ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.
Abstract
신경모세포종은 소아에서 가장 흔한 두개외 고형 종양으로 전체 소아암 사망자의 15%를 차지합니다. 천연 종양 조직은 세포외 기질(ECM)로 둘러싸인 암세포와 비암세포층을 포함하는 복잡한 3차원(3D) 미세환경입니다. ECM은 물리적, 생물학적 지원을 제공하고 질병 진행, 환자 예후 및 치료 반응에 기여합니다.
이 논문은 신경모세포종 세포주와 콜라겐 기반 스캐폴드를 사용하여 신경모세포종 미세환경을 모방하기 위해 3D 스캐폴드 기반 시스템을 조립하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 스캐폴드에는 신경모세포종의 가장 흔한 전이 부위인 뼈와 골수에서 고농도로 자연적으로 발견되는 나노하이드록시아파타이트(nHA) 또는 글리코사미노글리칸(GAG)이 보충됩니다. 이 지지체의 3D 다공성 구조는 신경모세포종 세포 부착, 증식 및 이동, 세포 클러스터 형성을 가능하게 합니다. 이 3D 매트릭스에서 치료제에 대한 세포 반응은 생체 내 상황을 더 잘 반영합니다.
스캐폴드 기반 배양 시스템은 기존의 2차원(2D) 세포 배양보다 더 높은 세포 밀도를 유지할 수 있습니다. 따라서 초기 시드 셀 수에 대한 최적화 프로토콜은 원하는 실험 기간에 따라 달라집니다. 이 모델은 DNA 정량화를 통한 세포 성장, 대사 분석을 통한 세포 생존율, 조직학적 염색을 통한 스캐폴드 내 세포 분포를 평가하여 모니터링됩니다.
이 모델의 응용 분야에는 유전자 및 단백질 발현 프로파일의 평가와 기존 약물 및 miRNA를 사용한 세포 독성 테스트가 포함됩니다. 3D 배양 시스템을 사용하면 세포 및 ECM 구성 요소를 정밀하게 조작할 수 있어 생리학적으로 자연 종양 조직과 유사한 환경을 만들 수 있습니다. 따라서 이 3D in vitro 모델은 질병 발병 기전에 대한 이해를 높이고 in vitro, in vivo in animal model 및 인간 피험자에서 얻은 결과 간의 상관 관계를 개선할 것입니다.
Introduction
신경모세포종(Neuroblastoma)은 신경능선세포(neural crest cell)의 변형으로 인해 배아 발달 또는 출생 후 초기에 발생하는 교감신경계의 소아암이다1. 소아에서 가장 흔한 고형 두개외 종양으로 15세 미만 환자에서 진단되는 악성 종양의 8%를 차지하며 모든 소아암 사망의 15%를 차지합니다. 이 질병은 특정 염색체, 유전적 및 후성유전학적 변화, 조직 병리학적 특징으로 인해 매우 이질적인 임상 행동을 보입니다.
이러한 변화는 신경모세포종의 공격성과 소아 환자의 나쁜 예후에 기여합니다. 따라서 현재의 치료법은 임상적으로공격적인 질병을 앓고 있는 환자의 거의 80%에게 장기적으로 효과가 없는 것으로 입증되었으며2 이 환자군에 대한 치료가 여전히 어렵다는 사실을 강조한다. 이는 신경모세포종 이질성과 전이의 메커니즘이 아직 완전히 이해되지 않았기 때문일 수 있습니다. 그러나 종양 미세환경(TME)은 현재 많은 암의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 신경모세포종 3,4에서는 아직 연구가 덜 되어 있다.
네이티브 TME는 ECM으로 둘러싸인 암성 및 비암성 세포를 포함하는 복잡한 3D 미세환경입니다. ECM은 세포 거주자에게 구조적 및 생화학적 지원을 제공하고 질병 진행, 환자 예후 및 치료 반응에 기여하는 조직의 무세포 구성 요소를 말합니다5. 이러한 질병 진행의 촉진은 세포와 ECM사이의 "동적 상호성" 또는 지속적인 양방향 통신에 기인한다 6,7,8. 암이 진행됨에 따라 기질 콜라겐은 종종 기질-암 계면에 수직인 선형 패턴으로 재편성되며, 암세포는 이를 전이로 가는 이동 경로로 사용합니다 9,10,11.
이 천연 기능성 생물학적 스캐폴드의 주요 구성 요소에는 콜라겐 유형 I 및 II와 엘라스틴을 포함한 기타 단백질, 라미닌과 같은 당단백질, 다양한 프로테오글리칸 및 기타 수용성 성분12,13의 섬유질 네트워크가 포함됩니다. 네이티브 ECM의 이러한 단백질은 이제 3D in vitro 모델3 개발을 위한 매력적인 천연 생체 분자가 되었습니다. 체외 세포 배양을 위한 3D 스캐폴드의 적용은 기존의 2D 단층 배양에 비해 TME의 생리학적 표현이 더 우수하기 때문에 인기가 높아지고 있습니다. 제조된 3D 스캐폴드는 세포 부착, 증식, 이동, 신진대사 및 생체 내 생물학적 시스템에서 볼 수 있는 자극에 대한 반응을 지원합니다.
이러한 3D 스캐폴드의 주성분은 콜라겐이며, 콜라겐은 조직 복구, 혈관 신생, 조직 형태 형성, 세포 접착 및 이동을 포함한 많은 정상적인 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다11. 콜라겐 기반 3D 매트릭스는 ECM을 모델링하는 강력한 기능을 보여주었으며, 세포-ECM 상호 작용과 세포 이동 및 침입을 가능하게 하는 동시에 체외 생체 모방 미세환경 역할을 합니다. 이러한 3D 매트릭스는 또한 신경모세포종 17,18을 포함한 많은 암 모델(14,15,16)에서 기존의 2D 또는 "편평한" 배양보다 화학요법 약물에 대한 세포 반응에 대한 보다 정확한 분석을 제공한다. 3D 세포 배양의 유전자 분석은 동물 모델과 비교했을 때에도 인체 조직 프로파일과 더 높은 상관관계가 있는 것으로 보고되었습니다19. 전반적으로, 이러한 3D 스캐폴드의 초석은 세포에 적절한 시험관 내 환경을 제공하는 것이며, 이는 네이티브 조직 구조를 요약하고 양방향 분자 누화를 촉진합니다8.
콜라겐 기반 모델의 복잡성을 증가시키기 위해 다른 일반적인 ECM 구성 요소가 조직 엔지니어링 프로세스에 통합되어 다양한 조직의 틈새 TME를 반영하는 생리학적으로 더 관련성 있는 모델을 만듭니다. 예를 들어, 모든 포유류 조직(20)에 존재하는 음전하를 띤 다당류인 GAG는 세포 부착, 이동, 증식 및 분화를 촉진한다. 콘드로이틴 황산염은 뼈와 연골에서 발견되는 특정 유형의 GAG로, 이전에 뼈 수리 21,22,23,24,25를 위한 조직 공학 응용 분야에 사용되었습니다. 나노하이드록시아파타이트(nHA)는 인체 뼈 조직의 미네랄 조성의 주요 무기 성분으로, 뼈의 최대 65%를 구성하며26 따라서 뼈 교체 및 재생에 널리 사용된다27. 따라서 GAG와 nHA는 원발성 신경모세포종 ECM을 재구성하고 신경모세포종, 골수(70.5%) 및 뼈(55.7%)의 가장 흔한 전이 부위를 모델링하는 데 매력적인 복합체입니다28.
이러한 ECM 구성 요소를 통합하는 스캐폴드는 원래 생체 적합성, 독성, 골전도성 및 골유도성 특징에 대한 광범위한 분석과 함께 뼈 조직 공학 응용 분야를 위해 개발되었습니다29,30. 그들은 물리적 및 생물학적 특성을 제어하기 위해 동결 건조 기술을 사용하여 생산된 다공성 콜라겐 기반 매트릭스입니다. nHA (Coll-I-nHA) 또는 콘드로이틴-6-설페이트 (Coll-I-GAG)로 보충된 콜라겐 스캐폴드는 유방암31에서 원발성 TME를 모방하고 전립선암15 및 신경모세포종17에서 뼈로의 전이를 모방하는 데 성공했습니다. 이들 복합 스캐폴드를 제조하는데 사용되는 동결 건조 기술은 스캐폴드(22,23,24) 내에서 공극 크기 및 다공성에서 재현 가능한 균질성을 산출한다. 간단히 말해서, 콜라겐 슬러리(0.5 wt%)는 피브릴라 콜라겐과 0.05 M 아세트산을 혼합하여 제조된다. Coll-I-GAG의 경우 상어 연골에서 분리한 0.05wt%의 크로도이틴-6-설페이트를 혼합하면서 콜라겐 슬러리에 첨가합니다. 복합 Coll-I-nHA 스캐폴드의 경우, 나노 크기의 하이드록시아파타이트 입자를 앞서 기술한 바와 같이 합성하고,27을 블렌딩 공정 동안 콜라겐의 중량에 대해 2:1 비율로 콜라겐 슬러리에 첨가한다. 모든 스캐폴드는 105°C에서 24시간25분 동안 탈수열 처리를 사용하여 물리적으로 가교 결합되고 멸균됩니다. 원통형 스캐폴드(직경 6mm, 높이 4mm)는 생검 펀치를 사용하여 얻어지고, 3mM N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 및 5.5mM N-히드록시숙신이미드(EDAC/NHS)와 화학적으로 가교되어 조성물(30)의 기계적 특성을 개선할 수 있다. 두 개의 콜라겐 스캐폴드의 이 잘 최적화된 제조 공정은 기공 크기, 다공성 및 강성(kPa)을 포함하여 재현 가능한 기계적 특성을 가진 스캐폴드를 생성합니다. Coll-I-GAG와 Coll-I-nHA 스캐폴드는 모두 물리적 특성이 다르기 때문에 서로 다른 환경 조건을 만듭니다. 각 스캐폴드의 속성은 표 1에 나와 있습니다.
| Coll-I-GAG | 콜-I-nHA | |
| 비계 크기 (직경[mm] x 높이[mm]) |
6 엑스 4 17 | 6 엑스 4 17 |
| 콜라겐 농도 (wt. %) | 0.5 17호 | 0.5 17호 |
| 기질 농도 (wt. %) [콜라겐 중량 기준] |
0.05 15,17 | 200 17 |
| 평균 기공 크기(mm) | 96 22명 | 96 – 120 29년 |
| 다공성(%) | 99.5 23 | 98.9 – 99.4 27 |
| 뻣뻣함 (kPa) | 1.5 27호 | 5.5 - 8.63 29 |
표 1: 신경모세포종 생물학 연구를 위해 채택된 두 지지체의 기계적 특성 개요.
이 논문은 신경모세포종 세포주와 nHA(Coll-I-nHA) 또는 콘드로이틴-6-황산염(Coll-I-GAG)이 보충된 이전에 설명한 콜라겐 기반 지지체를 사용하여 신경모세포종 미세환경을 더 잘 모방하기 위해 3D 스캐폴드 기반 시스템을 조립하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 2D 단층 배양에서 채택된 이전에 최적화된 저렴한 방법을 사용하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 환경에서 신경모세포종 세포의 성장 메커니즘을 분석하기 위한 다운스트림 방법이 포함되어 있습니다( 그림 1).
그림 1: 전체 프로토콜 워크플로우. (A) 세포를 충분한 수로 성장시키고, 분할하고, 계수하고, 적절한 부피의 배지에 재현탁시킨다. (B) 그런 다음 이 셀 스톡을 연속 희석하여 밀도가 다른 총 4개의 셀 현탁액을 준비합니다. (C) 콜라겐 기반 스캐폴드를 비부착성 24웰 플레이트에 멸균 도금하고, (D) 20μL의 세포 현탁액을 각 스캐폴드의 중앙에 첨가하고 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 3-5시간 동안 배양하도록 둡니다. (E) 그런 다음 전체 성장 배지(1mL)를 각 스캐폴드에 천천히 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 배치하여 원하는 시간 동안 세포가 성장할 수 있도록 합니다. (F) 미리 결정된 각 시점에서, 세포 생존율 및 성장 평가, 유전자 발현 분석 및 조직학적 염색을 위해 여러 개의 스캐폴드를 회수합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 실험 설계
참고: 각 실험에 필요한 스캐폴드와 셀의 수는 실험 규모에 따라 다르며 실험 설계에 대한 이 섹션의 도구를 사용하여 계산할 수 있습니다.
- 필요한 스캐폴드 수
- 세포 생물학의 변화(예: 세포 성장 및 대사)에 대한 전체 실험 타임라인 및 평가 간격을 결정합니다.
참고: 예를 들어, 실험 기간은 14일이며 7일마다 세포 성장을 평가합니다. 따라서 실험 시점은 1일, 7일, 14일이며 총 3개의 시점을 제공합니다. - 다음으로, 각 시점에서 적용할 실험 응용 프로그램의 수를 결정합니다. 변경 사항을 모니터링하기 위해 모든 시점에서 동일한 분석을 완료해 보십시오.
참고: 스캐폴드의 세포 성장에 대한 일반적인 분석에는 세포 생존도 분석, DNA 정량화, 조직학적 염색 및 이미징, 유전자 발현 분석이 포함됩니다. 이에 대해서는 섹션 5에서 자세히 설명합니다. - 여러 다운스트림 응용 분야에 동일한 스캐폴드를 사용할 시기를 결정합니다(예: 적절한 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가한 후 DNA/RNA 분리를 위해 스캐폴드를 재사용).
- 각 응용 분야에 대해 최소 3개의 생물학적 복제(예: 세포 생존율 및 DNA 정량화를 위한 3개의 스캐폴드, 조직학을 위한 3개, 유전자 발현 분석을 위한 3개의 스캐폴드)를 유지합니다. 이는 시점당 9개의 스캐폴드와 같으므로 3개의 시점에 27개의 스캐폴드를 사용하도록 계획합니다.
- 마지막으로, 이 숫자에 실험 파라미터 또는 조건의 수를 곱합니다(예: 여러 세포주, 초기 파종 밀도, 스캐폴드 조성 평가).
참고: 이 프로토콜에서는 하나의 세포주에 대해 4개의 서로 다른 초기 파종 밀도를 평가하여 108개(27개의 스캐폴드 x 4개의 조건)의 스캐폴드가 필요했습니다. 인적 오류를 고려하고 추가 적용 범위를 제공하려면 이 숫자에 ~10%를 추가합니다(예: 108개의 스캐폴드가 필요한 경우 120개의 스캐폴드를 준비).
- 세포 생물학의 변화(예: 세포 성장 및 대사)에 대한 전체 실험 타임라인 및 평가 간격을 결정합니다.
- 필요한 셀 수
참고: 20 μL 용량의 세포 현탁액은 0일에 원통형 스캐폴드(직경 6mm, 높이 4mm)에 세포를 파종하는 데 권장됩니다. 이 20μL의 세포 현탁액당 세포 수는 섹션 1.1에서 계산된 실험 설계에 따라 조정됩니다. 일반적인 초기 시드 밀도는 20μL당 2 × 105 셀이며, 아래 프로토콜의 예로 사용됩니다.- 실험에 필요한 총 세포 수를 계산하려면 20μL당 초기 2 × 105 세포에 필요한 스캐폴드 수를 곱합니다.
참고: 예를 들어, 30개의 스캐폴드에 20μL를 곱하면 총 부피는 600μL가 됩니다. 각 스캐폴드에 2 × 10 5 셀이 필요한 경우 600 μL의 현탁액에는 총 6 × 10 6 셀(2 × 105 × 30 셀)이 포함되어 있어 600 μL에 6 × 106 셀의 최종 요구 사항을 제공합니다. 실험 매개변수의 수에 따라 필요한 총 세포 수가 결정됩니다. 따라서 이 프로토콜은 기존의 175cm2 플라스크 10개와 동일한 수의 세포를 처리할 수 있는 다층 세포 배양 플라스크를 사용한 세포 배양을 간략하게 설명합니다.
- 실험에 필요한 총 세포 수를 계산하려면 20μL당 초기 2 × 105 세포에 필요한 스캐폴드 수를 곱합니다.
2. 콜라겐 기반 스캐폴드의 제조
참고: Coll-I-nHA 및 Coll-I-GAG 원통형 스캐폴드(직경 6mm, 높이 4mm)는 확립된 방법 15,21,27을 사용하여 제조됩니다. 이전에 공표된 방법(17)에 따라 화학적으로 가교된 후, 스캐폴드는 1주일 이내에 사용되어야 한다.
- 원하는 기계적 특성을 가진 스캐폴드를 제조한 후 스캐폴드가 완전히 수화되고 인산염 완충 식염수(PBS)로 철저히 세척되었는지 확인하십시오.
참고: 이것은 일반적으로 스캐폴드의 가교 후 ~12시간이 소요되며 4°C에서 100mL 조직 배양 폐기물 용기에서 수행할 수 있으며 용기당 최대 50개의 스캐폴드와 스캐폴드당 2mL의 PBS가 있습니다. - 사용할 준비가 될 때까지 비계를 4°C의 PBS에 보관하십시오.
3. 다층 세포 배양 플라스크에서 신경모세포종 세포 증식
알림: 다층 플라스크의 최적 파종 밀도는 다양합니다. 이 실험에 사용된 플라스크의 경우 제조업체의 지침에 따른 최적의 밀도는 1 × 107 셀입니다. 다층 플라스크를 파종하기 전에 적절한 조직 배양 플라스크(예: T175 cm2 조직 배양 플라스크)에서 세포를 1 × 107 세포 이상의 밀도로 증식시킵니다. 다층 플라스크(섹션 3.1)에 세포를 파종하려면 세포 계수를 수행하기 위한 3.2.16-3.2.20단계를 참조하여 70-80%가 합류할 때까지 세포를 성장시키고 수확하고 mL당 세포 수를 계산합니다. 세포 현탁액이 계수되면 즉시 다층 플라스크의 파종을 진행합니다. 세포 배양 작업은 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행해야 합니다.
- 다층 세포 배양 플라스크 파종
- 550mL의 완전 성장 배지(사용 중인 세포주에 따라 다름)와 100mL의 멸균 PBS를 37°C 수조에서 20분 동안 예열합니다.
- 수확된 세포 현탁액을 사용하여 방정식 (1)을 사용하여 1 × 107개 세포의 최적 파종 밀도를 달성하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하며, 여기서 WANT는 다층 플라스크를 파종하는 데 필요한 세포 수를 나타내고 HAV는 세포 현탁액의 세포/mL 수를 나타냅니다.
(1)
예를 들어,
- 세포 현탁액의 필요한 부피를 예열된 성장 배지 100mL에 추가합니다.
- 후드에 새 다층 플라스크를 넣고 캡을 제거하고 플라스크를 60° 각도로 잡습니다. 세포 현탁액 100mL를 모두 목의 각진 쪽을 따라 플라스크에 천천히 피펫팅합니다. 플라스크의 뚜껑을 덮고 옆으로 눕혀 세포가 층 전체에 고르게 분포되도록 합니다.
- 60° 각도로 예열된 성장 배지 400mL를 목의 각진 면을 천천히 붓거나 피펫팅하여 다층 플라스크에 추가합니다. 목이 가득 차면 플라스크를 똑바로 세우거나 플라스크의 뚜껑을 닫고 옆으로 눕힌 후 다시 붓습니다.
알림: 과도한 기포 형성을 피하기 위해 천천히 붓습니다. 플라스크를 똑바로 세워 가볍게 두드려 모든 기포가 위로 올라오도록 하고 10mL 피펫으로 제거합니다. 플라스크가 목의 바닥 나사산까지 채워졌는지 확인하십시오. 이를 위해 필요한 경우 매체를 더 추가하십시오. - 다층 플라스크의 뚜껑을 닫고 37 °C, 5 % CO2 및 95 % 습도에서 각진 목이 아래를 향하도록 배양합니다.
- 2-3일마다 성장을 확인하여 밀도를 확인합니다. 다층 플라스크의 아래쪽 두 층의 밀도를 확인하려면 도립 현미경의 4x 대물 렌즈로 관찰하십시오.
참고: 1 × 107 개의 신경모세포종 세포를 파종하면 10층 플라스크가 합쳐지는 데 일반적으로 1주일이 걸리지만 사용된 세포주에 따라 다를 수 있습니다.
- 다층 플라스크 내 셀의 일상적인 유지 관리
- 완전 성장 배지 550mL(사용 중인 세포주에 따라 다름), 트립신 50-100mL, 멸균 PBS 300mL를 37°C 수조에서 20분 동안 예열합니다.
- 다층 플라스크의 밀도가 70-80%인지 확인합니다.
- 다층 플라스크를 층류 후드에 넣고 플라스크에서 사용한 매체를 부어 버립니다. 처음에는 매체가 공기 댐 위로 폐기물 용기에 쏟아지도록 플라스크를 기울입니다. 붓는 동안 매체가 플라스크의 각진 목을 따라 흐를 때까지 플라스크를 180° 회전합니다. 이 축을 따라 플라스크를 앞뒤로 돌려 남아 있는 액체를 제거합니다.
- 100mL의 예열된 멸균 PBS를 각진 목 아래로 천천히 추가하여 세포를 세척합니다. 플라스크의 뚜껑을 닫고 PBS가 균일하게 분포되도록 옆으로 눕힌 다음 플라스크를 앞뒤로 돌려 세포를 세척합니다.
- 3.2.3과 같은 방법으로 PBS 세척을 폐기하십시오. 세탁 단계를 반복하십시오.
- 예열된 트립신 50mL를 예열된 멸균 PBS 50mL에 희석합니다. 희석된 트립신 용액 100mL를 다층 플라스크에 넣고 뚜껑을 닫고 플라스크를 옆으로 눕혀 트립신이 균일하게 분포되도록 합니다. 세포주가 잘 부착되어 있는 경우 희석되지 않은 트립신 100mL를 사용합니다.
- 플라스크를 37°C, 5% CO 2 및 95% 습도에서2-5분 동안 배양하고 현미경으로 세포 분리를 모니터링합니다. 필요한 경우 플라스크를 세게 두드려 분리를 돕거나 1분 더 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 다층 플라스크를 층류 후드에 넣고 100mL의 성장 배지로 트립신을 중화합니다. 플라스크의 뚜껑을 닫고 옆으로 눕힌 다음 앞뒤로 흔들어 완전히 중화되도록 합니다.
- 중화된 세포 현탁액을 4 x 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 붓습니다.
참고: 완전한 세포 채취가 필요한 경우 100mL의 멸균 PBS로 다층 플라스크를 다시 세척하고 2 x 50mL 원심분리 튜브에 붓습니다. - 세포 현탁액을 3-4분 동안 340× g 의 속도로 50mL 원심분리 튜브에 넣어 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
- 원심분리기 튜브를 층류 후드로 되돌리고 각 펠릿에서 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 버립니다.
알림: 펠릿은 크고 상대적으로 느슨하므로 쉽게 파손될 수 있습니다. - 각 펠릿에 1-5mL의 성장 배지를 추가하고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 재현탁합니다.
- 하나의 50mL 원심분리기 튜브에 재현탁된 펠릿 4개를 함께 모으고 피펫과 완전히 혼합한 다음 총 부피를 확인합니다.
- 혈구계의 각 외부 사각형에 30-100개의 세포가 포함되도록 세포 계수를 위해 세포 현탁액을 적절하게 희석합니다.
알림: 적절한 시작 희석은 1:100입니다. 이를 위해 세포 현탁액 10μL를 새로운 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 피펫팅하고 990μL의 멸균 PBS로 희석합니다. 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 완전히 섞습니다. - 계수하는 동안 세포 스톡이 들어 있는 50mL 원심분리 튜브를 인큐베이터에 넣습니다.
- 깨끗한 혈구계를 사용하여 그림 2와 같이 그리드 위에 깨끗한 커버슬립을 놓습니다.
- 희석된 세포 현탁액 10μL를 혈구계 챔버에 피펫팅합니다. 10μL가 모두 분주되기 전에 챔버가 가득 차면 피펫팅을 중지하십시오.
- 혈구계를 광학 현미경의 4x 대물렌즈 아래에 놓습니다. 거칠고 미세한 초점을 조정하여 세포를 시각화합니다.
- 그림 2에 강조 표시된 대로 챔버의 바깥쪽 모서리 사각형 4개에 있는 셀의 수를 계산합니다. 4개의 도수를 더하고 4로 나누어 제곱당 평균 셀을 계산합니다.
(1)
그림 2: 혈구계를 사용한 세포 계수. 10 마이크로리터의 세포 현탁액이 커버슬립 아래의 혈구계에 추가됩니다. 그런 다음 챔버를 현미경의 4x 대물 렌즈 아래에 놓고 그리드의 바깥쪽 모서리 4개에 있는 세포 수를 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 평균 카운트에 희석 계수(예: 100)를 곱하고 이 숫자에 10,000을 곱하여 수학식 2를 사용하여 mL당 세포 수를 구합니다.
(2) - 스톡 용액의 총 세포 수를 세포 스톡의 총 부피로 곱하여 계산합니다(예: 4개의 재현탁 펠릿을 모아 20mL 용액을 만든 경우 세포/mL에 20을 곱함).
- 다층 플라스크를 유지하려면 3.1.2단계에서 설명한 방정식 (1)을 사용하여 1 × 107개의 셀을 플라스크에 다시 파딩하는 데 필요한 셀 스톡의 부피를 계산하고 3.1.3-3.1.6 단계를 수행하여 플라스크를 다시 파종합니다. 스캐폴드를 시드할 준비가 되면 다음 섹션으로 진행합니다.
(2)4. 스캐폴드에 신경모세포종 세포 파종
- 스톡 셀 현탁액 준비
참고: 이 프로토콜은 각 밀도 사이에 2의 곱셈 계수를 사용하여 신경모세포종 세포의 4가지 다른 파종 밀도를 생성하는 단계를 간략하게 설명합니다. 따라서 연속 희석은 스톡 현탁액에서 3개의 추가 셀 현탁액을 생성하는 데 사용됩니다. 세포 배양 작업은 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행해야 합니다.- 방정식 (3)을 사용하여 다층 플라스크의 총 셀 수(섹션 3.2.19에서 계산됨)에서 필요한 셀의 부피를 계산하여 첫 번째 파종 밀도 또는 셀 스톡 현탁액을 준비합니다.
(3)
참고: 예를 들어, 가장 높은 파종 밀도가 30개의 스캐폴드에 필요한 스캐폴드당 6 × 10 5개의 셀이고 각 스캐폴드가 20μL의 셀 현탁액을 받는 경우, 스톡 셀 현탁액은 총 부피 600μL(20μL × 30개의 스캐폴드)에서 1.8 × 107 셀(6 ×10 5셀 × 30개의 스캐폴드)이 필요합니다.
이 제제로부터 연속 희석이 수행되므로 이러한 수치는 두 배, 즉 총 부피 1200μL에서 3.6 × 107 세포로 증가해야 합니다. 이것을 mL당 세포에서 WANT로 변환하려면; 3.6 × 107 을 1200 μL로 나누고 1000 μL를 곱하여 mL 당 3 × 107 세포를 제공합니다.
- 멸균 2mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 필요한 부피의 세포 스톡을 추가하고 성장 배지를 사용하여 최종 부피 1200μL를 만듭니다. 이 튜브에 밀도 1이라는 레이블을 붙입니다(그림 3).
- 방정식 (3)을 사용하여 다층 플라스크의 총 셀 수(섹션 3.2.19에서 계산됨)에서 필요한 셀의 부피를 계산하여 첫 번째 파종 밀도 또는 셀 스톡 현탁액을 준비합니다.
- 연속 희석을 수행하여 여러 seeding 밀도 세포 현탁액을 생성합니다.
- 단계 4.1.1에서 준비한 밀도 1 에서 그림 3과 같이 연속 희석을 통해 세포 현탁액의 밀도를 3개 더 준비합니다.
- 성장 배지에서 각 밀도를 2배로 희석합니다. 먼저, 3개의 멸균 2mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 필요한 성장 배지의 최종 부피(이전 예의 600μL)를 추가합니다.
- 밀도 1(600μL)의 절반을 튜브 중 하나로 옮기고 셀 현탁액을 배지와 완전히 혼합하여 희석합니다. 이 튜브에 밀도 2로 라벨을 붙입니다.
- 밀도 2(600μL)의 절반을 다음 튜브로 옮기고 세포 현탁액을 배지와 완전히 혼합하여 희석합니다. 이 튜브를 밀도 3으로 표시합니다.
- 밀도 3(600μL)의 절반을 다음 튜브로 옮기고 셀 현탁액을 배지와 완전히 혼합하여 희석합니다. 이 튜브에 밀도 4로 레이블을 지정합니다.
- 밀도 4에서 600μL를 버리면 4가지 제제의 최종 부피가 모두 600μL가 됩니다.
- 음성 대조군으로 멸균 2mL 원심분리 튜브에만 600μL의 성장 배지를 추가합니다. 연속 희석 공정의 개략도는 그림 3 을 참조하십시오.
(3)
그림 3: 4개의 서로 다른 스캐폴드 파종 밀도에 대해 4개의 현탁액을 준비하기 위한 세포 스톡의 연속 희석. (A) 스캐폴드당 원하는 파종 밀도에 맞게 숫자를 조정할 수 있으며 (B) 밀도당 총 스캐폴드 수를 곱할 수 있으며 각 스캐폴드는 20μL의 셀 현탁액을 받습니다. 이 예에서 밀도 1은 스캐폴드당 6 × 105 개의 셀이 필요하며, 이는 30개의 스캐폴드에 대해 600μL에서 1.8 × 107 개의 셀에 해당합니다. 이 숫자는 600 μL가 다음 튜브에서 600 μL의 성장 배지로 옮겨지고 희석되기 때문에 연속 희석을 시작하기 위해 두 배가 됩니다. 이 프로세스는 각각 인수가 2인 4개의 셀 현탁액이 있을 때까지 계속됩니다. 네거티브 대조군은 튜브에만 600μL의 배지를 첨가하여 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 스캐폴드에 셀 현탁액 추가
알림: 냉장고에서 스캐폴드(PBS에 보관)를 제거하고 셀을 추가하기 전에 실온(RT)이 되도록 하십시오.- PBS의 스캐폴드를 층류 후드로 가져옵니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 웰당 하나의 스캐폴드가 있는 비접착식 24웰 플레이트에 스캐폴드를 배치합니다(그림 1C). 모서리를 잡고 비계를 부드럽게 들어 올리고 컨테이너 측면을 가볍게 눌러 과도한 PBS를 제거합니다. 스캐폴드를 웰 스킨 면이 아래로 향하게 하여 웰 중앙에 추가합니다(스캐폴드의 반짝이는 층 면이 플라스틱 24웰 플레이트를 향하도록 향함).
- 24웰 플레이트에 세포주의 세부 정보, 관련 파라미터(예: 파종 밀도) 및 시점을 라벨링합니다. 한 번에 하나의 세포 파종 밀도로 작업하고 사용할 준비가 될 때까지 37°C 인큐베이터의 나머지 밀도를 유지합니다.
- 층류 후드에서 P20 피펫과 멸균 팁을 사용하여 각 스캐폴드의 중앙에 관련 세포 현탁액 20μL를 부드럽게 추가합니다(그림 1D). 세포를 스캐폴드에 추가하는 동안 잘 혼합하여 세포를 완전히 현탁액으로 유지하십시오. 서스펜션이 비계 위에 남아 있고 셀이 비계에 부착되지 않도록 우물 바닥으로 미끄러지지 않도록 하십시오.
- 세포가 추가되면 대부분의 세포가 부착될 수 있도록 3-5시간(37°C, 5% CO2 및 95% 습도) 동안 플레이트를 배양합니다.
- 배양 후 예열된 성장 배지 1mL를 각 웰에 천천히 부드럽게 추가합니다(그림 1E). P1000 피펫을 사용하여 배지를 추가하여 더 느리고 제어된 동작을 허용하여 스캐폴드의 변위를 방지합니다. 매우 많은 수의 스캐폴드로 작업하는 경우 피펫 건을 '드롭' 및 '낮음'으로 설정한 10mL 피펫을 사용하십시오.
- 24웰 플레이트를 밤새 배양합니다(37°C, 5% CO2 및 95% 습도).
- 스캐폴드의 세포 유지 관리
- 세포 부착의 처음 24시간 후(1일차) 파종된 스캐폴드를 새로운 비부착성 24웰 플레이트로 옮기고 1-2mL의 신선한 성장 배지를 추가합니다.
알림: 이 단계는 플라스틱 24웰 플레이트의 바닥에 떨어진 세포가 스캐폴드에서 자라지 않도록 제거합니다. Day 1로 지정된 비계 복제는 섹션 5에서 논의된 대로 24시간 후에 철거됩니다. 따라서 이러한 비계에는 유지 보수가 적용되지 않습니다. - 처음에 2-3일마다 스캐폴드를 모니터링하여 성장 배지의 색상 변화를 확인합니다. 시간이 지남에 따라 세포가 스캐폴드 내에서 증식함에 따라 세포에 더 자주 먹이를 줍니다.
- 10mL 피펫 건을 사용하여 저속 모드에서 사용한 배지 1mL를 제거하고 폐기합니다. 컨디셔닝된 배지가 필요한 실험을 수행하는 경우, 생물학적 복제물의 사용한 배지를 15mL 원심분리 튜브에 수집하고, 340× g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화하고, 상층액을 새 튜브로 옮기고, -80°C에서 보관합니다.
- 피펫에 다시 점적 기능을 사용하여 예열된 성장 배지 2mL를 스캐폴드에 부드럽게 추가하고 24웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2 및 95% 습도)로 되돌립니다. 원하는 성장 기간 동안 배지를 사용할 때마다 반복하십시오.
- 세포 부착의 처음 24시간 후(1일차) 파종된 스캐폴드를 새로운 비부착성 24웰 플레이트로 옮기고 1-2mL의 신선한 성장 배지를 추가합니다.
5. 비계 회수 및 적용
참고: 각 시점에서 여러 응용 프로그램을 사용하여 스캐폴드의 세포 성장을 모니터링하거나 유전자 및 단백질 발현 프로파일을 평가할 수 있습니다. 스캐폴드 회수 조건은 수행할 분석에 따라 달라지며, 여러 회수 방법이 다음 하위 섹션에 요약되어 있고 그림 4에 설명되어 있습니다.
- 스캐폴드 내 세포 생존력 평가
- 0.2μm 멸균 필터를 통해 층류 후드의 원심분리기 튜브로 여과하여 적절한 세포 생존도 분석 시약을 멸균합니다. 이 멸균 용액을 37°C 수조에서 완전 성장 배지 및 멸균 PBS와 함께 예열합니다.
- 층류 후드에서 멸균 핀셋을 사용하여 분석할 스캐폴드를 새로운 24웰 플레이트로 옮깁니다. 모든 관련 세부 정보로 플레이트에 라벨을 붙입니다.
참고: 분석을 세 번에 걸쳐 수행합니다. - 각 웰에 900μL의 예열된 성장 배지를 첨가한 다음 100μL의 멸균 세포 생존도 시약을 추가합니다. 900 μL의 배지와 100 μL의 멸균 세포 생존도 시약을 스캐폴드가 없는 웰에 추가하여 음성 대조군을 포함합니다. 플레이트의 뚜껑을 교체하고 플레이트를 ~3분 동안 부드럽게 흔들어 희석된 세포 생존도 시약을 웰 전체에 고르게 분포시킵니다. 37 °C, 5 % CO2 및 95 % 습도에서 플레이트를 배양합니다.
참고: 배양 시간은 각 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. 제조업체의 지침을 참조하십시오. 신경모세포종 세포주의 경우 4-6시간 배양이 최적으로 보입니다. - 배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 몇 초 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 층류 후드에서 새로운 반투명 96웰 플레이트를 엽니다. 24웰 플레이트의 각 웰에서 배양된 배지와 시약을 웰당 100μL로 96웰 플레이트의 3개 웰로 옮겨 기술적 삼중도를 제공합니다.
참고: 이 이동은 700웰 플레이트의 웰에 24μL를 남깁니다. - 세포 생존도 시약을 빛으로부터 보호하기 위해 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다.
- 24웰 플레이트의 각 스캐폴드에서 나머지 700μL의 웰 내용물을 제거하고 폐기합니다. 멸균 PBS 1mL로 각 스캐폴드를 두 번 세척합니다.
알림: 모든 색상이 비계에서 제거되지는 않습니다. 그런 다음 이러한 스캐폴드를 0.1M 중탄산나트륨(NaHCO3) 용액의 1% Triton X-100 1mL에 넣고 -80°C에서 보관하여 DNA 정량화와 같은 추가 응용 분야에 사용할 수 있습니다(섹션 5.2, 그림 4B 참조). - 층류 후드에서 96웰 플레이트를 제거하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm 및 600nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 두 파장에서 흡광도 값을 기록하고 제조업체의 지침에 따라 세포에 의한 세포 생존도 시약의 감소율을 계산합니다.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 생존율 결과를 그래프로 표시하고 통계적으로 분석합니다. 생물학적 삼중 값을 입력하여 오차 막대를 생성하고 분석 변동성을 나타냅니다.
- 실험 기간 동안 세포 생존율의 변화를 조사하려면 적절한 생물통계 소프트웨어를 사용하여 평균을 여러 번 비교하는 일원 분산 분석(ANOVA) 검정을 수행합니다.
- 그래프의 시점 간에 유의한 차이를 ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) 및 **** (P≤0.0001)로 나타냅니다.
그림 4: 각 시점에서 서로 다른 분석을 위한 스캐폴드 검색. (A) 세포 생존율 분석을 위해 3개의 스캐폴드 복제물을 검색합니다. (B) 그런 다음 이 스캐폴드를 PBS에서 세척하고, 0.1M NaHCO3의 1% Triton X-100에 배치하고, DNA 정량을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. (C) 3개의 추가 반복을 15분 동안 10% PFA에 고정하고, PBS에서 중화하고, 조직학적 염색 및 이미징을 위해 4°C에서 보관합니다. (D) 마지막으로 3개의 복제물을 페놀/구아니딘 기반 세포 용해 시약에 첨가하고 유전자 발현 분석을 위해 -20°C에서 보관합니다. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; PFA = 파라포름알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 스캐폴드의 세포에서 DNA의 정량화
참고: 5.1.7단계 이후의 주석에서 언급한 바와 같이, DNA 정량화를 위한 스캐폴드 검색에는 0.1M NaHCO3 용액에 1% Triton X-100 1mL가 들어 있는 2mL 원심분리 튜브에 스캐폴드를 넣은 다음 -80°C에서 보관하는 작업이 포함됩니다. DNA 분석을 수행하기 전에 세포는 신경모세포종 세포를 적절하게 용해하고 정량화를 위해 DNA를 방출하기 위해 세 번의 동결-해동 주기를 거쳐야 합니다.- 이전에 Triton X-100에 보관했던 샘플을 -80°C에서 제거합니다. 샘플을 1-3시간 동안 또는 해동될 때까지 RT에 그대로 둡니다.
- 샘플을 10-20초 동안 소용돌이치게 하고 샘플을 -80°C에서 18-24시간 동안 또는 완전히 얼 때까지 다시 놓습니다. 이 과정을 총 3회의 동결-해동 주기에 대해 반복합니다.
- DNA 수율을 최대화하려면 조직 용해기를 사용하여 스캐폴드의 세포를 파괴하십시오.
- Triton X-100의 스캐폴드가 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 금속 비드를 넣고 어댑터 안에 튜브를 넣어 2-3분 동안 초당 50회 진동으로 샘플을 흔듭니다.
알림: 금속 비드가 테이퍼 바닥 튜브에 박힐 수 있으므로 둥근 바닥 원심분리기 튜브를 사용하십시오.
- Triton X-100의 스캐폴드가 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 금속 비드를 넣고 어댑터 안에 튜브를 넣어 2-3분 동안 초당 50회 진동으로 샘플을 흔듭니다.
- 형광 이중 가닥 DNA(dsDNA) 염색을 적용하여 Triton X-100 용액의 DNA를 정량화하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 방출을 측정합니다. 제조업체의 지침을 참조하십시오. Tris-ethylenediamine tetraacetic acid(TE) 완충액에서 샘플을 적절하게 희석하여 TE 완충액에서 연속 희석을 통해 8개의 dsDNA 표준물질을 준비합니다(그림 5).
- 검은색 불투명 96웰 플레이트에서 각 표준물질 또는 시료 100μL를 테크니컬 트리플리케이트의 웰에 추가합니다.
- 형광 dsDNA 염색을 TE 버퍼에 200배 희석하고 멀티채널 피펫을 사용하여 각 표준물질/샘플에 100μL를 추가합니다. 접시를 은박지로 덮고 상온에서 5분 동안 배양합니다.
- 520nm에서 각 웰의 형광을 측정하고 기록합니다. 제조업체의 지침에 따라 각 샘플의 DNA 농도를 계산하십시오.
참고: 사용 중인 세포주에 대해 세포당 DNA의 평균 농도를 알고 있는 경우 방정식 (4)를 사용하여 DNA 농도 값을 세포 수로 변환할 수 있습니다.
(4) - 적절한 소프트웨어를 사용하여 DNA 정량화 결과를 그래프로 표시하고 통계적으로 분석합니다. 생물학적 삼중 값을 입력하여 오차 막대를 생성하고 분석 변동성을 나타냅니다.
- 실험 기간 동안 DNA 농도/세포 수의 변화를 조사하려면 적절한 생물통계 소프트웨어를 사용하여 평균을 여러 번 비교하는 일원 분산 분석을 수행합니다.
- 그래프에서 시점 간의 유의미한 차이를 ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) 및 **** (P≤0.0001)로 나타냅니다.
(4)
그림 5: 표준 곡선 생성을 위한 8가지 DNA 표준물질 준비. λDNA의 원액은 100μg/mL로 제공됩니다. 이것은 TE 완충액에서 50배 희석되어 2000ng/mL에서 표준물질 A를 생성합니다. 그런 다음 400μL의 A를 400μL TE 완충액을 포함하는 튜브 B로 옮깁니다. 그런 다음 400μL의 B를 전달하고 C에서 2배 희석하는 식으로 G. 표준 H는 TE 완충액으로만 구성되므로 DNA 농도가 0ng/mL가 될 때까지 계속됩니다. 약어: TE = Tris-EDTA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 조직학적 염색을 위한 스캐폴드의 준비
참고: 스캐폴드는 현미경 및 이미징 목적으로 면역형광(IF)을 위한 전체 스캐폴드 또는 조직학적 염색 또는 면역조직화학(IHC)을 위한 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 슬라이스로 고정 및 염색할 수 있습니다. 이를 통해 스캐폴드 내 세포 침투 및 분포를 정성적으로 평가할 수 있으며 단백질 발현을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.- PBS에서 10% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다. 스캐폴드당 500μL의 최종 부피에 대한 충분한 용액이 있는지 확인합니다.
- 이 용액을 37°C에서 예열하고 스캐폴드 회수를 위해 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브에 500μL를 추가합니다.
- 비접착식 24웰 플레이트에서 스캐폴드를 제거하고(4.4.4단계) 층류 후드에 놓습니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 스캐폴드를 10% PFA가 포함된 라벨이 부착된 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 비계를 PFA 용액에 15분 동안 고정합니다. 각 튜브에 500μL PBS를 첨가하여 PFA를 중화하고 4°C에서 보관합니다.
- 자동 티슈 프로세서용 스캐폴드를 준비하려면 4°C에서 스캐폴드를 제거하고 핀셋을 사용하여 연필로 모든 관련 세부 정보가 표시된 플라스틱 카세트에 넣습니다. 모든 카세트를 티슈 프로세서의 금속 용기에 넣습니다.
- 조직 프로세서에서 12단계 프로토콜을 시작하여 스캐폴드를 고정, 탈수, 청소하고 밤새 파라핀을 침투시킵니다. 처리된 샘플이 포함된 카세트를 수집합니다.
- 다음으로, 스캐폴드를 파라핀 왁스 블록에 삽입하여 스캐폴드의 마이크로토미를 매우 얇은 조각으로 만들어 염색할 수 있도록 합니다.
알림: 카세트에서 스캐폴드를 제거하고 왁스에 삽입할 때 스캐폴드의 방향을 고려하는 것이 특히 중요한데, 이는 이미지가 촬영되는 각도에 영향을 미치기 때문입니다. 이는 스캐폴드로의 세포 침투를 평가할 때 중요합니다. - 왁스 임베더와 냉각판을 켭니다. 뚜껑을 들어 올려 왁스의 수준을 확인하십시오. 필요한 경우 리필하십시오.
- 한 번에 하나의 샘플로 작업하면서 카세트를 열고 스캐폴드를 제거한 다음 플라스틱 몰드의 중앙에 놓습니다.
- 뜨거운 왁스를 샘플에 붓고 올바른 방향이 유지되도록 하고 필요한 경우 왁스가 응고되기 전에 따뜻한 핀셋으로 조정합니다. 금형을 채우기 위해 더 많은 왁스를 붓습니다.
- 라벨이 붙은 카세트 뚜껑을 플라스틱 몰드 위에 놓고 그 위에 왁스를 추가합니다. 왁스를 응고시키기 위해 냉각판에 금형을 놓습니다. 마이크로토미 전에 파라핀 왁스가 완전히 응고되도록 4°C에서 밤새 보관합니다.
- 마이크로토미를 준비하려면 35°C 수조, 건조판 및 마이크로톰을 켭니다.
- 홀더에 칼날을 삽입하고 레버를 조여 고정합니다.
- 트림 및 단면 두께를 설정하며, 일반적으로 비계 단면의 경우 5mm입니다.
- 금형에서 FFPE 스캐폴드를 제거하고 마이크로톰 전면의 홀더에 고정한 다음 섹션을 절단하기 전에 샘플 가장자리 주변의 여분의 왁스를 조심스럽게 다듬습니다.
- 마이크로톰의 레버를 돌려 왁스 블록을 절단하기 시작하여 부드러운 움직임을 보장합니다.
- 한 번에 약 3개의 비계 섹션인 리본 모양의 섹션을 모아 35°C 수조에 부드럽게 넣어 주름을 제거합니다. 수조에 있는 동안 핀셋을 사용하여 섹션을 부드럽게 분리합니다.
- 폴리신 코팅된 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션이 슬라이드 중앙에 오도록 수조에서 각 섹션을 들어 올립니다. 각 슬라이드에 연필로 레이블을 붙입니다.
- 유리 슬라이드를 건조판 또는 60°C 건조 오븐에 놓습니다. 건조되면 4 °C에서 보관하고 필요한 조직학적 또는 IHC 염색을 진행합니다.
- 유전자 발현 분석을 위한 스캐폴드 회수
- 인큐베이터에서 비접착식 24웰 플레이트에서 스캐폴드를 제거하고(4.4.4단계) 층류 후드에 놓습니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 스캐폴드를 라벨이 부착된 새 2mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 흄 후드에서 각 튜브에 페놀/구아니딘 기반 세포 용해 시약 1mL를 추가하여 스캐폴드의 세포를 용해하고 고품질 RNA를 회수할 수 있습니다.
- 적절한 키트를 사용하여 RNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 -20°C에서 튜브를 보관합니다. 표준 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)17을 사용하여 스캐폴드의 세포에서 유전자 발현을 평가합니다.
Representative Results
여기에 설명된 콜라겐 기반 스캐폴드 모델은 신경모세포종 생물학 연구에서 기존 2D 세포 배양보다 생리학적으로 더 유사한 환경에서 항암 치료제 스크리닝에 이르기까지 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다. 주어진 연구 질문을 테스트하기 전에 원하는 실험 기간 내에 세포 부착, 증식 및 침투에 대한 완전한 특성을 얻는 것이 중요합니다. 성장 조건은 각 특정 세포주의 생물학에 따라 달라집니다. 중요한 것은 최적의 조건과 강력한 성능을 결정하기 위해 여러 가지 세포 성장 평가 방법을 구현해야 한다는 것입니다.
여기서, 스캐폴드에서 성장한 신경모세포종 세포의 생존력은 비색 세포 생존도 분석을 사용하여 평가되었습니다. 이 분석은 실험 기간 동안 원하는 만큼 자주 수행할 수 있습니다. 설명된 실험의 경우, 4개의 서로 다른 밀도로 Coll-I-nHA 스캐폴드에서 성장한 2개의 신경모세포종 세포주, KellyLuc 및 IMR32에 대해 1일, 7일, 14일에 세포 생존도 평가를 수행했습니다(그림 6). 1일차의 생존율은 모든 후속 측정을 비교하기 위한 기준선으로 설정되었습니다. 세포 생존도 시약의 감소율은 증식 속도 및 대사를 포함하여 개별 세포주의 세포 생물학 및 성장 특성을 반영합니다. 스캐폴드에 파종된 세포의 수와 감소 수준 사이의 상관관계가 예상되었습니다. 이 실험에서, 세포 생존도 시약의 감소는 일반적으로 예상대로 모든 밀도에서 두 세포주에 대한 각 시점에 따라 증가하였다.
그런 다음 각 밀도를 두 세포주에 대해 개별적으로 평가하여 시점에 따른 감소를 비교했습니다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석을 수행하여 시점 간 감소의 유의미한 차이를 감지했습니다(그림 7). 세포주와 모든 파종 밀도 모두에 대해 1일과 14일을 비교할 때 세포 생존도 시약의 감소가 유의하게 증가했습니다(P<0.05). 이것은 스캐폴드에 존재하는 대사 활성 세포의 상당한 증가를 나타냅니다. 이러한 증가는 7일 간격(1일 대 7일, 7일 대 14일)을 평가할 때 모든 경우에 유의하지 않았으며, 이는 원하는 성장 창을 달성하기 위해 파종 밀도 최적화의 중요성을 보여줍니다.
세포 생존도 분석 결과를 뒷받침하기 위해 형광 dsDNA 염색을 사용하여 스캐폴드에서 추출한 dsDNA의 정량을 통해 스캐폴드의 세포 성장을 간접적으로 측정할 수도 있습니다(그림 8A). 세포 생존율과 마찬가지로 DNA 정량화는 실험 일정 내에서 원하는 만큼 자주 수행할 수 있습니다. 그러나 이 분석은 스캐폴드의 완전한 회수와 세포 성장의 종료가 필요하므로 섹션 1에서 논의한 대로 실험 계획에 포함되어야 합니다. 이 실험을 위해 DNA는 4가지 밀도의 Coll-I-nHA 스캐폴드에서 성장한 두 개의 신경모세포종 세포주인 KellyLuc 및 IMR32에 대해 1일, 7일 및 14일에 정량화되었습니다. 이러한 세포주에 대해 세포당 dsDNA의 평균 농도가 알려져 있기 때문에 정량화된 DNA에서 샘플당 세포 수를 도출할 수 있었습니다(그림 8B).
DNA 정량화는 세포 생존율 평가보다 생물학적 복제 간에 더 높은 변동성을 발생시켰지만 일반적으로 각 시점에 증가했으며 14일째에 가장 높은 수준이 정량화되었습니다. IMR32 세포는 KellyLuc 세포보다 DNA 농도로 표시되는 Coll-I-nHA 스캐폴드에서 더 높은 세포 수에 도달하는 것으로 보입니다. 그런 다음 두 세포주에 대해 각 밀도를 개별적으로 평가하여 시점에 따른 감소를 비교했습니다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석을 수행하여 시점 간 감소의 유의미한 차이를 감지했습니다(그림 8B).
세포주와 모든 파종 밀도 모두에서 파종 밀도 4(1 × 105 세포/스캐폴드)에서 KellyLuc를 제외하고 1일과 14일을 비교할 때 세포 수가 유의하게 증가(P<0.05)했으며, 이는 어떤 시점에서도 유의한 증가를 나타내지 않았습니다. 세포 생존율 결과와 유사하게, 7일 간격(1일 대 7일, 7일 대 14일)을 평가했을 때 모든 경우에 증가가 유의하지는 않았습니다. 세포 생존율과 DNA 정량화에 대한 시점 추세를 비교할 때 두 분석 사이에는 약간의 차이가 있었습니다. 그러나 전반적으로 유사한 추세가 관찰되었으며, 대부분의 밀도에서 7일 간격 사이에 평균값이 증가했습니다. 이는 두 가지 이상의 방법을 사용하여 세포 성장을 모니터링하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다.
다음으로 스캐폴드의 세포 성장 형태 및 분포에 대한 시각적 평가가 구현되었으며, 여기에는 IHC뿐만 아니라 전통적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색이 포함됩니다. 개별 세포주의 상이한 성장 패턴은 스캐폴드에 대한 다양한 침투 정도와 세포 군집을 포함하여 스캐폴드의 다양한 공간 배열로 이어질 것으로 예상됩니다. 스캐폴드는 포르말린으로 고정되고 파라핀이 포매되어 5mm 섹션으로 절단되었으며(그림 9A) 조직학적 염색 및 IHC를 포함한 여러 시각화 기술을 위해 스캐폴드를 준비했습니다.
일상적인 H&E 염색은 1일, 7일, 14일에 콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 Kelly, KellyCis83 및 IMR32 세포에 적용되었습니다(그림 9B). 이를 통해 14일 동안 두 개의 콜라겐 기반 스캐폴드에서 세포의 공간 방향을 시각화할 수 있었습니다. 시스플라틴에 민감한 Kelly 세포와 저항성 KellyCis83 세포는 Coll-I-nHA 스캐폴드(그림 9B, i) 및 Coll-I-GAG 스캐폴드(그림 9B, ii) 모두에서 성장했습니다. 이전에 발표된 데이터와 일치하게, KellyCis83 세포는 덜 침습적인 Kelly 세포주보다 더 빠른 속도로 성장했고 두 스캐폴드 조성물 모두에 더 깊이 침투했습니다. Coll-I-nHA에서 성장한 또 다른 신경모세포종 세포주인 IMR32의 H&E 염색은 대조적인 성장 패턴을 보여줍니다(그림 9B, iii). 이 세포주는 14일 동안 콜라겐 지지체에서 크고 조밀하게 밀집된 클러스터로 성장했습니다. 명시야 컨포칼 현미경은 콜라겐 섬유의 자가형광으로 인해 콜라겐 기반 스캐폴드의 다공성 구조를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다(그림 9C).
세포골격 액틴을 표적으로 하는 팔로이딘과 핵 대조염색인 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로 세포를 염색하여 실험 타임라인 전반에 걸쳐 특정 세포 형질을 모니터링했습니다. 이 기술을 사용하여 Coll-I-GAG 스캐폴드의 Kelly 및 KellyCis83 세포에서 풍부한 액틴이 관찰되었습니다(그림 9D). 이러한 결과는 이 프로토콜을 사용하여 스캐폴드에서 성장한 신경모세포종 세포에서 공간적으로 분해된 정보를 도출하기 위해 여러 이미징 기술을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 주어진 기간 동안 콜라겐 기반 스캐폴드의 세포 성장 패턴에 대한 이러한 특성화는 모든 다운스트림 생화학 분석의 이해와 해석을 향상시킬 것입니다.
콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 세포에 의한 단백질 발현을 분석하여 세포 활성을 생체 내 시나리오와 비교할 수 있습니다. 이전에 발표된 데이터는 Coll-I-nHA 및 Coll-I-GAG 스캐폴드뿐만 아니라 세포 단층에서 성장한 KellyLuc 및 KellyCis83Luc 세포에 의한 신경모세포종의 대리 분비 마커로서 크로모그라닌 A(CgA)의 발현을 조사했습니다(그림 10). CgA는 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 조건화된 배지에서 평가되었습니다(그림 10A). CgA는 Kelly보다 더 공격적인 화학저항성 KellyCis83 세포주에서 더 높은 비율로 분비됩니다(그림 10B,C). 이는 Coll-I-GAG 및 Coll-I-nHA 스캐폴드(P<0.05) 모두에서 7일째에 유의한 반면, 기존 2D 배양에 의해 단층으로 성장한 세포의 경우 이 시점에서 유의미한 차이가 없었습니다.
이러한 결과는 또한 단층에서 세포를 성장시킬 때 제한된 실험 일정을 강조하며, 세포가 밀도에 도달하기 전에 단 7일의 성장이 가능한 것으로 입증되었습니다. 스캐폴드에서 세포의 성장은 생리학적으로 더 적절한 조건에서 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있기 때문에 이러한 한계를 극복합니다. 세포 생존율, DNA 함량, 세포 형태 및 공간 배열, 발현 프로파일에 대한 정보를 획득하기 위한 위의 기술 조합은 다양한 콜라겐 기반 스캐폴드에서 신경모세포종 세포의 성장을 평가하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 또한 특정 실험 요구 사항 및 원하는 응용 분야를 충족하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.
그림 6: 세포 생존율 분석. (A) 비색 세포 생존력 분석을 사용하여 콜라겐 기반 스캐폴드에서 신경모세포종 세포의 생존력을 측정하기 위한 일반 절차. 배양 기간은 제조업체의 지침에 따라 각각의 새로운 세포주에 맞게 최적화되어야 합니다. (B) 1일, 7일, 14일에 측정한 4가지 다른 초기 파종 밀도에서 Coll-I-nHA 스캐폴드에서 성장한 KellyLuc 및 IMR32 세포에 의한 세포 생존도 시약의 백분율 감소. 샘플은 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 사용하여 생물학적 삼중으로 평가되었습니다. 약어: nHA = 나노하이드록시아파타이트; Coll-I-nHA = nHA가 보충된 콜라겐 스캐폴드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 14일 동안 Coll-I-nHA에서 성장한 세포의 파종 밀도에 따른 세포 생존율. (A) 켈리루크; (비) IMR32. 제목이 지정된 세포 번호는 0일째에 스캐폴드의 초기 세포 파종 밀도를 나타냅니다. 샘플은 생물학적 삼중으로 평가되었으며, 삼중 점으로 표시되며 막대는 평균을 나타냅니다. 다중 비교를 통한 일원 분산 분석(One-Way ANOVA with Multiple Comparisons)을 사용하여 그래프에 표시된 세 가지 시점에 걸쳐 세포 생존도 시약 감소율의 유의미한 차이를 검출했습니다(ns P > 0.05, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001). 약어: nHA = 나노하이드록시아파타이트; Coll-I-nHA = nHA가 보충된 콜라겐 스캐폴드; ANOVA = 분산 분석; ns = 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 스캐폴드의 세포에서 추출한 DNA의 정량화. (A) 형광 dsDNA 염색을 사용하여 콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 세포의 dsDNA를 정량화하는 과정. (B) 14일 동안 Coll-I-nHA에서 성장한 KellyLuc 및 IMR32 세포에 대한 파종 밀도에 의한 DNA 정량 분석의 세포 수. 제목이 붙은 세포 번호는 0일째에 스캐폴드에 대한 초기 세포 파종 밀도를 나타냅니다. 샘플은 생물학적 삼중으로 평가되었으며, 삼중 점으로 표시되며 막대는 평균을 나타냅니다. 다중 비교를 통한 일원 분산 분석은 그래프에 표시된 세 가지 시점에 걸쳐 셀 수의 유의미한 차이를 감지하는 데 사용되었습니다(ns P > 0.05, * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001). 약어: nHA = 나노하이드록시아파타이트; Coll-I-nHA = nHA가 보충된 콜라겐 스캐폴드; dsDNA = 이중 가닥 DNA; TE = 트리스-EDTA; ANOVA = 분산 분석; ns = 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 스캐폴드의 면역조직화학 분석을 위한 조직 처리 단계 . (A) 이미지 분석을 위한 스캐폴드 처리를 위한 프로토콜의 개략도 표현. 이 과정을 통해 1차 항체 및 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 일상적인 조직학적 염색 및 특이 항체 탐침이 가능합니다. (B) H&E 염색을 받은 3개의 신경모세포종 세포주의 대표 이미지. H&E 이미지는 실험 기간 동안 성장 패턴을 모니터링하기 위해 1일, 7일, 14일에 촬영됩니다. 스케일 바 = 200μm. 파선 사각형은 왼쪽 아래 가장자리에서 확대된 20x 이미지에 대해 선택된 영역을 나타냅니다. 척도 막대 = 20μm. (i 및 ii) 두 가지 유형의 콜라겐 기반 스캐폴드에서 Kelly 및 KellyCis83 신경모세포종 세포주(각각 상부 및 하부 패널)의 H&E. (iii) Coll-I-nHA 스캐폴드에서 클러스터된 세포 성장을 나타내는 IMR32 세포주의 H&E. (C) 명시야 컨포칼 현미경으로 촬영한 Kelly 세포주의 대표 이미지. 콜라겐 자가형광은 다공성 지지체의 시각화를 가능하게 합니다. 10x 축척 막대 = 200 μm, 20x 축척 막대 = 20 μm. (D) 10x 배율로 팔로이딘 및 DAPI를 사용한 IHC로 분석한 후 내장된 지지체의 대표 이미지, 축척 막대 = 200μm. 더 작은 내부 사각형은 확대된 이미지(20x)를 나타내며 축척 막대 = 20μm입니다. 약어: nHA = 나노하이드록시아파타이트; Coll-I-nHA = nHA가 보충된 콜라겐 스캐폴드; GAG = 글리코사미노글리칸; Coll-I-GAG = 콘드로이틴-6-설페이트가 보충된 콜라겐 스캐폴드; H&E = 헤마톡실린 및 에오신; IHC = 면역조직화학; DAPI = 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 3D 콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 신경모세포종 세포의 단백질 발현과 2D 플라스틱의 비교. (A) 2D 플라스틱 또는 3D 콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 세포의 조건화된 배지에서 CgA ELISA를 수행하는 방법의 개략도. (B) 2D 플라스틱 단층에서 성장한 세포의 조건화된 배지에서 채취한 CgA 단백질 발현 수준. 세포가 7일 후에 밀도에 도달했기 때문에 14일 시점을 읽을 수 없었습니다. 플라스틱을 투여한 지 7일째 되는 날, Kelly와 KellyCis83 세포주 간에 CgA 수치에는 큰 차이가 없었습니다. (C) CgA ELISA는 연속 14일 동안 콜라겐 기반 스캐폴드에서 성장한 세포의 조건화된 배지를 사용하여 수행되었습니다. 7일째, 두 콜라겐 스캐폴드에서 CgA 수준은 더 공격적인 KellyCis83 세포주에서 더 높으며, 이는 2D 단층에 비해 3D 매트릭스에서 CgA의 생리학적 관련성 수준이 더 높다는 것을 강조합니다. 이 그림은 Curtin et al.17에서 수정되었습니다. 약어: 3D = 3차원; 2D = 2차원; CgA = 크로모그라닌 A; ELISA = 효소 결합 면역 흡착 분석; nHA = 나노하이드록시아파타이트; Coll-I-nHA = nHA가 보충된 콜라겐 스캐폴드; GAG = 글리코사미노글리칸; Coll-I-GAG = 콘드로이틴-6-설페이트가 보충된 콜라겐 스캐폴드; TMB = 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; HRP = 서양고추냉이 과산화효소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
3D 스캐폴드-암 세포 모델은 단순화된 TME32에서 신경모세포종 세포의 성장, 생존력 및 세포 침투에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위한 가치 있고 다재다능한 도구로 입증되었습니다. 여기에 설명된 3D 신경모세포종 모델은 최소 TME를 모방하고 2D 단층 배양보다 생리학적으로 더 관련성이 높은 데이터를 제공합니다. 3D 세포 배양의 주요 단점은 실험 복잡성이 증가하고 시간이 길어진다는 것입니다. 여기에 설명된 것은 콜라겐 기반 스캐폴드에서 신경모세포종 세포의 파종, 성장 및 유지를 위한 최적화된 프로토콜과 다운스트림 분석 및 응용을 통해 세포 성장에 대한 강력한 특성 분석을 제공합니다. 우리는 스캐폴드의 최적 세포 파종 밀도에 대한 통찰력을 얻어 신속한 14일간의 실험 기간 내에 항암제 치료를 평가하기 위한 예측 가능하고 제어 가능한 환경을 조성하는 것을 목표로 했습니다. 설명된 모든 간단한 프로토콜의 조합은 스캐폴드 기반 시험관 내 배양 시스템에서 신경모세포종 세포 성장에 대한 균형 잡힌 평가를 제공합니다.
프로토콜 설정의 중요한 점은 과학자들이 실험실에서 신속하게 확립할 수 있도록 강조되었습니다. 예를 들어, 비색 세포 생존도 분석의 더 나은 성능을 위해 표시된 배양 시간을 통해 시약을 스캐폴드 공극에 더 깊이 침투하여 모든 세포에 도달할 수 있습니다. 또한 형광 dsDNA 염색 기술은 강력하고 간단합니다. 그러나 스캐폴드에서 DNA를 방출하려면 세포가 콜라겐 섬유 내에 '갇혀' 있기 때문에 활발한 세포 용해가 필요합니다.
설명된 간단한 DNA 정량 분석을 사용하여 이 모델을 사용하여 항암 약물 스크리닝을 위한 콜라겐 기반 스캐폴드의 로그 성장 단계를 식별할 수 있습니다. 설명된 실험 설정에서, 4개의 초기 세포 파종 밀도를 전체 14일 기간 및 1일, 7일 및 14일의 분석 시점과 함께 사용했습니다. 우리는 4 × 105 세포/스캐폴드에 파종된 KellyLuc 세포가 7일과 14일 사이에 가장 유의미하게 활성화된 증식 창을 가지고 있음을 확인했습니다. 이 로그 단계 성장 데이터를 통해 다양한 세포 독성 실험에 대한 신뢰할 수 있는 해석을 할 수 있습니다. 약물 독성이 아닌 3D 다공성 플랫폼에서 억제된 성장으로 인한 성장 감소 또는 세포 사멸에 대한 추측을 제거합니다. 세포 생존율은 또한 다양한 세포 유형의 성장을 지원하기 위한 3D 플랫폼의 적합성에 대해 널리 사용되는 평가입니다33,34. 살아 있는/죽은 염색, ATP 측정, 증식 분석 등 세포 생존율을 측정하기 위한 많은 분석법이 있지만, Alamar Blue 비색 세포 생존도 분석을 사용하는 것이 DNA 정량 데이터를 지원하는 간단하고 효과적인 기술이라는 것을 알게 되었습니다.
DNA 정량화와 세포 생존력의 결합은 평균적으로 14일 동안 지속적인 성장을 달성하기 위해 스캐폴드에 세포를 파종하는 최적의 밀도가 스캐폴드당 2-4 × 105 셀이라는 보완적인 증거를 제공했습니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 실험 기간, 분석 시점 및 다운스트림 애플리케이션을 충족하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스캐폴드에서 신경모세포종 세포의 단일배양 세포 성장의 평가를 설명하지만, 스캐폴드는 상처 치유 조사에서 각질세포와 섬유아세포를 공동 배양하기 위해 콜라겐-GAG 스캐폴드를 활용한 do Amaral et al.에 의해 설명된 공동 배양을 위한 플랫폼으로 사용하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다35.
설명된 3D 모델은 면역형광 및 표준 H&E와 같은 잘 알려진 다양한 기술을 사용하여 세포 성장 및 침투를 시각화할 수 있습니다. 스캐폴드의 세포 형태 및 성장 패턴의 다양성으로 인해 생화학적 분석을 사용하여 성장 특성화와 함께 세포를 시각화하는 것이 중요합니다. 성장 패턴을 이해하면 성장 행동과 항암제에 대한 향후 반응에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, DNA 정량화를 사용한 IMR32 성장은 Kelly와 유사한 패턴을 생성하지만, H&E를 사용한 시각화 시 IMR32는 Kelly보다 더 큰 클러스터에서 성장하여 더 분산된 성장을 보였습니다(그림 9). 스캐폴드에서 세포주의 이러한 다양한 성장 패턴은 종양 이질성의 임상 시나리오를 반영합니다. 3D 스캐폴드에서 형태가 다른 세포주 패널을 사용하여 항암제 반응을 검사하면 동일한 약물에 대한 환자 반응에 대한 예측 값이 높아집니다.
유전자 또는 단백질 발현의 검출은 관심 단백질이 분비되는 경우 RT-qPCR 또는 ELISA와 같은 다른 접근법을 사용하여 수행할 수도 있습니다. 신경모세포종 진행의 대리 마커인 크로모그라닌 A(CgA)36을 사용하여 신경모세포종 세포 성장을 3D로 추가로 특성화했습니다. 이전 연구17에서 설명한 바와 같이, 세포가 증식함에 따라 CgA 분비가 증가하였다(그림 10). 단층 세포 배양은 이러한 증가를 포착할 수 없었지만, 증식은 세포가 배양 접시에서 완전한 밀도에 도달했음을 의미하기 때문에 3D 콜라겐 스캐폴드를 사용하여 CgA 분비를 장기간 평가할 수 있었습니다.
이 3D in vitro 모델은 신경모세포종 생물학 및 치료제에 대한 반응을 연구하기 위한 모든 연구 질문에 적합하지 않을 수 있습니다. 한계 중 하나는 스캐폴드 내에서 고르지 않은 세포 침투와 다양한 크기의 세포 클러스터가 형성되는 것인데, 이는 주어진 세포주에 따라 다르며 영양소 및 테스트 약물의 통제할 수 없는 확산으로 이어질 수 있습니다. 이 특징은 치료 스크리닝의 견고성에 영향을 미칩니다. 그러나 이러한 한계에도 불구하고 네이티브 종양은 크기와 암세포 분포가 이질적이며 종양 조직 내에 다른 많은 세포 유형을 포함한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 각 세포가 채워진 스캐폴드를 단일 미세조직으로 사용할 것을 제안합니다: (a) 세포 생존도 시약이 세포 및 세포 클러스터에 도달하기 위한 배양 시간, (b) 조직 용해기로 스캐폴드의 세포를 스캐폴드 깊숙이 포함된 세포의 DNA를 방출하기 위해 스캐폴드의 세포를 전처리하여 Triton X-100 완충액에서 세포 용해.
이 프로토콜의 또 다른 기술적 한계는 이 모델에 대해 새로 제조된 비계의 각 배치에 대한 기계적 테스트가 부족하다는 것입니다. 그러나, 압축 및 인장 계수, 다공성 및 시각적 기공 구조, 균질성과 같은 비계의 물리적 및 화학적 특성과 관련하여 광범위하게 특성화된 비계의 견고한 제조 공정을 사용하면 배치 21,24,27,30,37을 통해 비계 품질이 유지되도록 합니다.
요약하면, 이 논문은 콜라겐 기반 스캐폴드에서 세포 성장을 분석하기 위한 일련의 간단한 방법을 제시합니다. 실험 일정과 분석 지점은 특정 연구 질문에 따라 서로 바뀔 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 위에 제시된 결과는 이러한 분석법 모음이 어떻게 다양한 신경모세포종 세포주에 대한 최적의 파종 밀도에 대한 통찰력을 제공하여 14일 동안 지속적인 성장을 생성하는지에 대한 증거를 제공합니다. 이 프로토콜의 모든 방법에서 얻은 결과의 융합은 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 세포 성장에 대한 우수한 이해를 제공합니다. 이 모델의 향후 활용에는 신경모세포종 TME에 특화된 공동 배양 시스템과 다양한 새로운 항암 약물의 테스트가 포함될 것입니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 아동 연구 센터(National Children's Research Centre, NCRC), 아일랜드 연구 위원회(Irish Research Council, IRC) 및 영국 신경모세포종(Neuroblastoma UK)의 지원을 받았습니다. 일러스트레이션은 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | |
| Kelly | ECACC | 82110411 | |
| KellyCis83 | Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) | - | Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | |
| Disposable | |||
| 0.22 µm syringe filter | Millex | SLHP033RS | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 100 mL sterile Pot | Starstedt | - | |
| 10 mL plastic pipette | Cellstar | 607 180 | |
| 15 mL Falcon tube | Starstedt | 62.554.502 | |
| 25 mL plastic pipette | Cellstar | 760 180 | |
| 50 mL Falcon tube | Starstedt | 62.547.254 | |
| 5 mL plastic pipette | Cellstar | 606 180 | |
| 6 mm Biopsy punches | Kai Medical | BP-60F | |
| Aluminium foil | - | - | |
| Cover Slip | Menzel-Glaser | - | |
| HYPERflask | Corning | CLS10030 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | J1840AMNT | |
| Opaque black 96-well plate | Costar | 3915 | |
| Sterile P10 tips | Starlab | S1121-3810 | |
| Sterile P1000 tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Sterile P20 tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Sterile P200 tips | Starlab | S1120-8810 | |
| T-175 (175 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3912 | |
| T-75 (75 cm2 flask) | Sarstedt | 83.3911.302 | |
| Translucent clear 96 well plate | Cellstar | 655180 | |
| Translucent non-adherent 24 well plates | Cellstar | 83.3922.500 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Astell | - | |
| Automatic tissue processor | Leica | TP1020 | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | - | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | - | |
| Incubator | ThermoScientific | - | |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| Oven | Memmert | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| P10 pipette | Gilson | ||
| P100 pipette | Gilson | ||
| P1000 pipette | Gilson | ||
| P20 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| P200 pipette | Gilson | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd | |
| Paraffin section flotation bath | Electrothermal | MH8517 | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Pipette electronic dispenser | Corning | StripipetterUltra | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Plate cooler | Leica | EG1140C | Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd |
| Refrigerator -20 °C | Liebherr | - | |
| Refrigerator -80 °C | Liebherr | - | |
| Refrigerator 4 °C | Liebherr | - | |
| Seesaw Rocker | DLAb | SK-D1807-E | |
| Spectrophotometer – Victor3V Platereader | PerkinElmer | 1420 | |
| Tissue culture hood/Laminar flow hood | GMI | 8038-30-1044 | |
| Tissue Lyser | Qiagen | TissueLyser LT | |
| Tweezers | - | - | |
| Water bath | Grant | - | |
| Wax embedder | Leica | EG1140H | |
| Materials | |||
| 1 L Water | Adrona - Biosciences | 568 | |
| 1% Triton-X | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS tablets | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| 37% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Alamar Blue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1100 | |
| Collagen- glycosaminoglycan scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
| Collagen-nanohydroxyapatite scaffold | Tissue engineering research group (TERG) | ||
| dH20 | Adrona - Biosciences | 568 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 1.00983.2500 | Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005) |
| F12 | Gibco | 21765-029 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Hemaytoxylin | Sigma-Aldrich | HHS32-1L | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| MEM | Gibco | 21090-022 | |
| miRNA easy Kit | Qiagen | 217004 | |
| MNEAA’s | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 015140-122 | |
| Qiazol | Qiagen | 79306 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| RPMI | Gibco | 21875-034 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | |
| Tissue embedding Medium | Sigma | A6330-4LB | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Software | |||
| Excel | - | Excel 2016 | |
| ImageJ | - | - | |
| Prism | - | Version 9 |
References
- Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
- Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).
- Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
- Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
- Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).
- Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38 (2006).
- Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).
- Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
- Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
- Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
- Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
- Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
- Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
- Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
- Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
- Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
- Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
- Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).
- Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
- Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).
- Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
- do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).
- Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
- O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).
Tags
3차원 체외 생체모방 모델 신경모세포종 콜라겐 기반 스캐폴드 소아암 종양 조직 세포외 기질(ECM) 질병 진행 환자 예후 치료 반응 신경모세포종 세포주 나노하이드록시아파타이트(nHA) 글리코사미노글리칸(GAG) 골수 전이 부위 다공성 구조 세포 부착 증식 이동 세포 클러스터 치료학 생체 내 상황 스캐폴드 기반 배양 시스템 2차원(2D) 세포 배양 DNA 정량화 세포 생존력Erratum
Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally
to:
Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally
