四乙酸（TE）缓冲液中适当稀释样品，通过在TE缓冲液中连续稀释来制备8个dsDNA标准品（图5）。
- 在黑色不透明 96 孔板中，向孔中加入 100 μL 每种标准品或样品，一式三份。
- 在 TE 缓冲液中将荧光 dsDNA 染料稀释 200 倍，并使用多通道移液器向每个标准品/样品中加入 100 μL。用锡箔纸盖住板，在室温下孵育5分钟。
- 测量并记录每个孔在520nm处的荧光。按照制造商的指南计算每个样品中的DNA浓度。
注：如果已知所用细胞系每个细胞的 DNA 平均浓度，则可以使用公式 （4） 将 DNA 浓度值转换为细胞数。
（四） - 使用适当的软件对DNA定量结果进行图形和统计分析。输入生物一式三份值以产生误差线并指示测定变异性。
- 为了检查实验时间范围内DNA浓度/细胞数量的变化，使用适当的生物统计学软件进行单因素方差分析检验，并对均值进行多次比较。
- 在图形上将时间点之间的显著差异表示为 ns （P>0.05）、* （P≤0.05）、** （P≤0.01）、*** （P≤0.001） 和 **** （P≤0.0001）。
（四）
图 5：用于生成标准曲线的 8 种 DNA 标准品的制备。 提供 100 μg/mL 的 λDNA 储备溶液。将其在 TE 缓冲液中稀释 50 倍，以产生 2000 ng/mL 的标准品 A;然后将 400 μL A 转移到含有 400 μL TE 缓冲液的管 B 中;然后转移 400 μL B 并在 C 中稀释 2 倍，依此类推，直到 G. 标准品 H 仅由 TE 缓冲液组成，因此 DNA 浓度为 0 ng/mL。缩写：TE = Tris-EDTA。 请点击这里查看此图的较大版本.
- 制备用于组织学染色的支架
注：支架可以作为用于免疫荧光 （IF） 的整个支架或用于组织学染色或用于组织学染色或免疫组织化学 （IHC） 的福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 切片进行固定和染色用于显微镜和成像目的。这允许对支架内的细胞渗透和分布进行定性评估，并可用于评估蛋白质的表达。- 在PBS中制备10%多聚甲醛（PFA）溶液。确保有足够的溶液使每个支架的最终体积达到 500 μL。
- 将该溶液在37°C下预热，并将500μL加入标记的2mL离心管中用于支架取回。
- 从非粘附的24孔板（步骤4.4.4）中取出支架，并将其置于层流罩中。
- 使用无菌镊子，将支架转移到含有10%PFA的标记离心管中。让支架在PFA溶液中固定15分钟。通过向每个管中加入500μLPPS来中和PFA，并储存在4°C。
- 要为自动组织处理器准备支架，请将它们从4°C中取出，并使用镊子将它们放入用铅笔标有所有相关细节的塑料盒中。将所有盒式磁带放入组织处理器的金属容器中。
- 在组织处理器上开始 12 阶段方案，以固定、脱水、清除支架，并用石蜡浸润它们过夜。收集包含处理过的样品的盒式磁带。
- 接下来，将支架嵌入石蜡块中，以便将支架切片成非常薄的切片进行染色。
注意：从暗盒中取出支架并将其嵌入蜡中时，考虑支架的方向尤为重要，因为这会影响拍摄图像的角度。这在评估细胞浸润到支架中时很重要。 - 打开蜡包埋机和冷板;掀开盖子检查蜡的水平。必要时重新填充。
- 一次处理一个样品，打开暗盒，取下支架，并将其在塑料模具中居中。
- 将热蜡倒在样品上，确保保持正确的方向，并在蜡凝固之前用温热的镊子进行调整（如有必要）。倒入更多的蜡来填充模具。
- 将贴有标签的盒盖放在塑料模具的顶部，并在上面添加蜡。将模具放在冷板上，使蜡固化。在4°C下储存过夜，以确保石蜡在切片前完全固化。
- 为了准备切片，打开35°C水浴，干燥板和切片机。
- 将刀片插入支架并拧紧控制杆以将其固定。
- 设置修剪和截面厚度，脚手架截面通常为 5 毫米。
- 从模具中取出FFPE支架，将其固定在切片机正面的支架中，并在切割切片之前仔细修剪样品边缘周围的多余蜡。
- 通过旋转切片机的杠杆开始切割蜡块，确保平稳运动。
- 收集丝带状部分，一次约3个支架部分，轻轻放入35°C水浴中以去除皱纹。在水浴中用镊子轻轻分开各部分。
- 使用聚正弦涂层玻璃显微镜载玻片，将每个切片从水浴中提起，使切片位于载玻片的中心。用铅笔标记每张幻灯片。
- 将载玻片放在干燥板上或60°C干燥箱中。干燥后，将它们储存在4°C，并进行所需的组织学或IHC染色。
- 检索支架进行基因表达分析
- 从培养箱（步骤4.4.4）中取出非粘附的24孔板上的支架，并将其置于层流罩中。
- 使用无菌镊子，将支架转移到新鲜标记的 2 mL 离心管中。
- 在通风橱中，向每个试管中加入 1 mL 基于苯酚/胍的细胞裂解试剂，以裂解支架中的细胞并回收高质量 RNA。
- 将试管储存在-20°C，直到准备使用适当的试剂盒进行RNA提取。使用标准逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR）17，评估支架中细胞中的基因表达。
Representative Results
这里描述的基于胶原蛋白的支架模型有许多应用，从研究神经母细胞瘤生物学到在生理上比传统 2D 细胞培养更类似于天然肿瘤的环境中筛选抗癌疗法。在测试给定的研究问题之前，在所需的实验时间范围内获得细胞附着、增殖和浸润的完整表征至关重要。生长条件将取决于每个特定细胞系的生物学特性。重要的是，必须实施几种细胞生长评估方法，以确定最佳条件和稳健的性能。
在这里，使用比色细胞活力测定法评估在支架上生长的神经母细胞瘤细胞的活力。该测定可以在整个实验时间范围内根据需要进行。对于所描述的实验，在第 1、7 和 14 天对两种神经母细胞瘤细胞系 KellyLuc 和 IMR32 进行细胞活力评估，这些细胞系在 Coll-I-nHA 支架上以 4 种不同密度生长（图 6）。将第 1 天的活力设置为比较所有后续测量的基线。细胞活力试剂的降低速率反映了单个细胞系的细胞生物学和生长特性，包括它们的增殖速率和代谢。预计在支架上接种的细胞数量与减少水平之间存在相关性。在该实验中，正如预期的那样，在所有密度下，两种细胞系的细胞活力试剂的减少通常随着每个时间点的增加而增加。
然后分别评估两种细胞系的每种密度，以比较不同时间点的减少。使用Tukey的多重比较检验进行单因素方差分析，以检测时间点之间减少的显着差异（图7）。对于细胞系和所有接种密度，与第1天和第14天相比，细胞活力试剂的减少显著增加（P<0.05）。这表明支架上存在的代谢活性细胞显着增加。在评估 7 天间隔（第 1 天与第 7 天、第 7 天与第 14 天）时，这种增加在所有情况下都不显着，这表明优化播种密度以实现所需生长窗口的重要性。
为了支持细胞活力测定的结果，还可以通过使用荧光dsDNA染色剂定量从支架中提取的dsDNA来间接测量支架上的细胞生长（图8A）。与细胞活力一样，DNA定量可以在实验时间内根据需要进行。然而，该分析需要完全恢复支架并终止细胞生长，因此必须将其纳入实验计划，如第1节所述。在本实验中，在第 1、7 和 14 天对两种神经母细胞瘤细胞系 KellyLuc 和 IMR32 的 DNA 进行定量，这些细胞系在 Coll-I-nHA 支架上以 4 种不同密度生长。由于这些细胞系每个细胞的dsDNA平均浓度是已知的，因此可以从定量的DNA中得出每个样品的细胞数（图8B）。
与细胞活力评估相比，DNA定量在生物学重复之间产生了更高的变异性，但通常在每个时间点增加，第14天定量水平最高。IMR32细胞在Coll-I-nHA支架上的细胞数量似乎比KellyLuc细胞高，如DNA浓度所示。然后分别评估两种细胞系的每种密度，以比较不同时间点的减少。使用Tukey的多重比较检验进行单因素方差分析，以检测时间点之间减少的显着差异（图8B）。
对于细胞系和所有接种密度，与第1天和第14天相比，细胞数量均显著增加（P<0.05），但接种密度为4（1 × 105 个细胞/支架）的KellyLuc除外，该细胞在任何时间点均未显著增加。与细胞活力结果类似，在评估 7 天间隔（第 1 天与第 7 天、第 7 天与第 14 天）时，所有病例的增加并不显着。在比较细胞活力和DNA定量的时间点趋势时，两种分析之间存在一些细微差异。然而，总体上观察到类似的趋势，大多数密度的平均值在 7 天间隔之间增加。这表明使用多种方法监测细胞生长的重要性。
接下来对支架上的细胞生长形态和分布进行目视评估，包括传统的苏木精和伊红 （H&E） 染色以及 IHC。预计单个细胞系的不同生长模式将导致支架上不同的空间排列，包括不同程度的穿透到支架和细胞聚集。将支架固定福尔马林，石蜡包埋，并切成5mm切片（图9A），为多种可视化技术（包括组织学染色和IHC）准备支架。
在第1、7和14天，对在胶原基支架上生长的Kelly、KellyCis83和IMR32细胞进行常规H&E染色（图9B）。这允许在14天内可视化两个基于胶原蛋白的支架上的细胞的空间取向。顺铂敏感的Kelly细胞和耐药的KellyCis83细胞在Coll-I-nHA支架（图9B，i）和Coll-I-GAG支架（图9B，ii）上生长。与先前发表的数据一致，与侵入性较小的Kelly细胞系相比，KellyCis83细胞以更高的速度生长并更深入地渗透到两种支架组合物中。在Coll-I-nHA上生长的另一种神经母细胞瘤细胞系IMR32的H&E染色显示出对比鲜明的生长模式（图9B，iii）。在 14 天的时间里，该细胞系在胶原支架上以大而密集的簇状生长。由于胶原纤维的自发荧光，明场共聚焦显微镜可用于可视化胶原基支架的多孔结构（图9C）。
我们用靶向细胞骨架肌动蛋白的鬼笔环肽和核复染剂 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对细胞进行染色，以监测整个实验时间线中的特定细胞性状。使用这种技术在Coll-I-GAG支架上的Kelly和KellyCis83细胞中观察到丰富的肌动蛋白（图9D）。这些结果证明了如何使用多种成像技术从使用该协议在支架上生长的神经母细胞瘤细胞中获取空间分辨信息。这种对给定时期内基于胶原蛋白的支架上的细胞生长模式的表征将提高对任何下游生化测定的理解和解释。
可以分析在基于胶原蛋白的支架上生长的细胞的蛋白质表达，以将细胞活性与 体内 情况进行比较。先前发表的数据检查了在细胞单层以及 Coll-I-nHA 和 Coll-I-GAG 支架上生长的 KellyLuc 和 KellyCis83Luc 细胞表达嗜铬粒蛋白 A （CgA） 作为神经母细胞瘤的替代分泌标志物（图 10）。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）在条件培养基中评估CgA（图10A）。CgA在更具侵袭性的化疗耐药KellyCis83细胞系中的分泌速率高于Kelly（图10B，C）。在第 7 天，Coll-I-GAG 和 Coll-I-nHA 支架上均有显著差异 （P<0.05），而此时通过常规 2D 培养培养成单层生长的细胞没有显着差异。
这些结果还凸显了在单层中培养细胞时实验时间线受限，在细胞达到汇合之前，只有 7 天的生长被证明是可行的。支架上细胞的生长克服了这一限制，因为它们可以在更生理相关的条件下维持更长的时间。上述技术组合以获取有关细胞活力、DNA 含量、细胞形态和空间排列以及表达谱的信息，有助于评估神经母细胞瘤细胞在一系列基于胶原蛋白的支架上的生长。该协议也可以很容易地进行调整，以满足特定的实验要求和所需的应用。
图6：细胞活力分析。 （A） 使用比色细胞活力测定法测量基于胶原的支架上神经母细胞瘤细胞活力的一般程序。孵育期必须针对每个新细胞系进行优化，并参考制造商的指南。（B） 在第 1、7 和 14 天测量的 KellyLuc 和 IMR32 细胞在四种不同的初始接种密度下在 Coll-I-nHA 支架上生长的细胞活力试剂减少百分比。样品以生物一式三份进行评估，误差线代表标准偏差。缩写：nHA=纳米羟基磷灰石;Coll-I-nHA = 补充有 nHA 的胶原支架。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：在 Coll-I-nHA 上生长的细胞在 14 天内通过接种密度计算的细胞活力。 （A） 凯利卢克;（B） IMR32。标题细胞数是指第 0 天支架上的初始细胞接种密度。样品以生物一式三份进行评估，用一式三份的点表示，条形表示平均值。使用具有多重比较的单因素方差分析来检测三个时间点上细胞活力试剂减少百分比的显着差异，如图所示（ns P > 0.05，* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001，**** P ≤ 0.0001）。缩写：nHA=纳米羟基磷灰石;Coll-I-nHA = 补充有 nHA 的胶原支架;方差分析 = 方差分析;ns = 不显著。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：从支架中细胞中提取的 DNA 的定量。 （A） 使用荧光 dsDNA 染色剂定量在胶原基支架上生长的细胞的 dsDNA 的过程。（B） 在 14 天内通过接种密度对在 Coll-I-nHA 上生长的 KellyLuc 和 IMR32 细胞进行 DNA 定量分析的细胞数量。标题细胞数是指第 0 天将初始细胞接种密度接种到支架上。样品以生物一式三份进行评估，用一式三份的点表示，条形表示平均值。采用多重比较的单因素方差分析法检测三个时间点细胞数的显著差异，如图所示（ns P > 0.05， * P ≤ 0.05， ** P ≤ 0.01， *** P ≤ 0.001， **** P ≤ 0.0001）。缩写：nHA=纳米羟基磷灰石;Coll-I-nHA = 补充有 nHA 的胶原支架;dsDNA = 双链 DNA;TE = Tris-EDTA;方差分析 = 方差分析;ns = 不显著。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：支架免疫组化分析的组织处理步骤。 （A）用于图像分析的支架处理协议的示意图。该过程允许使用一抗和荧光标记的二抗进行常规组织学染色和特异性抗体探测。（B） 经 H&E 染色的三种神经母细胞瘤细胞系的代表性图像。在第1天，第7天，第14天拍摄H&E图像，以监测实验过程中的生长模式。比例尺 = 200 μm。虚线方块表示在左下边缘为放大的 20 倍图像选择的区域。比例尺 = 20 μm。 Kelly 和 KellyCis83 神经母细胞瘤细胞系（分别为上图和下图）在两种类型的胶原基支架上的 H&E。（iii） IMR32 细胞系的 H&E，代表 Coll-I-nHA 支架上的成簇细胞生长。（C） Kelly 细胞系的代表性图像，经明场共聚焦显微镜检查。胶原蛋白自发荧光允许多孔支架的可视化。10x 比例尺 = 200 μm，20x 比例尺 = 20 μm。 （D） 嵌入支架的代表性图像，然后通过 IHC 用鬼笔环肽和 DAPI 在 10 倍放大倍率下进行分析，比例尺 = 200 μm。较小的内部正方形表示放大图像 （20x），比例尺 = 20 μm。缩写：nHA=纳米羟基磷灰石;Coll-I-nHA = 补充有 nHA 的胶原支架;GAG = 糖胺聚糖;Coll-I-GAG = 补充有软骨素-6-硫酸盐的胶原支架;H&E = 苏木精和伊红;IHC = 免疫组化;DAPI = 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.
图 10：与 2D 塑料相比，在 3D 胶原基支架上生长的神经母细胞瘤细胞的蛋白质表达。 （A） 如何在 2D 塑料或 3D 胶原基支架上生长的细胞的条件培养基上进行 CgA ELISA 的示意图。（B） 从二维塑料单层上生长的细胞的条件培养基中获取的 CgA 蛋白表达水平。由于细胞在 7 天后达到汇合，因此 14 天的时间点不可读。到塑料第 7 天，Kelly 和 KellyCis83 细胞系之间的 CgA 水平没有显着差异。（C） 使用在胶原基支架上生长的细胞的条件培养基连续 14 天进行 CgA ELISA。在第 7 天，在两个胶原支架上，更具侵袭性的 KellyCis83 细胞系中的 CgA 水平更高，与 2D 单层相比，突出了 3D 基质中 CgA 的生理相关水平更高。该数字已根据 Curtin 等人 17 修改而来。缩写：3D=三维;2D = 二维;CgA = 嗜铬粒蛋白 A;ELISA = 酶联免疫吸附试验;nHA = 纳米羟基磷灰石;Coll-I-nHA = 补充有 nHA 的胶原支架;GAG = 糖胺聚糖;Coll-I-GAG = 补充有软骨素-6-硫酸盐的胶原支架;TMB = 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺;HRP = 辣根过氧化物酶。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
3D 支架癌细胞模型已被证明是一种有价值的多功能工具，可用于在简化的 TME32 中获得神经母细胞瘤细胞生长、活力和细胞浸润的机制见解。这里描述的 3D 神经母细胞瘤模型模拟最小的 TME，并提供比 2D 单层培养物更多的生理相关数据。3D细胞培养的一个主要缺点是实验复杂性增加，时间框架较长。这里描述的是一种优化的方案，用于在基于胶原的支架上接种、生长和维持神经母细胞瘤细胞，然后进行下游分析和应用，从而产生细胞生长的稳健表征。我们旨在深入了解支架的最佳细胞接种密度，以创建一个可预测和可控的环境，用于在快速的 14 天实验窗口中评估抗癌药物治疗。所有这些描述的简单方案的组合提供了对基于支架的 体外 培养系统中神经母细胞瘤细胞生长的全面评估。
强调了协议设置中的关键点，以使科学家能够在他们的实验室中快速建立相同的信息。例如，为了更好地进行比色细胞活力测定，指示的孵育时间允许试剂更深入地渗透到支架孔中，以到达所有细胞。此外，荧光dsDNA染色技术稳健而简单;然而，从支架中释放的DNA需要剧烈的细胞裂解，因为细胞被“捕获”在胶原纤维中。
使用所描述的简单 DNA 定量测定，我们可以使用该模型鉴定基于胶原蛋白的支架上的对数生长阶段，用于抗癌药物筛选。在所描述的实验环境中，使用了 4 种初始细胞接种密度，总周期为 14 天，分析时间点分别为 1、7 和 14 天。我们发现，在第 4 天× 105 个细胞/支架上接种的 KellyLuc 细胞在第 7 天和第 14 天之间具有最显着的活性增殖窗口。这种对数期生长数据将允许对各种细胞毒性实验进行可靠的解释。它消除了对 3D 多孔平台上的生长抑制而不是药物毒性导致生长下降或细胞死亡的猜测。细胞活力也是广泛使用的评估 3D 平台是否适合支持不同细胞类型生长的评估 33,34。虽然有许多测定方法可以测量细胞活力，包括活/死染色、ATP 测定、增殖测定，但我们发现使用 Alamar Blue 比色细胞活力测定是一种简单有效的技术来支持 DNA 定量数据。
DNA定量和细胞活力的联合使用提供了互补的证据，表明平均而言，在支架上接种细胞以实现14天内持续生长的最佳密度为2-4×105 个细胞/支架。然而，该协议可以很容易地适应不同的实验时间框架、分析时间点和下游应用。尽管该方案描述了在支架上评估神经母细胞瘤细胞的单一培养细胞生长，但支架易于修改以用作共培养的平台，由do Amaral等人描述，他们利用胶原-GAG支架在伤口愈合研究中共培养角质形成细胞和成纤维细胞35。
所描述的 3D 模型能够使用不同的众所周知的技术（例如免疫荧光和标准 H&E）可视化细胞生长和浸润。由于支架上细胞形态和生长模式的多样性，使用生化测定法可视化细胞以及表征生长非常重要。了解生长模式可以深入了解生长行为和未来对抗癌药物的反应。例如，使用 DNA 定量的 IMR32 生长产生与 Kelly 相似的模式，尽管在使用 H&E 可视化时，IMR32 的生长簇比 Kelly 大，后者显示出更分散的生长（图 9）。支架中细胞系的这些不同生长模式反映了肿瘤异质性的临床情况。在 3D 支架中使用一组具有不同形态的细胞系检查抗癌药物反应将增加患者对相同药物反应的预测价值。
如果分泌了目标蛋白，也可以使用其他方法（例如RT-qPCR或ELISA）检测基因或蛋白质表达。神经母细胞瘤进展的替代标志物嗜铬粒蛋白 A （CgA）36 用于另外表征神经母细胞瘤细胞的 3D 生长。如先前的工作17所述，随着细胞增殖，CgA分泌增加（图10）。虽然单层细胞培养无法捕捉到这种增加，因为增殖意味着细胞在培养皿中达到完全汇合，但使用 3D 胶原支架可以延长对 CgA 分泌的评估。
这种 3D 体外 模型可能不适合研究神经母细胞瘤生物学和对治疗反应的所有研究问题。其中一个局限性是支架内的细胞渗透不均匀，以及形成不同大小的细胞簇，这取决于给定的细胞系，并可能导致营养物质和测试药物的不可控扩散。这一特征会影响治疗性筛查的稳健性。然而，尽管存在这种局限性，但重要的是要考虑到天然肿瘤在大小和癌细胞分布方面也是异质的，并且在肿瘤组织内包含许多其他细胞类型。为了克服这一限制，我们建议将每个细胞填充的支架用作单个微组织，其参数将得到优化：（a）细胞活力试剂到达细胞和细胞簇的孵育时间，以及（b）通过用组织裂解器对支架上的细胞进行预处理，在Triton X-100缓冲液中裂解细胞，以释放支架深处所含细胞的DNA。
该协议的另一个技术限制是缺乏对该模型的每批新制造的脚手架的机械测试。然而，使用支架的稳健制造工艺，该工艺已广泛表征与支架的物理和化学特性有关，例如压缩和拉伸模量、孔隙率和视觉孔结构以及均匀性，确保支架质量在批次21、24、27、30、37 中保持不变。
综上所述，本文提出了一系列分析胶原基支架细胞生长的简单方法。实验时间线和分析点都可以根据具体的研究问题进行互换。该协议也适用于其他细胞类型。上述结果提供了证据，说明该方法汇编如何深入了解各种神经母细胞瘤细胞系的最佳接种密度，以在 14 天内产生连续生长。从该协议中的所有方法获得的结果的合并产生了对3D胶原基质内细胞生长的更好理解。该模型的未来使用可能涉及神经母细胞瘤TME特异性共培养系统以及各种新型抗癌药物的测试。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家儿童研究中心（NCRC），爱尔兰研究委员会（IRC）和英国神经母细胞瘤的支持。插图是使用 BioRender 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | |
| Kelly | ECACC | 82110411 | |
| KellyCis83 | Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) | - | Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | |
| Disposable | |||
| 0.22 µm syringe filter | Millex | SLHP033RS | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 100 mL sterile Pot | Starstedt | - | |
| 10 mL plastic pipette | Cellstar | 607 180 | |
| 15 mL Falcon tube | Starstedt | 62.554.502 | |
| 25 mL plastic pipette | Cellstar | 760 180 | |
| 50 mL Falcon tube | Starstedt | 62.547.254 | |
| 5 mL plastic pipette | Cellstar | 606 180 | |
| 6 mm Biopsy punches | Kai Medical | BP-60F | |
| Aluminium foil | - | - | |
| Cover Slip | Menzel-Glaser | - | |
| HYPERflask | Corning | CLS10030 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | J1840AMNT | |
| Opaque black 96-well plate | Costar | 3915 | |
| Sterile P10 tips | Starlab | S1121-3810 | |
| Sterile P1000 tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Sterile P20 tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Sterile P200 tips | Starlab | S1120-8810 | |
| T-175 (175 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3912 | |
| T-75 (75 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3911.302 | |
| Translucent clear 96 well plate | Cellstar | 655180 | |
| Translucent non-adherent 24 well plates | Cellstar | 83.3922.500 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Astell | - | |
| Automatic tissue processor | Leica | TP1020 | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | - | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | - | |
| Incubator | ThermoScientific | - | |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| Oven | Memmert | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| P10 pipette | Gilson | ||
| P100 pipette | Gilson | ||
| P1000 pipette | Gilson | ||
| P20 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| P200 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| Paraffin section flotation bath | Electrothermal | MH8517 | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Pipette electronic dispenser | Corning | StripipetterUltra | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Plate cooler | Leica | EG1140C | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Refrigerator -20 °C | Liebherr | - | |
| Refrigerator -80 °C | Liebherr | - | |
| Refrigerator 4 °C | Liebherr | - | |
| Seesaw Rocker | DLAb | SK-D1807-E | |
| Spectrophotometer – Victor3V Platereader | PerkinElmer | 1420 | |
| Tissue culture hood/Laminar flow hood | GMI | 8038-30-1044 | |
| Tissue Lyser | Qiagen | TissueLyser LT | |
| Tweezers | - | - | |
| Water bath | Grant | - | |
| Wax embedder | Leica | EG1140H | |
| Materials | |||
| 1 L Water | Adrona - Biosciences | 568 | |
| 1% Triton-X | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS tablets | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| 37% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Alamar Blue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1100 | |
| Collagen- glycosaminoglycan scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
| Collagen-nanohydroxyapatite scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
| dH20 | Adrona - Biosciences | 568 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 1.00983.2500 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
| F12 | Gibco | 21765-029 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Hemaytoxylin | Sigma-Aldrich | HHS32-1L | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| MEM | Gibco | 21090-022 | |
| miRNA easy Kit | Qiagen | 217004 | |
| MNEAA’s | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 015140-122 | |
| Qiazol | Qiagen | 79306 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| RPMI | Gibco | 21875-034 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | |
| Tissue embedding Medium | Sigma | A6330-4LB | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Software | |||
| Excel | - | Excel 2016 | |
| ImageJ | - | - | |
| Prism | - | Version 9 |
References
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Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally
