Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tredimensionel in vitro biomimetisk model af neuroblastom ved hjælp af kollagenbaserede stilladser

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62627
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 4, 3,5,6, 1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 7Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen's Green, Dublin 2, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland, 7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette papir viser de trin, der kræves for at frø neuroblastomcellelinjer på tidligere beskrevne tredimensionelle kollagenbaserede stilladser, opretholde cellevækst i en forudbestemt tidsramme og hente stilladser til flere cellevækst- og celleadfærdsanalyser og downstream-applikationer, der kan tilpasses til at tilfredsstille en række eksperimentelle mål.

Abstract

Neuroblastom er den mest almindelige ekstrakranielle solide tumor hos børn, der tegner sig for 15% af de samlede pædiatriske kræftdødsfald. Det indfødte tumorvæv er et komplekst tredimensionelt (3D) mikromiljø, der involverer lag af kræftceller og ikke-kræftceller omgivet af en ekstracellulær matrix (ECM). ECM giver fysisk og biologisk støtte og bidrager til sygdomsprogression, patientprognose og terapeutisk respons.

Dette papir beskriver en protokol til samling af et 3D-stilladsbaseret system til efterligning af neuroblastommikromiljøet ved hjælp af neuroblastomcellelinjer og kollagenbaserede stilladser. Stilladserne suppleres med enten nanohydroxyapatit (nHA) eller glycosaminoglycaner (GAG'er), der naturligt findes i høje koncentrationer i knogle og knoglemarv, de mest almindelige metastatiske steder for neuroblastom. Den 3D porøse struktur af disse stilladser tillader neuroblastom cellebinding, proliferation og migration og dannelse af celleklynger. I denne 3D-matrix afspejler celleresponsen på terapi mere in vivo-situationen .

Det stilladsbaserede kultursystem kan opretholde højere celletætheder end konventionel todimensionel (2D) cellekultur. Derfor er optimeringsprotokoller for indledende såcellenumre afhængige af de ønskede eksperimentelle tidsrammer. Modellen overvåges ved at vurdere cellevækst via DNA-kvantificering, cellelevedygtighed via metaboliske assays og cellefordeling i stilladserne via histologisk farvning.

Denne models anvendelser omfatter vurdering af gen- og proteinekspressionsprofiler samt cytotoksicitetstest ved hjælp af konventionelle lægemidler og miRNA'er. 3D-kultursystemet giver mulighed for præcis manipulation af celle- og ECM-komponenter, hvilket skaber et miljø, der mere fysiologisk ligner naturligt tumorvæv. Derfor vil denne 3D in vitro-model fremme forståelsen af sygdomspatogenesen og forbedre sammenhængen mellem resultater opnået in vitro, in vivo i dyremodeller og mennesker.

Introduction

Neuroblastom er en pædiatrisk kræft i det sympatiske nervesystem, der opstår under embryonal udvikling eller tidligt postnatalt liv på grund af transformationen af neurale kamceller1. Det er den mest almindelige solide ekstrakranielle tumor hos børn, der repræsenterer 8% af de maligniteter, der diagnosticeres hos patienter under 15 år og er ansvarlig for 15% af alle dødsfald hos børnekræft. Sygdommen viser meget heterogen klinisk adfærd på grund af specifikke kromosomale, genetiske og epigenetiske ændringer og histopatologiske træk.

Disse ændringer bidrager til aggressiviteten af neuroblastom og dårlige resultater hos pædiatriske patienter. Derfor viser de nuværende behandlinger sig ineffektive på lang sigt for næsten 80% af patienterne med den klinisk aggressive sygdom2, hvilket understreger, at behandling for denne gruppe patienter fortsat er udfordrende. Dette skyldes sandsynligvis, at mekanismerne for neuroblastom, heterogenitet og metastaser stadig ikke forstås fuldt ud. Imidlertid antages tumormikromiljøet (TME) nu bredt at spille en rolle i udviklingen af mange kræftformer; Alligevel er det stadig underundersøgt i neuroblastom 3,4.

Den oprindelige TME er et komplekst 3D-mikromiljø, der involverer kræftceller og ikke-kræftceller omgivet af en ECM. ECM refererer til den acellulære komponent i et væv, der giver strukturel og biokemisk støtte til dets cellulære beboere og bidrager til sygdomsprogression, patientprognose og terapeutisk respons5. Denne fremme af sygdomsprogression skyldes "dynamisk gensidighed" eller løbende tovejskommunikation mellem celler og ECM 6,7,8. Efterhånden som kræft skrider frem, omorganiseres stromalkollagen ofte i lineære mønstre vinkelret på stroma-cancer-grænsefladen, som kræftceller bruger som migrationsrute til metastase 9,10,11.

Hovedkomponenterne i dette indfødte funktionelle biologiske stillads inkluderer et fibrøst netværk af kollagener type I og II og andre proteiner, herunder elastin, glycoproteiner såsom laminin samt en række proteoglycaner og andre opløselige komponenter12,13. Disse proteiner fra den oprindelige ECM er nu blevet attraktive naturlige biomolekyler til udvikling af 3D in vitro modeller3. Anvendelsen af 3D-stilladser til in vitro-cellekultur er stigende i popularitet på grund af dens større fysiologiske repræsentation af TME sammenlignet med traditionel 2D-monolagskultur. De fremstillede 3D-stilladser hjælper cellebinding, spredning, migration, metabolisme og respons på stimuli set i in vivo biologiske systemer.

Hovedkomponenten i disse 3D-stilladser er kollagen, som er en nøglespiller i mange normale biologiske processer, herunder vævsreparation, angiogenese, vævsmorfogenese, celleadhæsion og migration11. Kollagenbaserede 3D-matricer har vist deres robuste funktionalitet til at modellere ECM, der fungerer som et in vitro biomimetisk mikromiljø, samtidig med at de muliggør celle-ECM-interaktioner samt cellemigration og invasion. Disse 3D-matricer giver også en mere nøjagtig analyse af cellerespons på kemoterapeutiske lægemidler end traditionel 2D eller "flad" kultur i mange kræftmodeller 14,15,16, herunder neuroblastom 17,18. Genetisk analyse af 3D-cellekulturer har rapporteret en højere korrelation med den humane vævsprofil, selv sammenlignet med dyremodeller19. Samlet set er hjørnestenen i disse 3D-stilladser at give celler et passende in vitro-miljø, som rekapitulerer den oprindelige vævsarkitektur og letter tovejs molekylær krydstale8.

For at øge kompleksiteten af kollagenbaserede modeller inkorporeres andre almindelige ECM-komponenter i vævsteknologiprocessen, hvilket skaber mere fysiologisk relevante modeller til at afspejle niche-TME'er i forskellige væv. For eksempel letter GAG'er, negativt ladede polysaccharider, der findes i alle pattedyrvæv20, cellebinding, migration, proliferation og differentiering. Chondroitinsulfat er en specifik type GAG, der findes i knogle og brusk, som tidligere har været anvendt i vævstekniske applikationer til knoglereparation 21,22,23,24,25. Nanohydroxyapatit (nHA) er den vigtigste uorganiske bestanddel af mineralsammensætningen i humant knoglevæv, der udgør op til 65 vægtprocent af knoglen26 og derfor i vid udstrækning anvendes til knogleudskiftning og regenerering27. GAG'er og nHA er således attraktive kompositter til rekonstruktion af det primære neuroblastom ECM og modellering af de mest almindelige metastatiske steder for neuroblastom, knoglemarv (70,5%) og knogle (55,7%)28.

Stilladser, der indeholder disse ECM-komponenter, blev oprindeligt udviklet til knoglevævstekniske applikationer med omfattende analyse af deres biokompatibilitet, toksicitet og osteokonduktive og osteoinduktive egenskaber29,30. De er porøse, kollagenbaserede matricer produceret ved hjælp af frysetørringsteknikker til at kontrollere deres fysiske og biologiske egenskaber. Kollagenstilladserne suppleret med enten nHA (Coll-I-nHA) eller chondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) viste succes med at efterligne den primære TME i brystkræft31 og metastase til knogle i prostatacancer15 samt neuroblastom17. Den frysetørringsteknik, der anvendes til fremstilling af disse sammensatte stilladser, giver reproducerbar homogenitet i porestørrelse og porøsitet inden for stilladserne22,23,24. Kort fortalt fremstilles en kollagensopslæmning (0,5 vægt%) ved at blande fibrillært kollagen med 0,05 M eddikesyre. For Coll-I-GAG tilsættes 0,05 vægt% chrondoitin-6-sulfat isoleret fra hajbrusk til kollagenopslæmningen under blanding. Til de sammensatte Coll-I-nHA-stilladser syntetiseres hydroxyapatitpartikler i nanostørrelse som tidligere beskrevet27 og tilsættes til kollagensopslæmningen i forholdet 2: 1 til vægten af kollagen under blandingsprocessen. Alle stilladser er fysisk tværbundet og steriliseret ved hjælp af en dehydrotermisk behandling ved 105 °C i 24 timer25. Cylindriske stilladser (6 mm diameter, 4 mm højde) opnås ved hjælp af en biopsistans og kan kemisk tværbindes med 3 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid og 5,5 mM N-hydroxysuccinimid (EDAC / NHS) i destilleret vand (dH2O) for at forbedre konstruktionernes mekaniske egenskaber30. Denne veloptimerede fremstillingsproces af to kollagenstilladser skaber stilladser med reproducerbare mekaniske egenskaber, herunder porestørrelse, porøsitet og stivhed (kPa). Både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stilladser har forskellige fysiske egenskaber, hvilket skaber forskellige miljøforhold. Egenskaberne for hvert stillads er vist i tabel 1.

Coll-I-GAG Coll-I-nHA
Stillads størrelse
(diameter [mm] x højde [mm])		 6 x 4 17 6 x 4 17
Kollagenkoncentration (vægtprocent) 0.5 17 0.5 17
Substratkoncentration (vægtprocent)
[baseret på vægten af kollagen]		 0,05 15,17 200 17
Gennemsnitlig porestørrelse (mm) 96 22 96 – 120 29
Porøsitet (%) 99,5 23 98,9 – 99,4 27
Stivhed (kPa) 1.5 27 5,5 - 8,63 29

Tabel 1: Oversigt over de mekaniske egenskaber af de to stilladser, der er vedtaget til undersøgelse af neuroblastombiologi.

Dette papir beskriver en protokol til samling af et 3D-stilladsbaseret system for bedre at efterligne neuroblastommikromiljøet ved hjælp af neuroblastomcellelinjer og tidligere beskrevne kollagenbaserede stilladser suppleret med enten nHA (Coll-I-nHA) eller chondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollen inkluderer downstream-metoder til at analysere neuroblastomcellernes vækstmekanismer i et mere fysiologisk relevant miljø ved hjælp af tidligere optimerede billige metoder tilpasset fra 2D-monolagskultur figur 1.

Figure 1
Figur 1: Samlet protokolarbejdsgang. (A) Celler dyrkes til tilstrækkeligt antal, opdeles, tælles og resuspenderes i et passende volumen medium. (B) Denne cellestamme gennemgår derefter seriel fortynding for at fremstille i alt 4 cellesuspensioner med forskellige densiteter. (C) Kollagenbaserede stilladser er sterilt belagt i ikke-klæbende plader med 24 brønde, og (D) 20 μL cellesuspension tilsættes til midten af hvert stillads og efterlades til inkubation ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed i 3-5 timer. (E) Komplet vækstmedium (1 ml) tilsættes derefter langsomt til hvert stillads, og pladerne placeres tilbage i inkubatoren for at tillade cellevækst i den ønskede tidsramme. (F) På hvert forudbestemt tidspunkt hentes flere stilladser til cellelevedygtighed og vækstvurdering, genekspressionsanalyse og histologisk farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Eksperimentelt design

BEMÆRK: Antallet af stilladser og celler, der er nødvendige for hvert eksperiment, afhænger af eksperimentets omfang og kan beregnes ved hjælp af værktøjerne i dette afsnit om eksperimentelt design.

  1. Antal stilladser, der kræves
    1. Bestem den samlede eksperimentelle tidslinje og vurderingsintervaller for ændringer i cellebiologi (fx cellevækst og metabolisme).
      BEMÆRK: For eksempel er den eksperimentelle tidsramme 14 dage med en vurdering af cellevækst hver 7. dag. Således er de eksperimentelle tidspunkter dage 1, 7, 14, hvilket giver i alt 3 tidspunkter.
    2. Derefter skal du bestemme antallet af eksperimentelle applikationer, der skal anvendes på hvert tidspunkt. Prøv at gennemføre de samme analyser på hvert tidspunkt for at overvåge ændringerne.
      BEMÆRK: Typiske analyser af cellevækst på stilladser inkluderer cellelevedygtighedsassays, DNA-kvantificering, histologisk farvning og billeddannelse og genekspressionsanalyse. Disse vil blive behandlet yderligere i afsnit 5.
    3. Beslut, hvornår det samme stillads skal anvendes til flere downstream-applikationer, f.eks. efter vurdering af cellelevedygtighed ved hjælp af et passende assay, genbrug stilladset til DNA/RNA-isolering (diskuteret i 5.1.11).
    4. Opbevar mindst 3 biologiske replikater til hver applikation, fx 3 stilladser til cellelevedygtighed og DNA-kvantificering, 3 til histologi og 3 til genekspressionsanalyse. Da dette svarer til 9 stilladser pr. Tidspunkt, skal du planlægge at bruge 27 stilladser til 3 tidspunkter.
    5. Til sidst multipliceres dette tal med antallet af eksperimentelle parametre eller betingelser (f.eks. Vurdering af flere cellelinjer, indledende såtætheder, stilladssammensætninger).
      BEMÆRK: I denne protokol blev 4 forskellige indledende såtætheder vurderet for en cellelinje, hvilket resulterede i 108 (27 stilladser x 4 betingelser) stilladser påkrævet. For at tage højde for menneskelige fejl og give ekstra dækning skal du tilføje ~ 10% til dette antal, f.eks. Hvis der kræves 108 stilladser, skal du forberede 120 stilladser.
  2. Antal celler, der kræves
    BEMÆRK: Et volumen cellesuspension på 20 μL anbefales til såning af celler på et cylindrisk stillads (diameter 6 mm, højde 4 mm) på dag 0. Antallet af celler pr. denne 20 μL cellesuspension justeres i overensstemmelse med forsøgsdesignet, beregnet i punkt 1.1. En almindelig indledende såtæthed er 2 × 105 celler pr. 20 μL, der anvendes som et eksempel på nedenstående protokol.
    1. For at beregne den samlede mængde celler, der kræves til eksperimentet, multipliceres de første 2 × 105 celler pr. 20 μL med det krævede antal stilladser.
      BEMÆRK: For eksempel giver 30 stilladser ganget med 20 μL et samlet volumen på 600 μL. Hvis hvert stillads kræver 2 × 10 5 celler, indeholder 600 μL suspension i alt 6 × 10 6 celler (2 × 105 × 30), hvilket giver et endeligt behov på 6 × 106 celler i 600 μL. Antallet af eksperimentelle parametre dikterer det samlede antal celler, der kræves. Denne protokol skitserer derfor cellekultur ved hjælp af en flerlags cellekulturkolbe, som kan håndtere det samme antal celler som 10 traditionelle 175 cm2-kolber.

2. Forberedelse af kollagenbaserede stilladser

BEMÆRK: Coll-I-nHA og Coll-I-GAG cylindriske stilladser (diameter 6 mm, højde 4 mm) fremstilles ved hjælp af etablerede metoder 15,21,27. Når stilladserne er kemisk tværbundet i henhold til tidligere offentliggjorte metoder17, skal de bruges inden for 1 uge.

  1. Efter fremstillingen af stilladserne med de ønskede mekaniske egenskaber skal du sørge for, at stilladserne er fuldt hydreret og grundigt vasket i fosfatbufret saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Dette tager normalt ~ 12 timer efter tværbinding af stilladserne og kan udføres i 100 ml affaldsbeholdere til vævskultur ved 4 ° C med maksimalt 50 stilladser pr. Container og 2 ml PBS pr. Stillads.
  2. Opbevar stilladserne i PBS ved 4 °C, indtil de er klar til brug.

3. Formere neuroblastomceller i en flerlags cellekulturkolbe

BEMÆRK: Den optimale såtæthed for flerlagskolben varierer. For kolben, der anvendes i dette eksperiment, er den optimale densitet i henhold til producentens anvisninger 1 × 107 celler. Inden flerlagskolben sås, formeres cellerne til en massefylde på 1 × 10,7 celler eller derover i en egnet vævskulturkolbe (f.eks. en T175cm2-vævskulturkolbe). For at frø celler i flerlagskolben (afsnit 3.1) dyrkes de, indtil 70-80% sammenflydes, høstes og tælles antallet af celler pr. ml under henvisning til trin 3.2.16-3.2.20 til udførelse af celletællingen. Når cellesuspensionen er talt, fortsættes straks til såningen af flerlagskolben. Cellekulturarbejde skal udføres i en laminær strømningshætte for at opretholde sterilitet.

  1. Såning af flerlagscellekulturkolben
    1. Forvarm 550 ml komplet vækstmedium (varierer afhængigt af den anvendte cellelinje) og 100 ml steril PBS i et 37 °C vandbad i 20 min.
    2. Ved hjælp af den høstede cellesuspension beregnes det krævede volumen af cellesuspensionen, der er nødvendig for at opnå den optimale såtæthed på 1 × 107 celler ved hjælp af ligning (1), hvor WANT henviser til antallet af celler, der kræves til såning af flerlagskolben, og HAVE henviser til antallet af celler / ml i cellesuspensionen:
      Equation 1(1)
      fx. Equation 2
    3. Det krævede volumen af cellesuspensionen tilsættes til 100 ml af det forvarmede vækstmedium.
    4. Tag en ny flerlagskolbe i emhætten, fjern hætten, og hold kolben i en vinkel på 60°. Alle 100 ml af celleopslæmningen pipetteres langsomt ned i kolben ned langs den vinklede side af halsen. Kolben lukkes og placeres på siden, så cellerne kan fordele sig jævnt gennem lagene.
    5. I en vinkel på 60° tilsættes 400 ml af det forvarmede vækstmedium til flerlagskolben ved langsomt at hælde eller pipettere ned ad den vinklede side af halsen. Hvis halsen bliver fuld, sættes kolben tilbage i lodret stilling eller kolben sættes på låg og anbringes på siden, inden den vender tilbage til hældningen.
      BEMÆRK: Hæld langsomt for at undgå overdreven bobledannelse. Bank let kolben i lodret position for at lade alle bobler stige til toppen, og fjern dem med en 10 ml pipette. Sørg for, at kolben er fyldt til den nederste tråd i nakken; Tilføj mere medium, hvis det er nødvendigt, for at opnå dette.
    6. Flerlagskolben lukkes og inkuberes med den vinklede hals nedad ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fugtighed.
    7. Kontroller væksten hver 2-3 dage for sammenløb. For at kontrollere sammenløbet af de to nederste lag af flerlagskolben skal du se dem under en 4x objektiv linse i et omvendt mikroskop.
      BEMÆRK: Når den er podet med 1 × 107 neuroblastomceller, vil 10-lagskolben typisk tage en uge at blive sammenflydende - selvom dette kan variere afhængigt af den anvendte cellelinje.
  2. Rutinemæssig vedligeholdelse af celler i flerlagskolben
    1. Forvarm 550 ml komplet vækstmedium (varierer afhængigt af den anvendte cellelinje), 50-100 ml trypsin og 300 ml steril PBS i et 37 °C vandbad i 20 minutter.
    2. Kontroller flerlagskolben for 70-80% sammenløb.
    3. Flerlagskolben anbringes i en laminar strømningshætte, og det brugte substrat kasseres fra kolben ved hældning. Vip først kolben, så mediet hældes over luftdæmningen i en affaldsbeholder. Kolben drejes 180° under hældningen, indtil mediet løber ned ad kolbens vinklede hals. Kolben drejes frem og tilbage langs denne akse for at fjerne eventuel resterende væske.
    4. Cellerne vaskes ved at tilsætte 100 ml forvarmet steril PBS langsomt ned ad den vinklede hals. Kolben lukkes af, anbringes på siden for at muliggøre en ensartet fordeling af PBS, og kolben drejes frem og tilbage for at vaske cellerne.
    5. PBS-vasken kasseres på samme måde som 3.2.3. Gentag vasketrinnene.
    6. 50 ml forvarmet trypsin fortyndes i 50 ml forvarmet steril PBS. Der tilsættes 100 ml fortyndet trypsinopløsning til flerlagskolben, hætten, og kolben anbringes på siden for at muliggøre en ensartet fordeling af trypsinet. Hvis cellelinjen er meget klæbende, skal du bruge 100 ml ufortyndet trypsin.
    7. Kolben inkuberes i 2-5 minutter ved 37 °C, 5% CO2 og 95 % fugtighed, idet celleløsningen overvåges under mikroskopet. Bank om nødvendigt kolben fast for at hjælpe med frigørelse eller læg den tilbage i inkubatoren i endnu et minut.
    8. Flerlagskolben anbringes i en laminær strømningshætte, og trypsinet neutraliseres med 100 ml vækstmedium. Sæt kolben på, læg den på siden, og rock frem og tilbage for at sikre fuldstændig neutralisering.
    9. Den neutraliserede cellesuspension hældes af i 4 x 50 ml koniske centrifugeglas.
      BEMÆRK: Hvis der kræves fuldstændig cellehøst, vaskes flerlagskolben igen med 100 ml steril PBS og hældes af i 2 x 50 ml centrifugeglas.
    10. Centrifuger cellesuspensionen i 50 ml centrifugeglas ved 340 × g i 3-4 minutter for at pelletere cellerne.
    11. Sæt centrifugeglassene tilbage i laminar strømningshætten, og kassér forsigtigt så meget supernatant som muligt fra hver pille.
      BEMÆRK: Pillen vil være stor og relativt løs og kan derfor let forstyrres.
    12. Tilsæt 1-5 ml vækstmedium til hver pellet og resuspender det ved pipettering op og ned flere gange.
    13. Saml de 4 opslæmmede pellets i et 50 ml centrifugerør, bland dem grundigt med pipetten, og noter det samlede volumen.
    14. Foretag en passende fortynding af cellesuspensionen til celletælling, så hver ydre firkant på hæmocytometeret indeholder 30-100 celler.
      BEMÆRK: En passende startfortynding er 1:100; til dette pipette 10 μL af cellesuspensionen i et frisk 15 ml konisk centrifugerør og fortynd det med 990 μL sterilt PBS. Pipetter blandingen op og ned flere gange for at blande grundigt.
    15. Anbring et 50 ml centrifugerør indeholdende cellestammen i inkubatoren, mens du tæller.
    16. Tag et rent hæmocytometer, placer et rent dæksel over gitteret, som vist i figur 2.
    17. Der pipetteres 10 μL af den fortyndede cellesuspension i hæmocytometerkammeret. Hvis kammeret bliver fyldt, før alle 10 μL er dispenseret, skal pipetteringen stoppes.
    18. Placer hæmocytometeret under 4x målet for et lysmikroskop. Juster det grove og fine fokus for at visualisere cellerne.
    19. Tæl antallet af celler i kammerets fire ydre hjørnefirkanter som fremhævet i figur 2. Tilføj de fire tællinger, og divider med 4 for at beregne gennemsnittet af celler pr. Kvadrat.

Figure 2
Figur 2: Celletælling ved hjælp af et hæmocytometer. Ti mikroliter cellesuspension tilsættes til hæmocytometeret under dæksedlen. Kammeret placeres derefter under 4x objektivlinsen i et mikroskop, og antallet af celler i de fire ydre hjørner af gitteret tælles. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Multiplicer gennemsnitstallet med fortyndingsfaktoren (f.eks. 100) og gang dette tal med 10.000 for at opnå antallet af celler pr. ml ved hjælp af ligning (2).
    Equation 3 (2)
  2. Beregn det samlede antal celler i stamopløsningen ved at gange med det samlede volumen af cellestammen (f.eks. hvis de 4 resuspenderede pellets samlet udgjorde en 20 ml opløsning, multipliceres celler / ml med 20).
  3. For at bevare flerlagskolben anvendes ligning (1) som beskrevet i trin 3.1.2 til beregning af det nødvendige volumen cellemateriale til såning af 1 × 107 celler tilbage i kolben og udførelse af trin 3.1.3-3.1.6 for at genså kolben. Hvis du er klar til at frø stilladserne, skal du fortsætte til næste afsnit.

4. Frø neuroblastomceller på stilladser

  1. Forberede suspension af stamceller
    BEMÆRK: Denne protokol skitserer trinene til oprettelse af fire forskellige såtætheder af neuroblastomceller med en multiplikationsfaktor på 2 mellem hver tæthed. Der vil derfor blive anvendt en seriel fortynding til at skabe yderligere tre cellesuspensioner fra stamsuspensionen. Cellekulturarbejde skal udføres i en laminær strømningshætte for at opretholde sterilitet.
    1. Der anvendes ligning (3) til beregning af det cellevolumen, der er nødvendigt ud fra det samlede antal celler i flerlagskolben (talt i punkt 3.2.19) til forberedelse af den første såtæthed eller cellestamsuspension.
      Equation 4(3)
      BEMÆRK: For eksempel, hvis den højeste såtæthed er 6 × 10 5 celler pr. stillads, der kræves til 30 stilladser, hvor hvert stillads modtager 20 μL cellesuspension, vil stamcellesuspensionen kræve 1,8 × 107 celler (6 × 105 celler × 30 stilladser) i et samlet volumen på 600 μL (20 μL × 30 stilladser).
      Da en seriel fortynding vil blive udført fra dette præparat, skal disse tal fordobles, dvs. 3,6 × 107 celler i et samlet volumen på 1200 μL. For at konvertere dette til WANT i celler pr. ml; divider 3,6 × 10 7 med 1200 μL og multiplicer med 1000 μL, hvilket giver 3 × 107 celler pr. ml.
      ​Equation 5
    2. Tilsæt det nødvendige volumen cellemateriale til et sterilt 2 ml eller 15 ml centrifugeglas og bring til et slutvolumen på 1200 μL med vækstmedium. Mærk dette rør som densitet 1 (figur 3).
  2. Udfør seriel fortynding for at skabe flere podningsdensitetscellesuspensioner.
    1. Fra densitet 1 fremstillet i trin 4.1.1 fremstilles yderligere tre densiteter af cellesuspension gennem seriel fortynding i henhold til figur 3.
    2. Hver densitet fortyndes med en faktor på 2 i vækstmediet. Først tilsættes det krævede slutvolumen (600 μL fra det foregående eksempel) vækstmedium til tre sterile 2 ml eller 15 ml centrifugeglas.
    3. Halvdelen af densiteten 1 (600 μL) overføres til et af rørene, og cellesuspensionen blandes grundigt med mediet for at fortynde. Mærk dette rør som densitet 2.
    4. Halvdelen af densiteten 2 (600 μL) overføres til det næste glas, og cellesuspensionen blandes grundigt med mediet for at fortynde. Mærk dette rør som densitet 3.
    5. Halvdelen af densiteten 3 (600 μL) overføres til det næste rør, og cellesuspensionen blandes grundigt med mediet for at fortynde. Mærk dette rør som densitet 4.
    6. 600 μL kasseres fra massefylde 4, således at alle fire præparater har et slutvolumen på 600 μl.
    7. Som negativ kontrol tilsættes kun 600 μL vækstmedium til et sterilt 2 ml centrifugeglas. Se figur 3 for et skema over den serielle fortyndingsproces.

Figure 3
Figur 3: Seriel fortynding af cellemateriale til forberedelse af 4 suspensioner til 4 forskellige stilladssåtætheder. (A) Tallene kan justeres, så de passer til den ønskede såtæthed pr. stillads og (B) ganges med det samlede antal stilladser pr. tæthed, hvor hvert stillads modtager 20 μL cellesuspension. I dette eksempel kræver densitet 1 6 × 105 celler pr. stillads, svarende til 1,8 × 107 celler i 600 μL til 30 stilladser. Dette tal fordobles for at starte den serielle fortynding, da 600 μL derefter overføres og fortyndes i 600 μL vækstmedium i det næste rør. Denne proces fortsætter, indtil der er 4 cellesuspensioner med en faktor på 2 mellem hver. En negativ kontrol foretages ved kun at tilsætte 600 μL medium til et rør. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Tilføjelse af celleophæng til stilladserne
    BEMÆRK: Fjern stilladserne (opbevaret i PBS) fra køleskabet, og lad dem komme til stuetemperatur (RT), før cellerne tilsættes.
    1. Før stilladserne i PBS ind i laminar flow-emhætten.
    2. Brug sterile pincetter til at placere stilladserne i ikke-klæbende plader med 24 brønde med et stillads pr. Brønd (figur 1C). Løft forsigtigt stilladserne i hjørnerne, og tryk dem let mod siden af beholderen for at fjerne overskydende PBS. Tilføj stilladserne i midten af brøndene med skindsiden nedad (stilladsets skinnende lagside, der vender ned i plastpladerne med 24 brønde).
    3. Mærk pladerne med 24 brønde med detaljer om cellelinjen, relevante parametre (f.eks. Såtæthed) og tidspunkter. Der arbejdes med én cellesåtæthed ad gangen, og de resterende tætheder opbevares i 37 °C-inkubatoren, indtil de er klar til brug.
    4. I laminar flow-emhætten skal du bruge en P20-pipette og sterile spidser til forsigtigt at tilføje 20 μL af den relevante cellesuspension til midten af hvert stillads (figur 1D). Hold cellerne grundigt i suspension ved at blande godt, mens du tilføjer cellerne til stilladserne. Sørg for, at affjedringen forbliver oven på stilladset og ikke glider ud på bunden af brønden, da dette ikke tillader cellefastgørelse til stilladset.
    5. Når cellerne er tilsat, inkuberes pladerne i 3-5 timer (37 °C, 5% CO2 og 95% fugtighed) for at lade de fleste celler binde sig.
    6. Efter inkubation tilsættes langsomt og forsigtigt 1 ml forvarmet vækstmedium til hvert hul (figur 1E). Brug en P1000-pipette til at tilføje mediet for at give mulighed for mere langsom og kontrolleret bevægelse, hvilket forhindrer forskydning af stilladserne. Hvis du arbejder med et meget stort antal stilladser, skal du bruge en 10 ml pipette med pipettepistolen indstillet til 'drop' og 'low'.
    7. Pladerne med 24 brønde inkuberes natten over (37 °C, 5 % CO2 og 95 % fugtighed).
  2. Vedligeholdelse af celler på stilladserne
    1. Efter de første 24 timers cellefastgørelse (dag 1) overføres de frøede stilladser til nye ikke-klæbende plader med 24 brønde, og der tilsættes 1-2 ml frisk vækstmedium.
      BEMÆRK: Dette trin fjerner celler, der er faldet til bunden af plastpladerne med 24 brønde i stedet for at lade dem vokse på stilladserne. Stilladsreplikater, der er udpeget som dag 1, tages ned efter 24 timer, som beskrevet i afsnit 5; Derfor gælder vedligeholdelse ikke for disse stilladser.
    2. Overvåg stilladserne oprindeligt hver 2-3 dage for en ændring i vækstmediets farve. Efterhånden som tiden skrider frem, og cellerne spredes inden for stilladserne, skal du fodre cellerne oftere.
    3. Brug en 10 ml pipettepistol til at fjerne 1 ml af det brugte medium i langsom tilstand og kassere. Hvis der udføres forsøg, der kræver konditioneret medium, opsamles det brugte substrat af biologiske replikater i et 15 ml centrifugeglas, centrifugeres ved 340 × g i 2 minutter for at pelletere celleaffaldet, supernatanten overføres til et frisk glas og opbevares ved -80 °C.
    4. Tilsæt forsigtigt 2 ml forvarmet vækstmedium til stilladserne ved hjælp af drypfunktionen igen på pipetten, og returner 24-brøndpladen til inkubatoren (37 °C, 5% CO2 og 95 % fugtighed). Gentag hver gang mediet bruges i løbet af den ønskede vækstperiode.

5. Stilladshentning og applikationer

BEMÆRK: På hvert tidspunkt kan flere applikationer bruges til at overvåge cellevækst på stilladserne eller vurdere gen- og proteinekspressionsprofiler. Betingelserne for udtagning af stilladser afhænger af den analyse, der skal udføres, med flere hentningsmetoder, der er skitseret i de følgende underafsnit og demonstreret i figur 4.

  1. Vurdering af cellelevedygtighed i stilladser
    1. Det relevante celleremisitetsassayreagens steriliseres ved filtrering gennem et 0,2 μm sterilt filter ind i et centrifugerør i laminar flowhætten. Denne sterile opløsning forvarmes sammen med komplet vækstmedium og steril PBS i et 37 °C vandbad.
    2. I laminar strømningshætte skal du bruge sterile pincet til at overføre stilladserne, der skal analyseres, til en frisk plade med 24 brønde. Mærk pladen med alle relevante detaljer.
      BEMÆRK: Udfør analysen i tre eksemplarer.
    3. Der tilsættes 900 μL af det forvarmede vækstmedium til hvert hul efterfulgt af 100 μL af det sterile cellelevedygtighedsreagens. Der tilsættes en negativ kontrol ved tilsætning af 900 μL medium og 100 μL af det sterile cellelevedygtighedsreagens til et hul uden stillads. Sæt låget på pladen igen, og vip forsigtigt pladen i ~3 minutter for jævnt at fordele det fortyndede cellelevedygtighedsreagens i hele brønden. Pladen inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 95 % fugtighed.
      BEMÆRK: Inkubationstider skal optimeres for hver cellelinje; Se producentens retningslinjer. For neuroblastomcellelinjer forekommer 4-6 timers inkubation optimal.
    4. Efter inkubation skal du fjerne pladen fra inkubatoren og forsigtigt vippe den i et par sekunder.
    5. I den laminære strømningshætte skal du åbne en ny, gennemskinnelig plade med 96 brønde. Fra hvert hul i 24-brøndspladen overføres det inkuberede medium og reagenset til tre brønde i 96-brøndpladen med 100 μL pr. brønd, hvilket giver tekniske triplikater.
      BEMÆRK: Denne overførsel efterlader 700 μL i brøndene på 24-brøndpladen.
    6. Dæk 96-brøndpladen i aluminiumsfolie for at beskytte cellelevedygtighedsreagenset mod lys.
    7. Fjern og kassér de resterende 700 μL af brøndindholdet fra hvert stillads i 24-brøndspladen. Hvert stillads vaskes to gange med 1 ml sterilt PBS.
      BEMÆRK: Alle farver fjernes ikke fra stilladserne. Disse stilladser kan derefter anvendes til yderligere anvendelser, f.eks. DNA-kvantificering, ved at placere dem i 1 ml 1 % Triton X-100 i 0,1 M natriumbicarbonatopløsning (NaHCO3) og opbevare dem ved -80 °C (se afsnit 5.2, figur 4B).
    8. 96-brøndpladen fjernes fra laminar strømningshætten, og absorbansen af hvert hul måles ved bølgelængder på 570 nm og 600 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Absorbansværdierne registreres ved begge bølgelængder, og fabrikantens anvisninger følges for at beregne cellernes procentvise reduktion af cellernes cellelevedygtighedsreagens.
    9. Graf og analyser statistisk cellelevedygtighedsresultaterne ved hjælp af passende software. Indtast biologiske tredobbelte værdier for at frembringe fejlbjælker og angive analysevariabiliteten.
    10. For at undersøge ændringer i cellelevedygtighed over den eksperimentelle tidsramme skal du udføre en envejsanalyse af varians (ANOVA) test med flere sammenligninger af midlerne ved hjælp af passende biostatistisk software.
    11. Angiv signifikante forskelle mellem tidspunkterne på grafer som ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) og **** (P≤0,0001).

Figure 4
Figur 4: Udtagning af stilladser til forskellige analyser på hvert tidspunkt. (A) Tre stilladsreplikater udtages til analyse af cellelevedygtighed. (B) Disse stilladser kan derefter vaskes i PBS, anbringes i 1% Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3 og opbevares ved -80 °C til DNA-kvantificering. (C) Yderligere tre replikater fikseres i 10% PFA i 15 minutter, neutraliseres i PBS og opbevares ved 4 °C til histologisk farvning og billeddannelse. D) Endelig tilsættes 3 replikater til et phenol/guanidinbaseret cellelysereagens og opbevares ved -20 °C til genekspressionsanalyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvand; PFA = paraformaldehyd. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Kvantificering af DNA fra cellerne i stilladserne
    BEMÆRK: Som nævnt i noten efter trin 5.1.7 indebærer udtagning af stilladserne til DNA-kvantificering placering af stilladserne i 2 ml centrifugerør indeholdende 1 ml 1% Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3-opløsning efterfulgt af opbevaring ved -80 °C. Før DNA-analyse kan udføres, skal cellerne gennemgå tre fryse-optøningscyklusser for at lyse neuroblastomcellerne korrekt og frigive DNA til kvantificering.
    1. De prøver, der tidligere har været opbevaret i Triton X-100, fjernes fra -80 °C. Lad prøverne stå ved RT i 1-3 timer eller indtil de er optøet.
    2. Vortex prøverne anbringes i 10-20 s, og prøverne anbringes igen ved -80 °C i 18-24 timer eller indtil de er helt frosne. Gentag denne proces i i alt tre fryse-optøningscyklusser.
    3. For at maksimere DNA-udbyttet skal du bruge en vævslyser til at forstyrre cellerne i stilladserne.
      1. Anbring en metalperle i 2 ml centrifugerøret, der indeholder et stillads i Triton X-100, og placer røret i adapteren for at ryste prøven ved 50 svingninger/sekund i 2-3 minutter.
        BEMÆRK: Brug rundbundede centrifugerør, da metalperlen kan sætte sig fast i et konisk rør.
    4. Kvantificer DNA'et i Triton X-100-opløsningen ved at påføre en fluorescerende dobbeltstrenget DNA-plet (dsDNA) og mål emissionen ved hjælp af en mikropladelæser. Se producentens retningslinjer; prøverne fortyndes passende i Tris-ethylendiamintetraeddikesyrebuffer (TE) for at fremstille 8 dsDNA-standarder gennem seriel fortynding i TE-buffer (figur 5).
    5. I sorte, uigennemsigtige plader med 96 brønde tilsættes 100 μL af hver standard eller prøve til hullerne i teknisk tredobbelt form.
    6. Fortynd den fluorescerende dsDNA-plet 200 gange i TE-buffer og tilsæt 100 μL til hver standard/prøve ved hjælp af en multikanalpipette. Dæk pladen i stanniol og inkuber ved RT i 5 min.
    7. Fluorescensen af hvert hul måles og registreres ved 520 nm. Følg producentens retningslinjer for at beregne koncentrationen af DNA i hver prøve.
      BEMÆRK: Hvis den gennemsnitlige koncentration af DNA pr. celle er kendt for den cellelinje, der anvendes, kan DNA-koncentrationsværdier konverteres til celletal ved hjælp af ligning (4).
      Equation 6(4)
    8. Graf og analyser DNA-kvantificeringsresultaterne statistisk ved hjælp af passende software. Indtast biologiske tredobbelte værdier for at frembringe fejlbjælker og angive analysevariabiliteten.
    9. For at undersøge ændringerne i DNA-koncentration / celleantal over den eksperimentelle tidsramme skal du udføre en envejs ANOVA -test med flere sammenligninger af midlerne ved hjælp af passende biostatistisk software.
    10. Angiv signifikante forskelle mellem tidspunkter på grafer som ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) og **** (P≤0,0001).

Figure 5
Figur 5: Udarbejdelse af otte DNA-standarder til generering af en standardkurve. Der tilvejebringes en stamopløsning af λDNA ved 100 μg/ml. Dette fortyndes 50 gange i TE-buffer for at skabe standard A ved 2000 ng/ml; 400 μL A overføres derefter til rør B, der indeholder 400 μL TE-buffer; 400 μL B overføres derefter og fortyndes 2 gange i C og så videre, indtil G. Standard H består kun af TE-buffer og har derfor en DNA-koncentration på 0 ng/ml. Forkortelse: TE = Tris-EDTA. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Forberedelse af stilladser til histologisk farvning
    BEMÆRK: Stilladser kan fastgøres og farves til mikroskopi og billeddannelse enten som hele stilladser til immunofluorescens (IF) eller som formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) skiver til histologisk farvning eller immunhistokemi (IHC). Dette muliggør kvalitativ vurdering af cellepenetration og distribution inden for stilladser og kan bruges til at vurdere ekspressionen af proteiner.
    1. Der fremstilles en 10% paraformaldehydopløsning (PFA) i PBS. Sørg for, at der er tilstrækkelig opløsning til et slutvolumen på 500 μL pr. stillads.
    2. Forvarm denne opløsning ved 37 °C og tilsæt 500 μL til mærkede 2 ml centrifugerør til stilladsudtagning.
    3. Fjern stilladserne fra de ikke-klæbende plader med 24 brønde (trin 4.4.4), og anbring dem i den laminære strømningshætte.
    4. Brug sterile pincetter til at overføre stilladserne til de mærkede centrifugerør, der indeholder 10% PFA. Lad stilladserne sætte sig fast i PFA-opløsningen i 15 min. Neutralisere PFA ved at tilsætte 500 μL PBS til hvert glas og opbevar ved 4 °C.
    5. For at forberede stilladserne til den automatiske vævsprocessor skal du fjerne dem fra 4 °C og bruge pincet til at placere dem i plastikkassetter mærket med alle relevante detaljer med blyant. Anbring alle kassetterne i metalbeholderen i vævsprocessoren.
    6. Start 12-trins protokollen på vævsprocessoren for at fikse, dehydrere, rydde stilladserne og infiltrere dem med paraffin natten over. Kassetterne med de forarbejdede prøver opsamles.
    7. Indlejr derefter stilladserne i paraffinvoksblokke for at tillade mikrotomi af stilladserne i meget tynde skiver til farvning.
      BEMÆRK: Det er især vigtigt at overveje stilladsets retning, når du fjerner dem fra kassetterne og indlejrer dem i voks, da dette vil påvirke den vinkel, hvormed billederne tages. Dette er vigtigt, når man vurderer celleinfiltration i stilladserne.
    8. Tænd voksindlejringen og den kolde plade; Løft låget for at kontrollere voksens niveau. Genopfyld om nødvendigt.
    9. Arbejd med en prøve ad gangen, åbn kassetten, fjern stilladset og centrer det i plastformen.
    10. Hæld varm voks på prøven, sørg for, at den korrekte retning opretholdes, og juster om nødvendigt med en varm pincet, før voksen størkner. Hæld mere voks for at fylde formen.
    11. Placer det mærkede kassettelåg oven på plastformen og tilsæt voks ovenpå. Placer formen på den kolde plade for at størkne voksen. Opbevares natten over ved 4 °C for at sikre, at paraffinvoksen er fuldt størknet inden mikrotomi.
    12. For at forberede dig på mikrotomi skal du tænde for et 35 °C vandbad, tørrepladen og mikrotomet.
    13. Indsæt et blad i holderen, og stram håndtaget for at fastgøre det.
    14. Indstil trim og sektionstykkelse, generelt 5 mm for stilladssektioner.
    15. Fjern FFPE-stilladset fra formen, fastgør det i holderen på forsiden af mikrotomet, og trim forsigtigt overskydende voks rundt om prøvens kanter, inden du skærer sektioner.
    16. Begynd at skære i voksblokken ved at dreje mikrotomets håndtag, hvilket sikrer jævn bevægelse.
    17. Saml båndlignende sektioner, omkring 3 stilladssektioner ad gangen, og placer dem forsigtigt i 35 °C vandbad for at fjerne rynker. Adskil forsigtigt sektionerne, mens du er i vandbadet ved hjælp af pincet.
    18. Brug polysinbelagte glasmikroskopglas til at løfte hver sektion fra vandbadet, så sektionen sidder i midten af diaset. Mærk hvert dias med en blyant.
    19. Glasobjektglassene anbringes på tørrepladen eller i en 60 °C tørreovn. Når de er tørret, opbevares de ved 4 °C og fortsættes med den nødvendige histologiske eller IHC-plet.
  2. Udtagning af stilladser til genekspressionsanalyse
    1. Fjern stilladserne fra de ikke-klæbende 24-brøndplader fra inkubatoren (trin 4.4.4) og læg dem i laminar strømningshætte.
    2. Brug steril pincet til at overføre stilladserne til friskmærkede 2 ml centrifugerør.
    3. I en damphætte tilsættes 1 ml phenol / guanidinbaseret cellelysereagens til hvert rør for at lyse cellerne i stilladser og muliggøre genopretning af RNA af høj kvalitet.
    4. Opbevar reagensglas ved -20 °C, indtil de er klar til at udføre RNA-ekstraktion ved hjælp af et passende sæt. Ved hjælp af en standard omvendt transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)17 vurderes genekspression i cellerne i stilladserne.

Representative Results

Den kollagenbaserede stilladsmodel, der er beskrevet her, har mange anvendelser lige fra at studere neuroblastombiologi til screening af kræftbehandlinger i et miljø, der ligner mere fysiologisk indfødte tumorer end konventionel 2D-cellekultur. Før du tester et givet forskningsspørgsmål, er det afgørende at opnå en fuldstændig karakterisering af cellebinding, proliferation og infiltration inden for den ønskede eksperimentelle tidsramme. Vækstbetingelserne afhænger af biologien for hver specifik cellelinje. Det er vigtigt, at flere metoder til vurdering af cellevækst skal implementeres for at bestemme optimale forhold og robust ydeevne.

Her blev levedygtigheden af neuroblastomceller dyrket på stilladser vurderet ved hjælp af en kolorimetrisk cellelevedygtighedsanalyse. Dette assay kan udføres så ofte som ønsket i hele den eksperimentelle tidsramme. For det beskrevne eksperiment blev cellelevedygtighedsvurdering udført på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved 4 forskellige tætheder (figur 6). Levedygtighed på dag 1 blev fastsat som en baseline for at sammenligne alle efterfølgende målinger. Reduktionshastigheden for reagenset af cellelevedygtighedsreagenset afspejler cellebiologien og vækstegenskaberne for de enkelte cellelinjer, herunder deres proliferationshastigheder og metabolisme. Der forventedes en sammenhæng mellem antallet af celler, der blev sået på stilladserne, og reduktionsniveauet. I dette eksperiment steg reduktionen af cellelevedygtighedsreagenset generelt med hvert tidspunkt for begge cellelinjer ved alle tætheder som forventet.

Hver tæthed blev derefter vurderet individuelt for begge cellelinjer for at sammenligne reduktionen på tværs af tidspunkter. Envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest blev udført for at detektere signifikante forskelle i reduktion mellem tidspunkter (figur 7). For både cellelinjer og alle såtætheder var der en signifikant stigning (P<0,05) i reduktionen af cellelevedygtighedsreagenset, når dag 1 og dag 14 sammenlignes. Dette indikerede en signifikant stigning i metabolisk aktive celler til stede på stilladserne. Denne stigning var ikke signifikant i alle tilfælde, når man vurderede 7-dages intervallerne (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), hvilket viser vigtigheden af optimering af såtætheden for at opnå det ønskede vækstvindue.

For at understøtte resultaterne af cellelevedygtighedsanalysen kan cellevækst på stilladser også indirekte måles via kvantificering af dsDNA ekstraheret fra stilladser ved hjælp af en fluorescerende dsDNA-plet (figur 8A). Ligesom cellelevedygtighed kan DNA-kvantificering udføres så ofte som ønsket inden for den eksperimentelle tidslinje. Denne analyse kræver imidlertid fuldstændig hentning af stilladser og afslutning af cellevækst og skal derfor indregnes i eksperimentel planlægning som diskuteret i afsnit 1. Til dette eksperiment blev DNA kvantificeret på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved 4 forskellige tætheder. Da den gennemsnitlige koncentration af dsDNA pr. celle er kendt for disse cellelinjer, var det muligt at udlede antallet af celler pr. prøve fra det kvantificerede DNA (figur 8B).

DNA-kvantificering gav anledning til større variabilitet mellem biologiske replikater end vurdering af cellelevedygtighed, men steg generelt for hvert tidspunkt, hvor de højeste niveauer blev kvantificeret på dag 14. IMR32-celler ser ud til at nå højere celletal på Coll-I-nHA-stilladser, som angivet ved DNA-koncentration, end KellyLuc-celler. Hver tæthed blev derefter vurderet individuelt for de to cellelinjer for at sammenligne reduktionen på tværs af tidspunkter. Envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest blev udført for at detektere signifikante forskelle i reduktion mellem tidspunkter (figur 8B).

For både cellelinjer og alle såtætheder var der en signifikant stigning (P<0,05) i celleantallet, når man sammenlignede dag 1 og dag 14, med undtagelse af KellyLuc ved såtæthed 4 (1 × 105 celler / stillads), hvilket ikke gav signifikante stigninger på tværs af nogen af tiderne. I lighed med resultaterne af cellelevedygtigheden var stigningerne ikke signifikante i alle tilfælde, når 7-dages intervallerne blev vurderet (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Når man sammenlignede tidstendenserne for cellelevedygtighed og DNA-kvantificering, var der nogle små forskelle mellem de to analyser. Der blev dog generelt observeret lignende tendenser, idet gennemsnitsværdierne steg mellem 7-dages intervaller for de fleste tætheder. Dette viser vigtigheden af at overvåge cellevækst ved hjælp af mere end én metode.

En visuel vurdering af cellevækstmorfologi og fordeling på stilladserne blev derefter implementeret, der omfattede traditionel hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning samt IHC. Det forventes, at de forskellige vækstmønstre for individuelle cellelinjer vil føre til varierede rumlige arrangementer på stilladser, herunder forskellige grader af penetration i stilladset og celleklynger. Stilladser blev formalinfastgjort, paraffinindlejret og skåret i 5 mm sektioner (figur 9A) og forberedte stilladserne til flere visualiseringsteknikker, herunder histologisk farvning og IHC.

Rutinemæssig H&E-farvning blev anvendt på Kelly-, KellyCis83- og IMR32-celler dyrket på kollagenbaserede stilladser på dag 1, 7 og 14 (figur 9B). Dette tillod visualisering af cellernes rumlige orientering på to kollagenbaserede stilladser over en 14-dages periode. Cisplatinfølsomme Kelly-celler og resistente KellyCis83-celler blev dyrket på både Coll-I-nHA-stilladser (figur 9B, i) og Coll-I-GAG-stilladser (figur 9B, ii). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data voksede KellyCis83-celler med en højere hastighed og infiltrerede dybere ind i begge stilladssammensætninger end den mindre invasive Kelly-cellelinje. H&E-pletten på en anden neuroblastomcellelinje, IMR32, dyrket på Coll-I-nHA viser et kontrasterende vækstmønster (figur 9B, iii). Denne cellelinje voksede i store, tætpakkede klynger på kollagenstilladserne i løbet af den 14-dages periode. Brightfield konfokalmikroskopi kan bruges til at visualisere den porøse arkitektur af kollagenbaserede stilladser (figur 9C) på grund af autofluorescensen af kollagenfibre.

Vi farvede celler med phalloidin rettet mod cytoskeletal actin og den nukleare modplet, 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), for at overvåge specifikke celletræk gennem hele den eksperimentelle tidslinje. En overflod af actin blev observeret i Kelly og KellyCis83 celler på Coll-I-GAG stilladser ved hjælp af denne teknik (figur 9D). Disse resultater viser, hvordan flere billeddannelsesteknikker kan bruges til at udlede rumligt opløst information fra neuroblastomceller dyrket på stilladser ved hjælp af denne protokol. Denne karakterisering af cellevækstmønstre på kollagenbaserede stilladser over en given periode vil forbedre forståelsen og fortolkningen af eventuelle downstream biokemiske assays.

Proteinekspression af celler dyrket på kollagenbaserede stilladser kan analyseres for at sammenligne cellulær aktivitet med in vivo-scenarier . Tidligere offentliggjorte data undersøgte ekspressionen af chromogranin A (CgA) som en surrogatudskilt markør for neuroblastom af KellyLuc- og KellyCis83Luc-celler dyrket i cellemonolag såvel som på Coll-I-nHA og Coll-I-GAG stilladser (figur 10). CgA blev vurderet i det konditionerede medie ved anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) (figur 10A). CgA udskilles med en højere hastighed i den mere aggressive kemoresistente KellyCis83-cellelinje end i Kelly (figur 10B, C). Dette var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stilladser (P<0,05), mens der ikke var nogen signifikant forskel på dette tidspunkt for celler dyrket som et monolag ved konventionel 2D-kultur.

Disse resultater fremhæver også den begrænsede eksperimentelle tidslinje, når der dyrkes celler i et monolag, hvor kun 7 dages vækst viser sig mulig, før cellerne når sammenløb. Væksten af celler på stilladser overvinder denne begrænsning, da de kan opretholdes over en længere periode under mere fysiologisk relevante forhold. Ovennævnte kombination af teknikker til at erhverve information om cellelevedygtighed, DNA-indhold, cellulær morfologi og rumligt arrangement og ekspressionsprofiler letter vurderingen af væksten af neuroblastomceller på en række kollagenbaserede stilladser. Denne protokol kan også let tilpasses til at opfylde specifikke eksperimentelle krav og ønskede applikationer.

Figure 6
Figur 6: Analyse af cellelevedygtighed. A) Generel procedure til måling af neuroblastomcellers levedygtighed på kollagenbaserede stilladser ved hjælp af en kolorimetrisk cellelevedygtighedsanalyse. Inkubationsperioden skal optimeres for hver ny cellelinje med henvisning til producentens retningslinjer. (B) Procentvis reduktion af cellelevedygtighedsreagens af KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA-stilladser ved fire forskellige indledende såtætheder, målt på dag 1, 7 og 14. Prøverne blev vurderet i biologisk tredobbelt med fejlbjælker, der repræsenterede standardafvigelsen. Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Cellelevedygtighed ved såtæthed for celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dages periode. a) KellyLuc B) IMR32. Navngivne cellenumre henviser til den indledende cellesåningstæthed på stilladserne på dag 0. Prøverne blev vurderet i biologisk triplicat, angivet med tredobbelte punkter, hvor søjlerne repræsenterede gennemsnittet. One-Way ANOVA med flere sammenligninger blev brugt til at detektere signifikante forskelle i % cellelevedygtighed reagensreduktion på tværs af de tre tidspunkter, noteret på graferne (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; ANOVA = variansanalyse; ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Kvantificering af DNA ekstraheret fra celler i stilladser . (A) Proces til kvantificering af dsDNA fra celler dyrket på kollagenbaserede stilladser ved hjælp af en fluorescerende dsDNA-plet. (B) Celleantal fra DNA-kvantificeringsanalyse ved såtæthed for KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA over en periode på 14 dage. Navngivne cellenumre henviser til den indledende cellesåningstæthed på stilladser på dag 0. Prøverne blev vurderet i biologisk triplicat, angivet med tredobbelte punkter, hvor søjlerne repræsenterede gennemsnittet. One-Way ANOVA med flere sammenligninger blev brugt til at detektere signifikante forskelle i cellenumre på tværs af de tre tidspunkter, noteret på graferne (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalyse; ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Vævsbehandlingstrin til immunhistokemisk analyse af stilladser . (A) Skematisk gengivelse af protokollen til behandling af stilladser til billedanalyse. Denne proces tillader rutinemæssig histologisk farvning og specifik antistofsondering ved hjælp af primære antistoffer og fluorescerende mærkede sekundære antistoffer. (B) Repræsentative billeder af tre neuroblastomcellelinjer, der udsættes for H&E-farvning. H&E-billeder tages på dag 1, 7, 14 for at overvåge vækstmønstre i løbet af eksperimentet. Skalabjælke = 200 μm. Stiplede firkanter repræsenterer det område, der blev valgt til zoomede 20x billeder i nederste venstre kant. Skalabjælke = 20 μm. (i og ii) H&E af Kelly og KellyCis83 neuroblastomcellelinjer (henholdsvis øvre og nedre paneler) på to typer kollagenbaserede stilladser. (iii) H&E af IMR32-cellelinje, der repræsenterer klynget cellulær vækst på Coll-I-nHA-stilladset. (C) Repræsentativt billede af Kelly-cellelinjen, udsat for brightfield konfokal mikroskopi. Kollagenautofluorescensen tillader visualisering af det porøse stillads. 10x skalabjælke = 200 μm, 20x skalabjælke = 20 μm. (D) Repræsentativt billede af indlejrede stilladser efterfulgt af analyse af IHC med phalloidin og DAPI ved 10x forstørrelse, skalabjælke = 200 μm. Mindre indvendige firkanter repræsenterer zoomede billeder (20x), skalabjælke = 20 μm. Forkortelser: nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; GAG = glycosaminoglycan; Coll-I-GAG = kollagenstilladser suppleret med chondroitin-6-sulfat; H&E = hæmatoxylin og eosin; IHC = immunhistokemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Proteinekspression af neuroblastomceller dyrket på 3D-kollagenbaserede stilladser sammenlignet med 2D-plast. (A) Et skema over, hvordan CgA ELISA blev udført på konditionerede medier af celler dyrket på 2D-plast- eller 3D-kollagenbaserede stilladser. (B) CgA-proteinekspressionsniveauer taget fra konditionerede medier af celler dyrket på et 2D-plastmonolag. Da cellerne nåede sammenløb efter 7 dage, var 14-dages tidspunktet ikke læsbart. På dag 7 på plast var der ingen signifikant forskel i CgA-niveauer mellem Kelly og KellyCis83-cellelinjer. C) CgA ELISA udført ved hjælp af konditionerede medier af celler dyrket på kollagenbaserede stilladser i 14 på hinanden følgende dage. På dag 7, på begge kollagenstilladser, er CgA-niveauerne højere i den mere aggressive KellyCis83-cellelinje, hvilket fremhæver mere fysiologisk relevante niveauer af CgA i 3D-matrix sammenlignet med 2D-monolag. Dette tal er blevet ændret fra Curtin et al.17. Forkortelser: 3D = tredimensionel; 2D = todimensionel; CgA = chromogranin A; ELISA = enzymbundet immunosorbentassay nHA = nanohydroxyapatit; Coll-I-nHA = kollagenstilladser suppleret med nHA; GAG = glycosaminoglycan; Coll-I-GAG = kollagenstilladser suppleret med chondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin; HRP = peberrodsperoxidase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

3D-stilladskræftcellemodellen har vist sig at være et værdifuldt og alsidigt værktøj til at opnå mekanistisk indsigt i neuroblastomcellevækst, levedygtighed og infiltration af celler i en forenklet TME32. 3D-neuroblastommodellen, der er beskrevet her, efterligner den minimale TME og giver mere fysiologisk relevante data end en 2D-monolagskultur. En stor ulempe ved 3D-cellekultur er øget eksperimentel kompleksitet og længere tidsrammer. Beskrevet her er en optimeret protokol til såning, vækst og vedligeholdelse af neuroblastomceller på kollagenbaserede stilladser efterfulgt af downstream-analyser og applikationer, hvilket giver robust karakterisering af cellevækst. Vi havde til formål at få indsigt i den optimale cellesåtæthed for stilladserne for at skabe et forudsigeligt og kontrollerbart miljø til vurdering af kræftbehandlinger i et hurtigt 14-dages eksperimentelt vindue. Kombinationen af alle disse beskrevne enkle protokoller giver en velafrundet vurdering af neuroblastomcellevækst i det stilladsbaserede in vitro-kultursystem .

De kritiske punkter i protokolopsætningen er blevet understreget for at give forskere mulighed for hurtigt at etablere det samme i deres laboratorier. For eksempel tillader de angivne inkubationstider for bedre ydeevne af den kolorimetriske cellelevedygtighedsanalyse dybere penetration af reagenset i stilladsporerne for at nå alle celler. Desuden er den fluorescerende dsDNA-farvningsteknik robust og ligetil; DNA-frigivelse fra stilladserne kræver imidlertid kraftig cellelyse, da cellerne er 'fanget' i kollagenfibre.

Ved hjælp af det beskrevne enkle DNA-kvantificeringsassay kan vi identificere logvækstfasen på kollagenbaserede stilladser til screening af kræftlægemidler ved hjælp af denne model. I den beskrevne eksperimentelle indstilling blev der anvendt 4 indledende cellesåningstætheder med en samlet 14-dages periode og analysetidspunkter på dag 1, 7 og 14. Vi identificerede, at KellyLuc-celler podet ved 4 × 105 celler / stillads har det mest signifikante aktive spredningsvindue mellem dag 7 og 14. Disse logfasevækstdata giver mulighed for pålidelig fortolkning af forskellige cellecytotoksicitetseksperimenter. Det eliminerer spekulationer om ethvert fald i vækst eller celledød som følge af undertrykt vækst på den 3D-porøse platform snarere end fra lægemiddeltoksicitet. Cellelevedygtighed er også en meget anvendt vurdering af 3D-platformes egnethed til at understøtte væksten af forskellige celletyper33,34. Mens der er mange analyser til måling af cellelevedygtighed, herunder levende / død farvning, ATP-måling, proliferationsassays, fandt vi, at brugen af Alamar Blue kolorimetriske cellelevedygtighedsanalyser var en enkel og effektiv teknik til understøttelse af DNA-kvantificeringsdata.

Den kombinerede anvendelse af DNA-kvantificering og cellelevedygtighed gav supplerende bevis for, at den optimale tæthed til frøceller på stilladset for at opnå fortsat vækst over en 14-dages periode i gennemsnit er 2-4 × 105 celler / stillads. Denne protokol kan dog let tilpasses til at tilfredsstille forskellige eksperimentelle tidsrammer, analysetidspunkter og downstream-applikationer. Selvom denne protokol beskriver evalueringen af monokulturcellevækst af neuroblastomceller på stilladser, kan stilladserne let ændres til brug som en platform for samkultur, beskrevet af do Amaral et al., der udnyttede kollagen-GAG-stilladser til co-kultur keratinocytter og fibroblaster i en undersøgelse af sårheling35.

Den beskrevne 3D-model muliggør visualisering af cellevækst og infiltration ved hjælp af forskellige velkendte teknikker, såsom immunofluorescens og standard H&E. Det er vigtigt at visualisere cellerne sammen med karakteriseringen af vækst ved hjælp af biokemiske assays på grund af mangfoldigheden af cellemorfologi og vækstmønstre på stilladser. Forståelse af vækstmønsteret kan give indsigt i vækstadfærd og fremtidig reaktion på kræftmedicin. For eksempel giver IMR32-vækst ved hjælp af DNA-kvantificering lignende mønstre som Kelly, selvom IMR32 ved visualisering ved hjælp af H&E vokser i større klynger end Kelly, som viste mere spredt vækst (figur 9). Disse varierede vækstmønstre af cellelinjer i stilladser afspejler det kliniske scenario for tumorheterogenitet. Undersøgelse af lægemiddelrespons mod kræft ved hjælp af et panel af cellelinjer med forskellige morfologier i 3D-stilladser vil øge den prædiktive værdi for patientens respons på de samme lægemidler.

Påvisning af gen- eller proteinekspression kan også udføres ved hjælp af andre tilgange såsom RT-qPCR eller ELISA, hvis proteinet af interesse udskilles. En surrogatmarkør for neuroblastomprogression, chromogranin A (CgA)36, blev brugt til yderligere at karakterisere neuroblastomcellevækst i 3D. Som beskrevet i tidligere arbejde17 steg CgA-sekretionen, efterhånden som cellerne spredte sig (figur 10). Mens enkeltlagscellekultur ikke kunne fange denne stigning, da spredning betød, at celler nåede fuld sammenløb i kulturskålene, tillod brugen af 3D-kollagenstilladserne langvarig vurdering af CgA-sekretion.

Denne 3D in vitro-model er muligvis ikke egnet til alle forskningsspørgsmål til undersøgelse af neuroblastombiologi og respons på terapi. En af begrænsningerne er ujævn celleindtrængning i stilladser og dannelse af celleklynger af varierende størrelse, som afhænger af en given cellelinje og kan føre til ukontrollabel diffusion af næringsstoffer og testlægemidler. Denne funktion påvirker robustheden i terapeutisk screening. På trods af denne begrænsning er det imidlertid vigtigt at overveje, at indfødte tumorer også er heterogene i størrelse og kræftcellefordeling og indeholder mange andre celletyper i tumorvævet. For at overvinde denne begrænsning foreslår vi brugen af hvert cellebefolket stillads som et enkelt mikrovæv, for hvilket følgende parametre vil blive optimeret: (a) inkubationstider for cellelevedygtighedsreagenset for at nå cellerne og celleklyngerne og (b) lysering af cellerne i Triton X-100-buffer ved forbehandling af celler på stilladser med en vævslyser for at frigive DNA'et fra cellerne indeholdt dybt i stilladset.

En anden teknisk begrænsning af denne protokol er manglen på mekanisk test af hvert parti nyfremstillede stilladser til denne model. Ved hjælp af stilladsets robuste fremstillingsproces, som i vid udstrækning er blevet karakteriseret i forhold til stilladsets fysiske og kemiske egenskaber, såsom tryk- og trækmodul, porøsitet og visuel porestruktur og homogenitet, sikres det imidlertid, at stilladskvaliteter opretholdes gennem batches 21,24,27,30,37.

Sammenfattende præsenterer dette papir en række enkle metoder til analyse af cellulær vækst på kollagenbaserede stilladser. Både den eksperimentelle tidslinje og analysepunkter kan udskiftes afhængigt af de specifikke forskningsspørgsmål. Denne protokol kan også tilpasses andre celletyper. Resultaterne vist ovenfor giver bevis for, hvordan denne samling af metoder gav indsigt i den optimale såtæthed for forskellige neuroblastomcellelinjer for at skabe kontinuerlig vækst over 14 dage. Sammenlægningen af resultater opnået fra alle metoderne i denne protokol giver en overlegen forståelse af cellevækst inden for 3D-kollagenmatrixen. Fremtidig anvendelse af denne model vil sandsynligvis involvere samkultursystemer, der er specifikke for neuroblastoma TME og testning af forskellige nye kræftlægemidler.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) og Neuroblastoma UK. Illustrationerne blev skabt ved hjælp af BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
IMR-32 ATCC CCL-127
Kelly ECACC 82110411
KellyCis83 Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) - Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired
SH-SY5Y ATCC CRL-2266
Disposable
0.22 µm syringe filter Millex SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 120.086
100 mL sterile Pot Starstedt -
10 mL plastic pipette Cellstar 607 180
15 mL Falcon tube Starstedt 62.554.502
25 mL plastic pipette Cellstar 760 180
50 mL Falcon tube Starstedt 62.547.254
5 mL plastic pipette Cellstar 606 180
6 mm Biopsy punches Kai Medical BP-60F
Aluminium foil - -
Cover Slip Menzel-Glaser -
HYPERflask Corning CLS10030
Microscope slides Thermo Scientific J1840AMNT
Opaque black 96-well plate Costar 3915
Sterile P10 tips Starlab S1121-3810
Sterile P1000 tips Starlab S1122-1830
Sterile P20 tips Starlab S1123-1810
Sterile P200 tips Starlab S1120-8810
T-175 (175 cm2 flask) Sarstedt 83.3912
T-75 (75 cm2 flask) Sarstedt 83.3911.302
Translucent clear 96 well plate Cellstar 655180
Translucent non-adherent 24 well plates Cellstar 83.3922.500
Equipment
Autoclave Astell -
Automatic tissue processor Leica TP1020
Centrifuge 5804 Eppendorf -
Hemocytometer Hausser  Scientific -
Incubator ThermoScientific -
Microtome Leica RM2255
Oven Memmert Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P10 pipette Gilson
P100 pipette Gilson
P1000 pipette Gilson
P20 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P200 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Paraffin section flotation bath Electrothermal MH8517 Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Pipette electronic dispenser Corning StripipetterUltra Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Plate cooler Leica EG1140C Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Refrigerator -20 °C Liebherr -
Refrigerator -80 °C Liebherr -
Refrigerator 4 °C Liebherr -
Seesaw Rocker DLAb SK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V Platereader PerkinElmer 1420
Tissue culture hood/Laminar flow hood GMI 8038-30-1044
Tissue Lyser Qiagen TissueLyser LT
Tweezers - -
Water bath Grant -
Wax embedder Leica EG1140H
Materials
1 L Water Adrona - Biosciences 568
1% Triton-X Sigma Aldrich 9002-93-1
10x PBS tablets Sigma Aldrich P4417-100TAB
37% paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Alamar Blue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1100
Collagen- glycosaminoglycan scaffold Tissue engineering research group (TERG)
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold Tissue engineering research group (TERG)
dH20 Adrona - Biosciences 568
Eosin Sigma-Aldrich E4009 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOH Sigma-Aldrich 1.00983.2500 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12 Gibco 21765-029
FBS Gibco 10270-106
Hemaytoxylin Sigma-Aldrich HHS32-1L
L-Glutamine Gibco 25030-024
MEM Gibco 21090-022
miRNA easy Kit Qiagen 217004
MNEAA’s Gibco 11140-035
Penicillin/streptomycin Gibco 015140-122
Qiazol Qiagen 79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
RPMI Gibco 21875-034
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S7795-500G
Tissue embedding Medium Sigma A6330-4LB
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Software
Excel - Excel 2016
ImageJ - -
Prism - Version 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11 (2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38 (2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Tags

Tredimensionel In vitro biomimetisk model neuroblastom kollagenbaserede stilladser pædiatrisk kræft tumorvæv ekstracellulær matrix (ECM) sygdomsprogression patientprognose terapeutisk respons neuroblastomcellelinjer nanohydroxyapatit (nHA) glycosaminoglycaner (GAG'er) knogle- og knoglemarv metastatiske steder porøs struktur cellevedhæftning spredning migration celleklynger terapi in vivo-situation stilladsbaseret kultursystem todimensionel (2D) celle Kultur DNA-kvantificering cellelevedygtighed

Erratum

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Tredimensionel <em>in vitro</em> biomimetisk model af neuroblastom ved hjælp af kollagenbaserede stilladser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly,… More

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly, G., O’Brien, F. J., Piskareva, O. Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds. J. Vis. Exp. (173), e62627, doi:10.3791/62627 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter