Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tredimensjonal in vitro biomimetisk modell av neuroblastom ved bruk av kollagenbaserte stillas

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62627
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 4, 3,5,6, 1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 7Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen's Green, Dublin 2, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland, 7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette papiret viser trinnene som kreves for å frø neuroblastomcellelinjer på tidligere beskrevne tredimensjonale kollagenbaserte stillas, opprettholde cellevekst for en forhåndsbestemt tidsramme og hente stillas for flere cellevekst- og celleadferdsanalyser og nedstrømsapplikasjoner, tilpasningsdyktige for å tilfredsstille en rekke eksperimentelle mål.

Abstract

Neuroblastom er den vanligste ekstrakranielle solide svulsten hos barn, og står for 15% av de totale dødsfallene i barnekreft. Det opprinnelige tumorvevet er et komplekst tredimensjonalt (3D) mikromiljø som involverer lag av kreft- og ikke-kreftceller omgitt av en ekstracellulær matrise (ECM). ECM gir fysisk og biologisk støtte og bidrar til sykdomsprogresjon, pasientprognose og terapeutisk respons.

Dette papiret beskriver en protokoll for montering av et 3D-stillasbasert system for å etterligne neuroblastommikromiljøet ved hjelp av neuroblastomcellelinjer og kollagenbaserte stillas. Stillasene er supplert med enten nanohydroksyapatitt (nHA) eller glykosaminoglykaner (GAGs), naturlig funnet i høye konsentrasjoner i bein og benmarg, de vanligste metastatiske stedene for neuroblastom. Den 3D porøse strukturen til disse stillasene tillater neuroblastomcellefeste, spredning og migrasjon, og dannelsen av celleklynger. I denne 3D-matrisen reflekterer celleresponsen på terapeutika mer in vivo-situasjonen .

Det stillasbaserte kultursystemet kan opprettholde høyere celletetthet enn konvensjonell todimensjonal (2D) cellekultur. Derfor er optimaliseringsprotokoller for innledende såcellenumre avhengig av de ønskede eksperimentelle tidsrammene. Modellen overvåkes ved å vurdere cellevekst via DNA-kvantifisering, cellenes levedyktighet via metabolske analyser og cellefordeling i stillasene via histologisk farging.

Denne modellens applikasjoner inkluderer vurdering av gen- og proteinuttrykksprofiler samt cytotoksisitetstesting ved bruk av konvensjonelle legemidler og miRNA. 3D-kultursystemet muliggjør presis manipulering av celle- og ECM-komponenter, og skaper et miljø som er mer fysiologisk lik naturlig tumorvev. Derfor vil denne 3D in vitro-modellen fremme forståelsen av sykdomspatogenesen og forbedre korrelasjonen mellom resultater oppnådd in vitro, in vivo i dyremodeller og mennesker.

Introduction

Neuroblastom er en pediatrisk kreft i det sympatiske nervesystemet som oppstår under embryonisk utvikling eller tidlig postnatalt liv på grunn av transformasjon av nevrale kamceller1. Det er den vanligste solide ekstrakranielle svulsten hos barn, som representerer 8% av malignitetene diagnostisert hos pasienter under 15 år, og er ansvarlig for 15% av alle dødsfall i barndomskreft. Sykdommen viser svært heterogen klinisk atferd på grunn av spesifikke kromosomale, genetiske og epigenetiske endringer og histopatologiske egenskaper.

Disse endringene bidrar til aggressiviteten til neuroblastom og dårlige resultater hos pediatriske pasienter. Derfor viser dagens behandlinger seg å være ineffektive på lang sikt for nesten 80% av pasientene med den klinisk aggressive sykdommen2, noe som understreker det faktum at behandling for denne gruppen pasienter fortsatt er utfordrende. Dette skyldes sannsynligvis at mekanismene for neuroblastom, heterogenitet og metastaser fortsatt ikke er fullt ut forstått. Imidlertid er tumormikromiljøet (TME) nå allment antatt å spille en rolle i utviklingen av mange kreftformer; Likevel er det fortsatt understudert i neuroblastom 3,4.

Den opprinnelige TME er et komplekst 3D-mikromiljø som involverer kreft- og ikke-kreftceller omgitt av en ECM. ECM refererer til den acellulære komponenten i et vev som gir strukturell og biokjemisk støtte til sine cellulære beboere og bidrar til sykdomsprogresjon, pasientprognose og terapeutisk respons5. Denne fremmelsen av sykdomsprogresjon skyldes "dynamisk gjensidighet" eller pågående toveis kommunikasjon mellom celler og ECM 6,7,8. Etter hvert som kreft utvikler seg, blir stromalkollagen omorganisert ofte i lineære mønstre vinkelrett på stroma-kreftgrensesnittet, som kreftceller bruker som en migrerende rute til metastase 9,10,11.

Hovedkomponentene i dette opprinnelige funksjonelle biologiske stillaset inkluderer et fibrøst nettverk av kollagen type I og II og andre proteiner, inkludert elastin, glykoproteiner som laminin, samt en rekke proteoglykaner og andre løselige komponenter12,13. Disse proteinene fra den opprinnelige ECM har nå blitt attraktive naturlige biomolekyler for å utvikle 3D in vitro-modeller 3. Anvendelsen av 3D-stillas for in vitro cellekultur øker i popularitet på grunn av sin større fysiologiske representasjon av TME sammenlignet med tradisjonell 2D monolagskultur. De produserte 3D-stillasene hjelper cellefeste, spredning, migrasjon, metabolisme og respons på stimuli sett i in vivo biologiske systemer.

Hovedkomponenten i disse 3D-stillasene er kollagen, som er en nøkkelspiller i mange normale biologiske prosesser, inkludert vevsreparasjon, angiogenese, vevsmorfogenese, celleadhesjon og migrasjon11. Kollagenbaserte 3D-matriser har vist sin robuste funksjonalitet for å modellere ECM, og fungerer som et in vitro biomimetisk mikromiljø samtidig som det muliggjør celle-ECM-interaksjoner samt cellemigrasjon og invasjon. Disse 3D-matrisene gir også en mer nøyaktig analyse av cellerespons på kjemoterapeutiske legemidler enn tradisjonell 2D eller "flat" kultur i mange kreftmodeller 14,15,16, inkludert neuroblastom 17,18. Genetisk analyse av 3D-cellekulturer har rapportert en høyere korrelasjon med den menneskelige vevsprofilen selv sammenlignet med dyremodeller19. Samlet sett er hjørnesteinen i disse 3D-stillasene å gi cellene et egnet in vitro-miljø, som rekapitulerer den opprinnelige vevsarkitekturen og muliggjør toveis molekylær crosstalk8.

For å øke kompleksiteten til kollagenbaserte modeller, er andre vanlige ECM-komponenter innlemmet i vevsteknikkprosessen, og skaper dermed mer fysiologisk relevante modeller for å gjenspeile nisje-TME i forskjellige vev. For eksempel letter GAGs, negativt ladede polysakkarider som finnes i alle pattedyrvev20, cellevedlegg, migrasjon, spredning og differensiering. Chondroitinsulfat er en spesifikk type GAG som finnes i bein og brusk, som tidligere har blitt brukt i vevstekniske applikasjoner for beinreparasjon 21,22,23,24,25. Nanohydroksyapatitt (nHA) er den viktigste uorganiske bestanddelen av mineralsammensetningen av humant beinvev, som utgjør opptil 65 vekt% bein26 og brukes derfor mye til beinutskifting og regenerering27. Dermed er GAGs og nHA attraktive kompositter for å rekonstruere det primære neuroblastomet ECM og modellere de vanligste metastatiske stedene for neuroblastom, benmarg (70,5%) og bein (55,7%)28.

Stillas som inneholder disse ECM-komponentene ble opprinnelig utviklet for beinvevstekniske applikasjoner med omfattende analyse av deres biokompatibilitet, toksisitet og osteoledende og osteoinduktive egenskaper29,30. De er porøse, kollagenbaserte matriser produsert ved hjelp av frysetørkingsteknikker for å kontrollere deres fysiske og biologiske egenskaper. Kollagenstillasene supplert med enten nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) viste suksess i å etterligne den primære TME i brystkreft31 og metastase til bein i prostatakreft15 samt neuroblastom17. Frysetørkingsteknikken som brukes til å produsere disse sammensatte stillasene gir reproduserbar homogenitet i porestørrelse og porøsitet i stillasene22,23,24. Kort fortalt fremstilles en kollagenoppslemming (0,5 vekt%) ved å blande fibrillært kollagen med 0,05 M eddiksyre. For Coll-I-GAG tilsettes 0,05 vekt% av krondoitin-6-sulfat isolert fra haibrusk til kollagenoppslemmingen mens den blandes. For de sammensatte Coll-I-nHA-stillasene syntetiseres hydroksyapatitt partikler i nanostørrelse som tidligere beskrevet27 og tilsettes kollagenoppslemmingen i forholdet 2: 1 til vekten av kollagenet under blandingsprosessen. Alle stillas er fysisk tverrbundet og sterilisert ved hjelp av en dehydrotermisk behandling ved 105 °C i 24 timerog 25. Sylindriske stillaser (6 mm diameter, 4 mm høyde) oppnås ved hjelp av en biopsistans og kan kjemisk kryssbindes med 3 mM N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydroklorid og 5,5 mM N-hydroksysuccinimid (EDAC / NHS) i destillert vann (dH2O) for å forbedre de mekaniske egenskapene til konstruksjonene30. Denne veloptimaliserte produksjonsprosessen av to kollagenstillas skaper stillas med reproduserbare mekaniske egenskaper, inkludert porestørrelse, porøsitet og stivhet (kPa). Både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stillas har varierende fysiske egenskaper, noe som skaper forskjellige miljøforhold. Egenskapene til hvert stillas er vist i tabell 1.

Coll-I-GAG Coll-I-nHA
Stillas størrelse
(diameter [mm] x høyde [mm])		 6 x 4 17 6 x 4 17
Kollagenkonsentrasjon (vekt%) 0,5 17 0,5 17
Substratkonsentrasjon (vekt%)
[Basert på vekten av kollagen]		 0,05 15,17 200 17
Gjennomsnittlig porestørrelse (mm) 96 22 96 – 120 29
Porøsitet (%) 99,5 23 98,9 til 99,4 27
Stivhet (kPa) 1.5 27 5,5 til 8,63 29

Tabell 1: Oversikt over de mekaniske egenskapene til de to stillasene som er tatt i bruk for å studere nevroblastombiologi.

Dette papiret beskriver en protokoll for montering av et 3D-stillasbasert system for bedre å etterligne neuroblastommikromiljøet ved hjelp av neuroblastomcellelinjer og tidligere beskrevne kollagenbaserte stillaser supplert med enten nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollen inkluderer nedstrømsmetoder for å analysere vekstmekanismene til neuroblastomcellene i et mer fysiologisk relevant miljø ved hjelp av tidligere optimaliserte billige metoder tilpasset 2D monolagskultur Figur 1.

Figure 1
Figur 1: Samlet protokollarbeidsflyt. (A) Celler dyrkes til tilstrekkelig antall, splittes, telles og resuspenderes i et passende volum av medium. (B) Denne cellemassen gjennomgår deretter seriefortynning for å fremstille totalt 4 cellesuspensjoner med forskjellige tettheter. (C) Kollagenbaserte stillaser er sterilt belagt i ikke-klebende 24-brønnsplater, og (D) 20 μL cellesuspensjon tilsettes midten av hvert stillas og får inkubere ved 37 °C, 5% CO2 og 95% fuktighet i 3-5 timer. (E) Komplett vekstmedium (1 ml) tilsettes deretter sakte til hvert stillas, og platene plasseres tilbake i inkubatoren for å tillate cellevekst i ønsket tidsramme. (F) Ved hvert forhåndsbestemt tidspunkt hentes flere stillas for celle levedyktighet og vekstvurdering, genuttrykksanalyse og histologisk farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Eksperimentell design

MERK: Antall stillaser og celler som trengs for hvert eksperiment, vil være avhengig av omfanget av eksperimentet og kan beregnes ved hjelp av verktøyene i denne delen om eksperimentell design.

  1. Antall stillaser som kreves
    1. Bestem den overordnede eksperimentelle tidslinjen og vurderingsintervallene for endringer i cellebiologi (f.eks. Cellevekst og metabolisme).
      MERK: For eksempel er den eksperimentelle tidsrammen 14 dager, med en vurdering av cellevekst hver 7. dag. Dermed er de eksperimentelle tidspunktene dagene 1, 7, 14 som gir totalt 3 tidspunkter.
    2. Deretter bestemmer du antall eksperimentelle applikasjoner som skal brukes på hvert tidspunkt. Prøv å fullføre de samme analysene til enhver tid for å overvåke endringene.
      MERK: Typiske analyser av cellevekst på stillaser inkluderer cellelevedyktighetsanalyser, DNA-kvantifisering, histologisk farging og avbildning og genuttrykksanalyse. Disse vil bli nærmere omtalt i kapittel 5.
    3. Bestem når du skal bruke det samme stillaset for flere nedstrøms applikasjoner, for eksempel etter celle levedyktighetsvurdering ved hjelp av en passende analyse, bruk stillaset for DNA / RNA-isolasjon (diskutert i 5.1.11).
    4. Hold minst 3 biologiske replikater for hver applikasjon, for eksempel 3 stillaser for celle levedyktighet og DNA-kvantifisering, 3 for histologi og 3 for genuttrykksanalyse. Da dette tilsvarer 9 stillaser per tidspunkt, planlegg å bruke 27 stillaser for 3 tidspunkter.
    5. Til slutt, multipliser dette tallet med antall eksperimentelle parametere eller forhold (f.eks. Vurdering av flere cellelinjer, innledende såtettheter, stillassammensetninger).
      MERK: I denne protokollen ble 4 forskjellige innledende såtettheter vurdert for en cellelinje, noe som resulterte i 108 (27 stillas x 4 forhold) stillas som kreves. For å ta hensyn til menneskelige feil og gi ekstra dekning, legg ~ 10% til dette tallet, for eksempel hvis 108 stillaser kreves, klargjør 120 stillas.
  2. Antall celler som kreves
    MERK: Et 20 μL volum cellesuspensjon anbefales for såing av celler på et sylindrisk stillas (diameter 6 mm, høyde 4 mm) på dag 0. Antall celler per denne 20 μL cellesuspensjonen justeres i henhold til eksperimentell design, beregnet i pkt. 1.1. En vanlig innledende såtetthet er 2 × 105 celler per 20 μL, brukt som et eksempel for protokollen nedenfor.
    1. For å beregne den totale mengden celler som kreves for eksperimentet, multipliser de første 2 × 105 cellene per 20 μL med antall stillas som kreves.
      MERK: For eksempel gir 30 stillas multiplisert med 20 μL et totalt volum på 600 μL. Hvis hvert stillas krever 2 × 10 5 celler, inneholder 600 μL suspensjon totalt 6 × 10 6 celler (2 × 105 × 30), noe som gir et endelig krav på 6 × 106 celler i 600 μL. Antallet eksperimentelle parametere vil diktere det totale antall celler som kreves. Denne protokollen skisserer derfor cellekultur ved hjelp av en flerlags cellekulturkolbe, som kan håndtere samme antall celler som 10 tradisjonelle 175 cm2 kolber.

2. Klargjøring av kollagenbaserte stillaser

MERK: Coll-I-nHA og Coll-I-GAG sylindriske stillaser (diameter 6 mm, høyde 4 mm) fremstilles ved hjelp av etablerte metoder 15,21,27. Når de er kjemisk kryssbundet i henhold til tidligere publiserte metoder17, må stillasene brukes innen 1 uke.

  1. Etter produksjon av stillasene med de ønskede mekaniske egenskapene, sørg for at stillasene er fullt hydrert og grundig vasket i fosfatbufret saltvann (PBS).
    MERK: Dette tar vanligvis ~ 12 timer etter tverrbinding av stillasene og kan utføres i 100 ml vevskulturavfallsbeholdere ved 4 ° C, med maksimalt 50 stillas per beholder og 2 ml PBS per stillas.
  2. Oppbevar stillasene i PBS ved 4 °C til de er klare til bruk.

3. Forplante neuroblastomceller i en flerlags cellekulturkolbe

NOTAT: Den optimale såtettheten for flerlagskolben vil variere. For kolben som brukes i dette forsøket, er den optimale tettheten i henhold til produsentens instruksjoner 1 × 107 celler. Før såing av flerlagskolben, forplantes celler til en tetthet på 1 × 107 celler eller høyere i en passende vevskulturkolbe (f.eks. en T175 cm2 vevskulturkolbe). For å frø celler inn i flerlagskolben (seksjon 3.1), dyrk dem til 70-80% sammenflytende, høst og tell antall celler per ml, med henvisning til trinn 3.2.16-3.2.20 for å utføre celletellingen. Når cellesuspensjonen er talt, fortsett umiddelbart til såing av flerlagskolben. Cellekulturarbeid må utføres i en laminær strømningshette for å opprettholde steriliteten.

  1. Såing av flerlags cellekulturkolbe
    1. Forvarm 550 ml komplett vekstmedium (varierer avhengig av cellelinjen som brukes) og 100 ml steril PBS i et vannbad på 37 °C i 20 minutter.
    2. Ved å bruke den høstede cellesuspensjonen, beregne det nødvendige volumet av cellesuspensjonen som trengs for å oppnå optimal såtetthet på 1 × 107 celler ved hjelp av ligning (1), der WANT refererer til antall celler som kreves for såing av flerlagskolben, og HAVE refererer til antall celler / ml i cellesuspensjonen:
      Equation 1(1)
      f.eks. Equation 2
    3. Tilsett det nødvendige volumet av cellesuspensjonen til 100 ml av det forvarmede vekstmediet.
    4. Ta en ny flerlagskolbe i hetten, fjern hetten og hold kolben i en vinkel på 60°. Pipetter sakte alle 100 ml av cellesuspensjonen inn i kolben, nedover den vinklede siden av nakken. Sett lokk på kolben og legg den på siden slik at cellene kan fordele seg jevnt over lagene.
    5. Ved en 60° vinkel tilsettes 400 ml av det forvarmede vekstmediet til flerlagskolben ved sakte å helle eller pipettere nedover den vinklede siden av halsen. Hvis nakken blir full, sett kolben tilbake i oppreist stilling, eller sett på kolben og legg den på siden før du heller igjen.
      NOTAT: Hell sakte for å unngå overdreven bobledannelse. Bank forsiktig på kolben loddrett for å la alle boblene stige til toppen, og fjern dem med en 10 ml pipette. Forsikre deg om at kolben er fylt til den nederste tråden i nakken; Legg til mer medium, om nødvendig, for å oppnå dette.
    6. Sett lokk på flerlagskolben og rug den med den vinklede halsen vendt ned ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet.
    7. Kontroller veksten hver 2-3 dager for sammenløp. For å sjekke sammenløpet mellom de to nederste lagene i flerlagskolben, se dem under en 4x objektivlinse i et omvendt mikroskop.
      MERK: Når den frøes med 1 × 107 neuroblastomceller, vil 10-lagskolben vanligvis ta en uke å bli konfluent, selv om dette kan variere avhengig av cellelinjen som brukes.
  2. Rutinemessig vedlikehold av celler i flerlagskolben
    1. Forvarm 550 ml komplett vekstmedium (varierer avhengig av cellelinjen i bruk), 50-100 ml trypsin og 300 ml steril PBS i et 37 °C vannbad i 20 minutter.
    2. Kontroller flerlagskolben for 70-80% sammenløp.
    3. Plasser flerlagskolben i en avtrekkshette med laminær luftstrøm og kast det brukte mediet fra kolben ved å helle. Vipp først kolben slik at mediet helles over luftdammen i en avfallsbeholder. Mens du heller, roter kolben med 180° til mediet strømmer nedover den vinklede kolbens hals. Roter kolben frem og tilbake langs denne aksen for å eliminere eventuell gjenværende væske.
    4. Vask cellene ved å tilsette 100 ml forvarmet steril PBS sakte nedover den vinklede halsen. Sett lokk på kolben, plasser den på siden for å tillate jevn fordeling av PBS, og roter kolben frem og tilbake for å vaske cellene.
    5. Kast PBS-vasken på samme måte som 3.2.3. Gjenta vasketrinnene.
    6. Fortynn 50 ml av det forvarmede trypsinet i 50 ml forvarmet steril PBS. Tilsett 100 ml fortynnet trypsinoppløsning til flerlagskolben, hetten og legg kolben på siden for å tillate jevn fordeling av trypsinet. Hvis cellelinjen er svært adherent, bruk 100 ml ufortynnet trypsin.
    7. Inkuber kolben i 2-5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet, overvåking av celleløsning under mikroskopet. Om nødvendig, trykk kolben godt for å hjelpe løsningen eller legg den tilbake i inkubatoren i ett minutt.
    8. Plasser flerlagskolben i en laminær strømningshette og nøytraliser trypsinen med 100 ml vekstmedium. Kapp kolben, plasser den på siden, og gyng frem og tilbake for å sikre fullstendig nøytralisering.
    9. Hell av den nøytraliserte cellesuspensjonen i 4 x 50 ml koniske sentrifugerør.
      MERK: Hvis fullstendig cellehøsting er nødvendig, vask flerlagskolben igjen med 100 ml steril PBS og hell den av i 2 x 50 ml sentrifugerør.
    10. Sentrifuger cellesuspensjonen i 50 ml sentrifugerør ved 340 × g i 3-4 minutter for å pelletere cellene.
    11. Sett sentrifugerørene tilbake i avtrekkshetten for laminær luftstrøm og kast forsiktig så mye supernatant som mulig fra hver pellet.
      MERK: Pelleten vil være stor og relativt løs og kan derfor lett forstyrres.
    12. Tilsett 1-5 ml vekstmedium til hver pellet og resuspender den ved å pipette opp og ned flere ganger.
    13. Slå sammen de 4 resuspenderte pelletsene i ett 50 ml sentrifugerør, bland dem grundig med pipetten og noter totalvolumet.
    14. Gjør en passende fortynning av cellesuspensjonen for celletelling slik at hver ytre firkant på hemocytometeret inneholder 30-100 celler.
      MERK: En passende startfortynning er 1:100; for dette, pipett 10 μL av cellesuspensjonen i et friskt 15 ml konisk sentrifugerør og fortynn det med 990 μL steril PBS. Pipetter blandingen opp og ned flere ganger for å blande godt.
    15. Plasser et 50 ml sentrifugerør som inneholder cellemassen i inkubatoren mens du teller.
    16. Ta et rent hemocytometer, plasser et rent deksel over rutenettet, som vist i figur 2.
    17. Pipette 10 μL av den fortynnede cellesuspensjonen i hemocytometerkammeret. Hvis kammeret blir fullt før alle 10 μL er dispensert, må du stoppe pipetteringen.
    18. Plasser hemocytometeret under 4x målet med et lysmikroskop. Juster grovt og fint fokus for å visualisere cellene.
    19. Tell antall celler i de fire ytre hjørnekvadratene i kammeret som uthevet i figur 2. Legg til de fire tellerne og del med 4 for å beregne gjennomsnittscellene per kvadrat.

Figure 2
Figur 2 Celletelling med hemocytometer. Ti mikroliter cellesuspensjon legges til hemocytometeret under dekselet. Kammeret plasseres deretter under 4x objektivlinsen til et mikroskop, og antall celler i de fire ytre hjørnene av rutenettet telles. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Multipliser gjennomsnittstallet med fortynningsfaktoren (f.eks. 100) og multipliser dette tallet med 10 000 for å oppnå antall celler per ml ved hjelp av ligning (2).
    Equation 3 (2)
  2. Beregn det totale antall celler i stamløsningen ved å multiplisere med det totale volumet av cellemassen (f.eks. hvis de 4 resuspenderte pellets samlet laget en 20 ml løsning, multipliser celler/ml med 20).
  3. For å opprettholde flerlagskolben, bruk ligning (1) skissert i trinn 3.1.2 for å beregne volumet av cellelager som trengs for å frø 1 × 107 celler tilbake i kolben og utfør trinn 3.1.3-3.1.6 for å så kolben på nytt. Hvis du er klar til å frø stillasene, fortsett til neste avsnitt.

4. Frøneuroblastomceller på stillaser

  1. Forbered stamcelle suspensjon
    MERK: Denne protokollen vil skissere trinnene for å lage fire forskjellige såtettheter av neuroblastomceller, med en multiplikasjonsfaktor på 2 mellom hver tetthet. En seriefortynning vil derfor bli brukt til å lage ytterligere tre cellesuspensjoner fra stamløsningen. Cellekulturarbeid må utføres i en laminær strømningshette for å opprettholde steriliteten.
    1. Bruk ligning (3) for å beregne volumet av celler som trengs fra det totale antall celler i flerlagskolben (regnet i seksjon 3.2.19) for å forberede den første såtettheten eller suspensjonen av cellelager.
      Equation 4(3)
      MERK: For eksempel, hvis den høyeste såtettheten er 6 × 10 5 celler per stillas som kreves for 30 stillas, hvor hvert stillas mottar 20 μL celleoppheng, vil stamcellesuspensjonen kreve 1,8 × 107 celler (6 × 105 celler × 30 stillas) i et totalt volum på 600 μL (20 μL × 30 stillas).
      Da en seriefortynning vil bli utført fra dette preparatet, må disse tallene dobles, dvs. 3,6 × 107 celler i et totalvolum på 1200 μL. For å konvertere dette til VIL i celler per ml; Del 3,6 × 10 7 med 1200 μL og multipliser med 1000 μL, noe som gir 3 × 107 celler per ml.
      ​Equation 5
    2. Tilsett det nødvendige volumet av cellelager til et sterilt sentrifugerør på 2 ml eller 15 ml og bring til et endelig volum på 1200 μL med vekstmedium. Merk denne tuben som tetthet 1 (figur 3).
  2. Utfør seriell fortynning for å lage flere cellesuspensjoner med såtetthet.
    1. Fra tetthet 1 utarbeidet i trinn 4.1.1, klargjør du ytterligere tre tettheter av cellesuspensjon gjennom seriell fortynning i henhold til figur 3.
    2. Fortynn hver tetthet med en faktor på 2 i vekstmediet. Først legger du til det nødvendige endelige volumet (600 μL fra forrige eksempel) vekstmedium til tre sterile 2 ml eller 15 ml sentrifugerør.
    3. Overfør halvparten av tetthet 1 (600 μL) til et av rørene, bland cellesuspensjonen grundig med mediet for å fortynne. Merk dette røret som tetthet 2.
    4. Overfør halvparten av tetthet 2 (600 μL) til neste rør, bland cellesuspensjonen grundig med mediet for å fortynne. Merk dette røret som tetthet 3.
    5. Overfør halvparten av tetthet 3 (600 μL) til neste rør, bland cellesuspensjonen grundig med mediet for å fortynne. Merk dette røret som tetthet 4.
    6. Kast 600 μL fra tetthet 4 slik at alle fire preparatene har et endelig volum på 600 μL.
    7. Som en negativ kontroll, tilsett 600 μL vekstmedium bare til et sterilt 2 ml sentrifugerør. Se figur 3 for et skjema over den serielle fortynningsprosessen.

Figure 3
Figur 3: Seriell fortynning av cellelager for å forberede 4 suspensjoner for 4 forskjellige stillassåtettheter. (A) Tallene kan justeres etter ønsket såtetthet per stillas og (B) multipliseres for totalt antall stillaser per tetthet, der hvert stillas får 20 μL celleoppheng. I dette eksempelet krever tetthet 1 6 × 105 celler per stillas, tilsvarende 1,8 × 107 celler i 600 μL for 30 stillas. Dette tallet dobles for å starte seriefortynningen, da 600 μL deretter overføres og fortynnes i 600 mikrol vekstmedium i neste rør. Denne prosessen fortsetter til det er 4 cellesuspensjoner med en faktor på 2 mellom hver. En negativ kontroll gjøres ved å tilsette 600 μL medium bare til et rør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Legge celleoppheng til stillasene
    MERK: Fjern stillasene (lagret i PBS) fra kjøleskapet og la dem komme til romtemperatur (RT) før du legger til cellene.
    1. Ta stillasene i PBS inn i den laminære strømningshetten.
    2. Bruk steril pinsett til å plassere stillasene i 24-brønnsplater uten vedheft med ett stillas per brønn (figur 1C). Løft stillasene forsiktig i hjørnene og trykk dem lett mot siden av beholderen for å fjerne overflødig PBS. Legg stillasene inn i midten av brønnens hudside ned (den skinnende lagsiden av stillaset, vendt ned i plastplatene med 24 brønner).
    3. Merk 24-brønnplatene med detaljer om cellelinjen, relevante parametere (f.eks. såtetthet) og tidspunkter. Arbeid med en cellesåtetthet om gangen, og hold de gjenværende tetthetene i 37 °C-inkubatoren til de er klare til bruk.
    4. I avtrekksviften for laminær luftstrøm, bruk en P20-pipette og sterile spisser for forsiktig å tilsette 20 μL av den relevante celleopphenget til midten av hvert stillas (figur 1D). Hold cellene grundig i suspensjon ved å blande godt mens du legger cellene til stillasene. Forsikre deg om at suspensjonen forblir på toppen av stillaset og ikke glir av på bunnen av brønnen, da dette ikke tillater cellefeste til stillaset.
    5. Når cellene er tilsatt, inkuber platene i 3-5 timer (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet) for å la de fleste cellene feste seg.
    6. Etter inkubering, tilsett sakte og forsiktig 1 ml forvarmet vekstmedium til hver brønn (figur 1E). Bruk en P1000-pipette for å legge til mediet for å tillate mer langsom og kontrollert bevegelse, og forhindre forskyvning av stillasene. Hvis du arbeider med et svært høyt antall stillas, bruk en 10 ml pipette med pipettepistolen satt til "fall" og "lav".
    7. Inkuber 24-brønnplatene over natten (37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet).
  2. Vedlikehold av celler på stillasene
    1. Etter de første 24 timene med cellefeste (dag 1), overfør de frøede stillasene til nye ikke-adherente 24-brønnsplater, og tilsett 1-2 ml friskt vekstmedium.
      MERK: Dette trinnet fjerner celler som har falt til bunnen av plast 24-brønnplater i stedet for å la dem vokse på stillasene. Stillasreplikasjoner betegnet som dag 1 vil bli tatt ned etter 24 timer, som omtalt i avsnitt 5; Vedlikehold gjelder derfor ikke for disse stillasene.
    2. Overvåk stillasene i utgangspunktet hver 2-3 dag for en endring i fargen på vekstmediet. Etter hvert som tiden går og celler sprer seg i stillasene, mate cellene oftere.
    3. Bruk en 10 ml pipettepistol, i langsom modus, fjern 1 ml av det brukte mediet og kast. Hvis du utfører eksperimenter som krever betinget medium, samle det brukte mediet av biologiske replikater i et 15 ml sentrifugerør, sentrifuge ved 340 × g i 2 minutter for å pelletere det cellulære rusk, overfør supernatanten til et nytt rør og oppbevar ved -80 ° C.
    4. Tilsett forsiktig 2 ml forvarmet vekstmedium til stillasene, bruk dryppfunksjonen igjen på pipetten, og returner 24-brønnplaten til inkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet). Gjenta når mediet er brukt i løpet av ønsket vekstperiode.

5. Henting av stillas og applikasjoner

MERK: På hvert tidspunkt kan flere applikasjoner brukes til å overvåke cellevekst på stillasene eller vurdere gen- og proteinuttrykksprofiler. Betingelsene for stillasuthenting vil avhenge av analysen som skal utføres, med flere gjenfinningsmetoder skissert i de følgende underavsnittene og demonstrert i figur 4.

  1. Vurdering av cellenes levedyktighet i stillas
    1. Steriliser riktig cellelevedyktighetsanalysereagens ved å filtrere gjennom et 0,2 μm sterilt filter i et sentrifugerør i den laminære strømningshetten. Forvarm denne sterile oppløsningen sammen med komplett vekstmedium og steril PBS i et vannbad på 37 °C.
    2. I den laminære strømningshetten, bruk steril pinsett for å overføre stillasene som skal analyseres til en ny 24-brønnsplate. Merk platen med alle relevante detaljer.
      MERK: Utfør analysen i tre eksemplarer.
    3. Tilsett 900 μL av det forvarmede vekstmediet til hver brønn, etterfulgt av 100 μL av det sterile celle levedyktighetsreagenset. Inkluder en negativ kontroll ved å tilsette 900 μL medium og 100 μL av den sterile celle levedyktighetsreagenset til en brønn uten stillas. Sett på lokket på platen, og gyng forsiktig platen i ~ 3 min for jevnt å fordele det fortynnede cellelevedyktighetsreagenset gjennom brønnen. Inkuber platen ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet.
      MERK: Inkubasjonstider må optimaliseres for hver cellelinje; Se produsentens retningslinjer. For neuroblastomcellelinjer virker 4-6 timers inkubasjon optimal.
    4. Etter inkubering, fjern platen fra inkubatoren og forsiktig rocke den i noen sekunder.
    5. Åpne en ny, gjennomsiktig plate med 96 brønner i den laminære strømningshetten. Fra hver brønn i 24-brønnsplaten overfører du det inkuberte mediet og reagenset til tre brønner på 96-brønnplaten med 100 μL per brønn, noe som gir tekniske triplikater.
      MERK: Denne overføringen vil etterlate 700 μL i brønnene på 24-brønnplaten.
    6. Dekk 96-brønnsplaten i aluminiumsfolie for å beskytte cellens levedyktighetsreagens mot lys.
    7. Fjern og kast de resterende 700 μL av brønninnholdet fra hvert stillas i 24-brønnplaten. Vask hvert stillas to ganger med 1 ml steril PBS.
      MERK: All farge vil ikke bli fjernet fra stillasene. Disse stillasene kan deretter brukes til videre anvendelser, f.eks. DNA-kvantifisering, ved å plassere dem i 1 ml 1 % Triton X-100 i 0,1 M natriumbikarbonat (NaHCO3)-løsning og lagre dem ved -80 °C (se pkt. 5.2, figur 4B).
    8. Fjern 96-brønnsplaten fra den laminære strømningshetten og mål absorbansen til hver brønn ved bølgelengder på 570 nm og 600 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Registrer absorbansverdiene ved begge bølgelengder og følg produsentens instruksjoner for å beregne prosentvis reduksjon av cellens levedyktighetsreagens av cellene.
    9. Graf og statistisk analysere cellens levedyktighetsresultater ved hjelp av passende programvare. Skriv inn biologiske triplikate verdier for å produsere feilfelt og angi analysevariabiliteten.
    10. For å undersøke endringer i cellenes levedyktighet over den eksperimentelle tidsrammen, utfør en enveis variansanalyse (ANOVA) test med flere sammenligninger av midlene ved bruk av passende biostatistisk programvare.
    11. Angi signifikante forskjeller mellom tidspunktene på grafer som ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) og **** (P≤0.0001).

Figure 4
Figur 4: Gjenfinning av stillas for ulike analyser på hvert tidspunkt. (A) Tre stillasreplikater hentes for celle levedyktighetsanalyse. (B) Disse stillasene kan deretter vaskes i PBS, plasseres i 1% Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3, og lagres ved -80 °C for DNA-kvantifisering. (C) Ytterligere tre replikater festes i 10 % PFA i 15 minutter, nøytraliseres i PBS og lagres ved 4 °C for histologisk farging og avbildning. (D) Til slutt tilsettes 3 replikater til et fenol / guanidinbasert cellelysereagens og lagres ved -20 ° C for genekspresjonsanalyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; PFA = paraformaldehyd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Kvantifisering av DNA fra cellene i stillasene
    MERK: Som nevnt i notatet etter trinn 5.1.7 innebærer henting av stillasene for DNA-kvantifisering å plassere stillasene i 2 ml sentrifugerør inneholdende 1 ml 1% Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3 løsning etterfulgt av lagring ved -80 °C. Før DNA-analyse kan utføres, må cellene gjennomgå tre fryse-tine sykluser for å lyse neuroblastomcellene på riktig måte og frigjøre DNA for kvantifisering.
    1. Fjern prøvene som tidligere er lagret i Triton X-100 fra -80 °C. La prøvene stå i RT i 1-3 timer eller til de er tint.
    2. Virv prøvene i 10-20 s, og sett prøvene tilbake ved -80 °C i 18-24 timer eller til de er helt frosne. Gjenta denne prosessen i totalt tre fryse-tine sykluser.
    3. For å maksimere DNA-utbyttet, bruk en vevlyser for å forstyrre cellene i stillasene.
      1. Plasser en metallperle i 2 ml sentrifugerøret som inneholder et stillas i Triton X-100, og plasser røret i adapteren for å riste prøven ved 50 svingninger/sekund i 2-3 minutter.
        MERK: Bruk rundbunns sentrifugerør da metallperlen kan sette seg fast i et konisk bunnrør.
    4. Kvantifiser DNA i Triton X-100-løsningen ved å påføre en fluorescerende dobbeltstrenget DNA (dsDNA) flekk og måle utslippet ved hjelp av en mikroplateleser. Se produsentens retningslinjer; fortynn prøvene på riktig måte i Tris-etylendiamintetraeddiksyre (TE) buffer for å forberede 8 dsDNA-standarder gjennom seriell fortynning i TE-buffer (figur 5).
    5. I svarte, ugjennomsiktige 96-brønnsplater, tilsett 100 μL av hver standard eller prøve til brønnene i teknisk triplikat.
    6. Fortynn den fluorescerende dsDNA-flekken 200 ganger i TE-buffer og tilsett 100 μL til hver standard/prøve ved hjelp av en flerkanalspipette. Dekk platen i tinfoil og rug på RT i 5 min.
    7. Mål og registrer fluorescensen til hver brønn ved 520 nm. Følg produsentens retningslinjer for å beregne konsentrasjonen av DNA i hver prøve.
      MERK: Hvis den gjennomsnittlige konsentrasjonen av DNA per celle er kjent for cellelinjen som brukes, kan DNA-konsentrasjonsverdier konverteres til celletall ved hjelp av ligning (4).
      Equation 6(4)
    8. Graf og statistisk analysere DNA-kvantifiseringsresultatene ved hjelp av passende programvare. Skriv inn biologiske triplikate verdier for å produsere feilfelt og angi analysevariabiliteten.
    9. For å undersøke endringene i DNA-konsentrasjon / celletall over den eksperimentelle tidsrammen, utfør en enveis ANOVA-test med flere sammenligninger av midlene ved hjelp av passende biostatistisk programvare.
    10. Angi signifikante forskjeller mellom tidspunkter på grafer som ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001) og **** (P≤0.0001).

Figure 5
Figur 5: Utarbeidelse av åtte DNA-standarder for generering av en standardkurve. En stamløsning av λDNA tilveiebringes ved 100 μg/ml. Dette fortynnes 50 ganger i TE-buffer for å skape standard A ved 2000 ng / ml; 400 μL A overføres deretter til rør B, inneholdende 400 μL TE buffer; 400 μL B overføres deretter og fortynnes 2 ganger i C, og så videre til G. Standard H består av bare TE-buffer og har derfor en DNA-konsentrasjon på 0 ng / ml. Forkortelse: TE = Tris-EDTA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Klargjøring av stillaser for histologisk farging
    MERK: Stillas kan festes og farges for mikroskopi og avbildningsformål enten som hele stillas for immunfluorescens (IF) eller som formalinfaste parafininnebygde (FFPE) skiver for histologisk farging eller immunhistokjemi (IHC). Dette tillater kvalitativ vurdering av cellepenetrasjon og distribusjon i stillas og kan brukes til å vurdere ekspresjonen av proteiner.
    1. Forbered en 10% paraformaldehyd (PFA) løsning i PBS. Sørg for at det er nok løsning for et sluttvolum på 500 μL per stillas.
    2. Forvarm denne oppløsningen ved 37 °C og tilsett 500 μL til merkede 2 ml sentrifugerør for stillasuthenting.
    3. Fjern stillasene fra de ikke-klebende 24-brønnsplatene (trinn 4.4.4) og plasser dem i den laminære strømningshetten.
    4. Bruk steril pinsett, overfør stillasene til de merkede sentrifugerørene som inneholder 10% PFA. La stillasene feste seg i PFA-løsningen i 15 min. Nøytraliser PFA ved å tilsette 500 μL PBS til hvert rør og lagre ved 4 °C.
    5. For å klargjøre stillasene for den automatiske vevsprosessoren, fjern dem fra 4 °C og bruk pinsett til å plassere dem i plastkassetter merket med alle relevante detaljer i blyant. Plasser alle kassettene i metallbeholderen til vevsprosessoren.
    6. Start 12-trinns protokollen på vevsprosessoren for å fikse, dehydrere, fjerne stillasene og infiltrere dem med parafin over natten. Samle kassettene som inneholder de behandlede prøvene.
    7. Deretter legger du stillasene i parafinvoksblokker for å tillate mikrotomi av stillasene i veldig tynne skiver for farging.
      MERK: Det er spesielt viktig å vurdere orienteringen til stillasene når du fjerner dem fra kassettene og legger dem inn i voks, da dette vil påvirke vinkelen som bildene blir tatt i. Dette er viktig ved vurdering av celleinfiltrasjon i stillasene.
    8. Slå på voksembedderen og kaldplaten; Løft lokket for å kontrollere nivået på voksen. Påfyll om nødvendig.
    9. Arbeid med en prøve om gangen, åpne kassetten, fjern stillaset og sentrer det i plastformen.
    10. Hell varm voks på prøven, sørg for at riktig orientering opprettholdes og juster med varm pinsett, om nødvendig, før voksen stivner. Hell mer voks for å fylle formen.
    11. Plasser det merkede kassettlokket på toppen av plastformen og tilsett voks på toppen. Legg formen på den kalde platen for å størkne voksen. Oppbevares over natten ved 4 °C for å sikre at parafinvoksen størkner helt før mikrotomi.
    12. For å forberede deg på mikrotomi, slå på et vannbad på 35 °C, tørkeplaten og mikrotomen.
    13. Sett inn et blad i holderen og stram spaken for å feste den.
    14. Still inn trim og seksjonstykkelse, vanligvis 5 mm for stillasseksjoner.
    15. Fjern FFPE-stillaset fra formen, fest det i holderen på forsiden av mikrotomen, og trim forsiktig overflødig voks rundt kantene på prøven før du skjærer seksjoner.
    16. Begynn å skjære inn i voksblokken ved å rotere spaken på mikrotomen, noe som sikrer jevn bevegelse.
    17. Samle båndlignende seksjoner, rundt 3 stillasseksjoner om gangen, og plasser dem forsiktig i vannbadet på 35 °C for å fjerne rynker. Skill forsiktig seksjonene mens du er i vannbadet ved hjelp av pinsett.
    18. Bruk polysinbelagte glassmikroskoplysbilder, løft hver seksjon fra vannbadet slik at seksjonen sitter i midten av lysbildet. Merk hvert lysbilde med en blyant.
    19. Plasser glassslidene på tørkeplaten eller i en tørkeovn på 60 °C. Når de er tørket, oppbevares de ved 4 °C og fortsetter med den nødvendige histologiske flekken eller IHC-flekken.
  2. Uthenting av stillaser for genuttrykksanalyse
    1. Fjern stillasene fra de ikke-adherente 24-brønnsplatene fra inkubatoren (trinn 4.4.4) og plasser dem i den laminære strømningshetten.
    2. Bruk steril pinsett til å overføre stillasene til nymerkede 2 ml sentrifugerør.
    3. I en avtrekkshette tilsettes 1 ml fenol / guanidinbasert cellelysereagens til hvert rør for å lyse cellene i stillas og muliggjøre gjenvinning av RNA av høy kvalitet.
    4. Oppbevar rør ved -20 °C til de er klare til å utføre RNA-ekstraksjon ved hjelp av et passende sett. Bruk en standard revers-transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR)17, vurder genuttrykk i cellene i stillasene.

Representative Results

Den kollagenbaserte stillasmodellen beskrevet her har mange bruksområder som spenner fra å studere neuroblastombiologi til screening av kreftbehandling i et miljø som er mer fysiologisk lik innfødte svulster enn konvensjonell 2D-cellekultur. Før du tester et gitt forskningsspørsmål, er det avgjørende å oppnå en fullstendig karakterisering av cellefeste, proliferasjon og infiltrasjon innen ønsket eksperimentell tidsramme. Vekstbetingelsene vil avhenge av biologien til hver enkelt cellelinje. Det er viktig at flere metoder for vurdering av cellevekst må implementeres for å bestemme optimale forhold og robust ytelse.

Her ble levedyktigheten til nevroblastomceller dyrket på stillaser vurdert ved hjelp av en kolorimetrisk cellelevedyktighetsanalyse. Denne analysen kan utføres så ofte som ønsket gjennom hele den eksperimentelle tidsrammen. For det beskrevne eksperimentet ble det utført cellelevedyktighetsvurdering på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved 4 forskjellige tettheter (figur 6). Levedyktighet på dag 1 ble satt som en basislinje for å sammenligne alle påfølgende målinger. Reduksjonshastigheten av cellens levedyktighetsreagens reflekterer cellebiologien og vekstegenskapene til individuelle cellelinjer, inkludert deres proliferasjonshastigheter og metabolisme. En sammenheng mellom antall celler sådd på stillasene og graden av reduksjon var forventet. I dette eksperimentet økte reduksjonen av cellens levedyktighetsreagens generelt med hvert tidspunkt for begge cellelinjer ved alle tettheter, som forventet.

Hver tetthet ble deretter vurdert individuelt for begge cellelinjene for å sammenligne reduksjonen over tidspunkter. Enveis ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest ble utført for å oppdage signifikante forskjeller i reduksjon mellom tidspunkter (figur 7). For både cellelinjer og alle såtettheter var det en signifikant økning (P<0,05) i reduksjonen av cellens levedyktighetsreagens ved sammenligning av dag 1 og dag 14. Dette indikerte en signifikant økning i metabolsk aktive celler tilstede på stillasene. Denne økningen var ikke signifikant i alle tilfeller ved vurdering av 7-dagers intervaller (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), noe som viser viktigheten av optimalisering av såtettheten for å oppnå ønsket vekstvindu.

For å støtte resultatene av cellelevedyktighetsanalysen, kan cellevekst på stillaser også måles indirekte via kvantifisering av dsDNA ekstrahert fra stillas ved hjelp av en fluorescerende dsDNA-flekk (figur 8A). Som celle levedyktighet, kan DNA-kvantifisering gjøres så ofte som ønsket innenfor den eksperimentelle tidslinjen. Imidlertid krever denne analysen fullstendig gjenfinning av stillas og avslutning av cellevekst, og må derfor tas med i eksperimentell planlegging som diskutert i avsnitt 1. For dette eksperimentet ble DNA kvantifisert på dag 1, 7 og 14 for to neuroblastomcellelinjer, KellyLuc og IMR32, dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved 4 forskjellige tettheter. Siden den gjennomsnittlige konsentrasjonen av dsDNA per celle er kjent for disse cellelinjene, var det mulig å utlede antall celler per prøve fra det kvantifiserte DNA (figur 8B).

DNA-kvantifisering ga opphav til høyere variabilitet mellom biologiske replikater enn cellelevedyktighetsvurdering, men økte generelt for hvert tidspunkt, med de høyeste nivåene kvantifisert på dag 14. IMR32-celler ser ut til å nå høyere celletall på Coll-I-nHA-stillas, som indikert ved DNA-konsentrasjon, enn KellyLuc-celler. Hver tetthet ble deretter vurdert individuelt for de to cellelinjene for å sammenligne reduksjonen over tidspunkter. Enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest ble utført for å oppdage signifikante forskjeller i reduksjon mellom tidspunkter (figur 8B).

For både cellelinjer og alle såtettheter var det en signifikant økning (P<0,05) i celletall ved sammenligning av dag 1 og dag 14, med unntak av KellyLuc ved såtetthet 4 (1 × 105 celler/stillas), som ikke ga signifikante økninger over noen av tidspunktene. I likhet med cellenes levedyktighetsresultater var økningene ikke signifikante i alle tilfeller ved vurdering av 7-dagers intervallene (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Ved sammenligning av tidspunkttrender for cellelevedyktighet og DNA-kvantifisering var det noen små forskjeller mellom de to analysene. Imidlertid ble generelt lignende trender observert, med gjennomsnittlige verdier som øker mellom 7-dagers intervaller for de fleste tettheter. Dette demonstrerer viktigheten av å overvåke cellevekst ved hjelp av mer enn én metode.

Deretter ble det gjennomført en visuell vurdering av cellevekstmorfologi og fordeling på stillasene, som omfattet tradisjonell hematoksylin- og eosinfarging (H&E) samt IHC. Det forventes at de forskjellige vekstmønstrene til individuelle cellelinjer vil føre til varierte romlige arrangementer på stillas, inkludert forskjellige grader av penetrasjon i stillaset og celleklynger. Stillasene ble formalinfiksert, parafininnstøpt og kuttet i 5 mm seksjoner (figur 9A), og forberedte stillasene for flere visualiseringsteknikker, inkludert histologisk farging og IHC.

Rutinemessig H&E-farging ble brukt på Kelly-, KellyCis83- og IMR32-celler dyrket på kollagenbaserte stillaser på dag 1, 7 og 14 (figur 9B). Dette tillot visualisering av cellenes romlige orientering på to kollagenbaserte stillaser over en 14-dagers periode. Cisplatinfølsomme Kelly-celler og resistente KellyCis83-celler ble dyrket på både Coll-I-nHA-stillas (figur 9B, i) og Coll-I-GAG-stillas (figur 9B, ii). I samsvar med tidligere publiserte data vokste KellyCis83-celler med høyere hastighet og infiltrerte dypere inn i begge stillassammensetningene enn den mindre invasive Kelly-cellelinjen. H&E-flekken på en annen nevroblastomcellelinje, IMR32, dyrket på Coll-I-nHA viser et kontrasterende vekstmønster (figur 9B, iii). Denne cellelinjen vokste i store, tettpakkede klynger på kollagenstillasene i løpet av 14-dagersperioden. Brightfield konfokalmikroskopi kan brukes til å visualisere den porøse arkitekturen til kollagenbaserte stillaser (figur 9C) på grunn av autofluorescens av kollagenfibre.

Vi farget celler med falloidin rettet mot cytoskeletal aktin og kjernefysisk motflekk, 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), for å overvåke spesifikke celleegenskaper gjennom hele den eksperimentelle tidslinjen. En overflod av aktin ble observert i Kelly- og KellyCis83-celler på Coll-I-GAG-stillas ved bruk av denne teknikken (figur 9D). Disse resultatene demonstrerer hvordan flere bildebehandlingsteknikker kan brukes til å utlede romlig løst informasjon fra neuroblastomceller dyrket på stillaser ved hjelp av denne protokollen. Denne karakteriseringen av cellevekstmønstre på kollagenbaserte stillaser over en gitt periode vil forbedre forståelsen og tolkningen av eventuelle nedstrøms biokjemiske analyser.

Proteinuttrykk av celler dyrket på kollagenbaserte stillaser kan analyseres for å sammenligne cellulær aktivitet med in vivo-scenarier. Tidligere publiserte data undersøkte ekspresjonen av kromogranin A (CgA) som en surrogatutskilt markør for nevroblastom av KellyLuc og KellyCis83Luc-celler dyrket i cellemonolag samt på Coll-I-nHA og Coll-I-GAG-stillas (figur 10). CgA ble vurdert i det kondisjonerte mediet ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) (figur 10A). CgA utskilles med høyere hastighet i den mer aggressive kjemoresistente KellyCis83-cellelinjen enn i Kelly (figur 10B,C). Dette var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG og Coll-I-nHA stillas (P<0.05), mens det ikke var noen signifikant forskjell på dette tidspunktet for celler dyrket som et monolag ved konvensjonell 2D-kultur.

Disse resultatene fremhever også den begrensede eksperimentelle tidslinjen når man vokser celler i et monolag, med bare 7 dager med vekst som viser seg mulig før cellene når samløp. Veksten av celler på stillaser overvinner denne begrensningen, da de kan opprettholdes over en lengre periode under mer fysiologisk relevante forhold. Ovennevnte kombinasjon av teknikker for å skaffe seg informasjon om cellelevedyktighet, DNA-innhold, cellulær morfologi og romlig arrangement og ekspresjonsprofiler letter vurderingen av veksten av neuroblastomceller på en rekke kollagenbaserte stillas. Denne protokollen kan også enkelt tilpasses for å tilfredsstille spesifikke eksperimentelle krav og ønskede applikasjoner.

Figure 6
Figur 6: Celle levedyktighetsanalyse. (A) Generell prosedyre for måling av levedyktigheten til nevroblastomceller på kollagenbaserte stillaser ved bruk av en kolorimetrisk celle levedyktighetsanalyse. Inkubasjonsperioden må optimaliseres for hver ny cellelinje, med henvisning til produsentens retningslinjer. (B) Prosentvis reduksjon av cellelevedyktighetsreagens av KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA-stillas ved fire forskjellige innledende såtettheter, målt på dag 1, 7 og 14. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat med feilfelt som representerte standardavviket. Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Cellens levedyktighet ved såtetthet for celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dagers periode. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Tittelcellenumre refererer til den opprinnelige cellesåtettheten på stillasene på dag 0. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat, indikert med triplikate punkter, med stolper som representerte gjennomsnittet. One-Way ANOVA with Multiple Comparisons ble brukt til å oppdage signifikante forskjeller i % celle levedyktighet reagensreduksjon over de tre tidspunktene, notert på grafene (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; ANOVA = variansanalyse; NS = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Kvantifisering av DNA ekstrahert fra celler i stillas . (A) Prosess for å kvantifisere dsDNA fra celler dyrket på kollagenbaserte stillaser ved hjelp av en fluorescerende dsDNA-flekk. (B) Celletall fra DNA-kvantifiseringsanalyse ved såtetthet for KellyLuc- og IMR32-celler dyrket på Coll-I-nHA over en 14-dagers periode. Tittelcellenumre refererer til den opprinnelige cellesåingstettheten på stillas på dag 0. Prøvene ble vurdert i biologisk triplikat, indikert med triplikate punkter, med stolper som representerte gjennomsnittet. One-Way ANOVA with Multiple Comparisons ble brukt til å oppdage signifikante forskjeller i celletall over de tre tidspunktene, notert på grafene (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; dsDNA = dobbeltstrenget DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalyse; NS = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Vevsbehandlingstrinn for immunhistokjemianalyse av stillas . (A) Skjematisk fremstilling av protokollen for behandling av stillas for bildeanalyse. Denne prosessen tillater rutinemessig histologisk farging og spesifikk antistoffprobing ved bruk av primære antistoffer og fluorescerende merkede sekundære antistoffer. (B) Representative bilder av tre neuroblastomcellelinjer utsatt for H&E-farging. H&E-bilder tas på dag 1, 7, 14 for å overvåke vekstmønstre i løpet av eksperimentet. Skala bar = 200 μm. Stiplede firkanter representerer området som ble valgt for zoomede 20x-bilder nederst til venstre. Skala bar = 20 μm. (i og ii) H&E av Kelly og KellyCis83 neuroblastomcellelinjer (henholdsvis øvre og nedre paneler) på to typer kollagenbaserte stillas. (iii) H&E av IMR32-cellelinje, som representerer gruppert cellulær vekst på Coll-I-nHA-stillaset. (C) Representativt bilde av Kelly-cellelinjen, utsatt for lysefelt konfokalmikroskopi. Kollagenautofluorescensen tillater visualisering av det porøse stillaset. 10x skala bar = 200 μm, 20x skala bar = 20 μm. (D) Representativt bilde av innebygde stillas etterfulgt av analyse av IHC med falloidin og DAPI ved 10x forstørrelse, skala bar = 200 μm. Mindre innvendige firkanter representerer innzoomede bilder (20x), skalalinje = 20 μm. Forkortelser: nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagen stillas supplert med kondroitin-6-sulfat; H&E = hematoksylin og eosin; IHC = immunhistokjemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Proteinuttrykk fra nevroblastomceller dyrket på 3D-kollagenbaserte stillaser sammenlignet med 2D-plast . (A) Et skjema over hvordan CgA ELISA ble utført på betingede medier av celler dyrket på 2D-plast eller 3D-kollagenbaserte stillas. (B) CgA-proteinuttrykksnivåer tatt fra betingede medier av celler dyrket på et 2D-plastmonolag. Da cellene nådde sammenløp etter 7 dager, var 14-dagers tidspunktet ikke lesbart. Ved dag 7 på plast var det ingen signifikant forskjell i CgA-nivåer mellom Kelly og KellyCis83 cellelinjer. (C) CgA ELISA utført ved bruk av betingede medier av celler dyrket på kollagenbaserte stillaser i 14 påfølgende dager. På dag 7, på begge kollagenstillasene, er CgA-nivåene høyere i den mer aggressive KellyCis83-cellelinjen, noe som fremhever mer fysiologiske relevante nivåer av CgA i 3D-matrise sammenlignet med 2D monolayer. Denne figuren er modifisert fra Curtin et al.17. Forkortelser: 3D = tredimensjonal; 2D = todimensjonal; CgA = kromogranin A; ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse; nHA = nanohydroksyapatitt; Coll-I-nHA = kollagenstillas supplert med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagen stillas supplert med kondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin; HRP = pepperrotperoksidase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

3D-stillas-kreftcellemodellen har vist seg å være et verdifullt og allsidig verktøy for å få mekanistisk innsikt i nevroblastomcellevekst, levedyktighet og infiltrasjon av celler i en forenklet TME32. 3D-neuroblastommodellen beskrevet her etterligner minimal TME og gir mer fysiologisk relevante data enn en 2D monolagskultur. En stor ulempe med 3D-cellekultur er økt eksperimentell kompleksitet og lengre tidsrammer. Beskrevet her er en optimalisert protokoll for såing, vekst og vedlikehold av neuroblastomceller på kollagenbaserte stillaser etterfulgt av nedstrøms analyser og applikasjoner, noe som gir robust karakterisering av cellevekst. Vi hadde som mål å få innsikt i den optimale cellesåtettheten for stillasene for å skape et forutsigbart og kontrollerbart miljø for å vurdere behandling mot kreft i et raskt 14-dagers eksperimentelt vindu. Kombinasjonen av alle disse beskrevne enkle protokollene gir en godt avrundet vurdering av nevroblastomcellevekst i stillasbasert in vitro-kultursystem .

De kritiske punktene i protokolloppsettet har blitt vektlagt for å tillate forskere å etablere det samme i sine laboratorier raskt. For eksempel tillater de angitte inkubasjonstidene for bedre ytelse av den kolorimetriske cellelevedyktighetsanalysen dypere penetrasjon av reagenset i stillasporene for å nå alle celler. Dessuten er den fluorescerende dsDNA-fargeteknikken robust og grei; DNA-frigjøring fra stillasene krever imidlertid kraftig cellelyse da cellene er "fanget" i kollagenfibre.

Ved hjelp av den enkle DNA-kvantifiseringsanalysen som er beskrevet, kan vi identifisere loggvekstfasen på kollagenbaserte stillaser for screening av kreftmedisiner ved hjelp av denne modellen. I den beskrevne eksperimentelle settingen ble 4 innledende cellesåingstettheter brukt med en samlet 14-dagers periode og analysetidspunkter på dag 1, 7 og 14. Vi identifiserte at KellyLuc-celler sådd ved 4 × 105 celler/stillas har det mest signifikante aktive spredningsvinduet mellom dag 7 og 14. Disse loggfasevekstdataene vil muliggjøre pålitelig tolkning av forskjellige cellecytotoksisitetseksperimenter. Det eliminerer spekulasjoner om enhver nedgang i vekst eller celledød som følge av undertrykt vekst på den porøse 3D-plattformen i stedet for fra legemiddeltoksisitet. Cell levedyktighet er også en mye brukt vurdering for egnetheten til 3D-plattformer for å støtte veksten av forskjellige celletyper33,34. Mens det er mange analyser for å måle cellenes levedyktighet, inkludert levende / død farging, ATP-måling, spredningsanalyser, fant vi bruken av Alamar Blue kolorimetrisk celle levedyktighetsanalyse for å være en enkel og effektiv teknikk for å støtte DNA-kvantifiseringsdata.

Den kombinerte bruken av DNA-kvantifisering og celle levedyktighet ga komplementære bevis på at den optimale tettheten til frøceller på stillaset for å oppnå fortsatt vekst over en 14-dagers periode i gjennomsnitt er 2-4 × 105 celler / stillas. Denne protokollen kan imidlertid enkelt tilpasses for å tilfredsstille forskjellige eksperimentelle tidsrammer, analysetidspunkter og nedstrømsapplikasjoner. Selv om denne protokollen beskriver evalueringen av monokulturcellevekst av neuroblastomceller på stillas, er stillasene lett å endre for bruk som en plattform for samkultur, beskrevet av Amaral et al., som benyttet kollagen-GAG-stillas til å dyrke keratinocytter og fibroblaster i en undersøkelse av sårheling35.

Den beskrevne 3D-modellen muliggjør visualisering av cellevekst og infiltrasjon ved hjelp av forskjellige kjente teknikker, for eksempel immunfluorescens og standard H&E. Det er viktig å visualisere cellene sammen med karakterisering av vekst ved hjelp av biokjemiske analyser på grunn av mangfoldet av cellemorfologi og vekstmønstre på stillas. Å forstå vekstmønsteret kan gi innsikt i vekstatferd og fremtidig respons på kreftmedisiner. For eksempel gir IMR32-vekst ved hjelp av DNA-kvantifisering lignende mønstre som Kelly, men ved visualisering ved hjelp av H&E vokser IMR32 i større klynger enn Kelly, som viste mer spredt vekst (figur 9). Disse varierte vekstmønstrene av cellelinjer i stillas gjenspeiler det kliniske scenariet for tumorheterogenitet. Undersøkelse av legemiddelrespons mot kreft ved hjelp av et panel av cellelinjer med ulik morfologi i 3D-stillas vil øke den prediktive verdien for pasientrespons på de samme legemidlene.

Deteksjon av gen- eller proteinuttrykk kan også utføres ved hjelp av andre tilnærminger som RT-qPCR eller ELISA hvis proteinet av interesse utskilles. En surrogatmarkør for nevroblastomprogresjon, kromogranin A (CgA)36, ble brukt til å i tillegg karakterisere nevroblastomcellevekst i 3D. Som beskrevet i tidligere arbeid17, økte CgA-sekresjonen etter hvert som cellene prolifererte (figur 10). Mens monolags cellekultur ikke kunne fange denne økningen, da spredning betydde at celler nådde full samløp i kulturskålene, tillot bruken av 3D-kollagenstillasene langvarig vurdering av CgA-sekresjon.

Denne 3D in vitro-modellen er kanskje ikke egnet for alle forskningsspørsmål for å studere neuroblastombiologi og respons på terapi. En av begrensningene er ujevn cellepenetrasjon i stillas og dannelse av celleklynger av varierende størrelse, som avhenger av en gitt cellelinje og kan føre til ukontrollerbar diffusjon av næringsstoffer og testmedisiner. Denne funksjonen påvirker robustheten i terapeutisk screening. Til tross for denne begrensningen er det imidlertid viktig å vurdere at innfødte svulster også er heterogene i størrelse og kreftcellefordeling og inneholder mange andre celletyper i tumorvevet. For å overvinne denne begrensningen foreslår vi bruk av hvert cellebefolket stillas som et enkelt mikrovev for hvilket følgende parametere vil bli optimalisert: (a) inkubasjonstider for cellens levedyktighetsreagens for å nå cellene og celleklyngene, og (b) lysering av cellene i Triton X-100-buffer ved forbehandling av celler på stillaser med en vevslyser for å frigjøre DNA fra cellene som finnes dypt i stillaset.

En annen teknisk begrensning av denne protokollen er mangelen på mekanisk testing av hver batch av nyproduserte stillaser for denne modellen. Bruk av stillasets robuste produksjonsprosess, som har blitt omfattende karakterisert i forhold til fysiske og kjemiske egenskaper til stillasene, som kompresjons- og strekkmodul, porøsitet og visuell porestruktur og homogenitet, sikrer imidlertid at stillasegenskapene opprettholdes gjennom partiene 21,24,27,30,37.

Oppsummert presenterer denne artikkelen en rekke enkle metoder for analyse av cellulær vekst på kollagenbaserte stillas. Både den eksperimentelle tidslinjen og analysepunktene kan byttes ut avhengig av de spesifikke forskningsspørsmålene. Denne protokollen kan også tilpasses andre celletyper. Resultatene vist ovenfor gir bevis på hvordan denne sammenstillingen av metoder ga innsikt i den optimale såtettheten for forskjellige neuroblastomcellelinjer for å skape kontinuerlig vekst over 14 dager. Sammenslåingen av resultater oppnådd fra alle metodene i denne protokollen gir en overlegen forståelse av cellevekst i 3D-kollagenmatrisen. Fremtidig utnyttelse av denne modellen vil trolig innebære kokultursystemer som er spesifikke for neuroblastom TME og testing av ulike nye kreftmedisiner.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Children's Research Center (NCRC), Irish Research Council (IRC) og Neuroblastoma UK. Illustrasjonene ble laget ved hjelp av BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
IMR-32 ATCC CCL-127
Kelly ECACC 82110411
KellyCis83 Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) - Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired
SH-SY5Y ATCC CRL-2266
Disposable
0.22 µm syringe filter Millex SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 120.086
100 mL sterile Pot Starstedt -
10 mL plastic pipette Cellstar 607 180
15 mL Falcon tube Starstedt 62.554.502
25 mL plastic pipette Cellstar 760 180
50 mL Falcon tube Starstedt 62.547.254
5 mL plastic pipette Cellstar 606 180
6 mm Biopsy punches Kai Medical BP-60F
Aluminium foil - -
Cover Slip Menzel-Glaser -
HYPERflask Corning CLS10030
Microscope slides Thermo Scientific J1840AMNT
Opaque black 96-well plate Costar 3915
Sterile P10 tips Starlab S1121-3810
Sterile P1000 tips Starlab S1122-1830
Sterile P20 tips Starlab S1123-1810
Sterile P200 tips Starlab S1120-8810
T-175 (175 cm2 flask) Sarstedt 83.3912
T-75 (75 cm2 flask) Sarstedt 83.3911.302
Translucent clear 96 well plate Cellstar 655180
Translucent non-adherent 24 well plates Cellstar 83.3922.500
Equipment
Autoclave Astell -
Automatic tissue processor Leica TP1020
Centrifuge 5804 Eppendorf -
Hemocytometer Hausser  Scientific -
Incubator ThermoScientific -
Microtome Leica RM2255
Oven Memmert Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P10 pipette Gilson
P100 pipette Gilson
P1000 pipette Gilson
P20 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P200 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Paraffin section flotation bath Electrothermal MH8517 Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Pipette electronic dispenser Corning StripipetterUltra Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Plate cooler Leica EG1140C Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Refrigerator -20 °C Liebherr -
Refrigerator -80 °C Liebherr -
Refrigerator 4 °C Liebherr -
Seesaw Rocker DLAb SK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V Platereader PerkinElmer 1420
Tissue culture hood/Laminar flow hood GMI 8038-30-1044
Tissue Lyser Qiagen TissueLyser LT
Tweezers - -
Water bath Grant -
Wax embedder Leica EG1140H
Materials
1 L Water Adrona - Biosciences 568
1% Triton-X Sigma Aldrich 9002-93-1
10x PBS tablets Sigma Aldrich P4417-100TAB
37% paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Alamar Blue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1100
Collagen- glycosaminoglycan scaffold Tissue engineering research group (TERG)
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold Tissue engineering research group (TERG)
dH20 Adrona - Biosciences 568
Eosin Sigma-Aldrich E4009 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOH Sigma-Aldrich 1.00983.2500 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12 Gibco 21765-029
FBS Gibco 10270-106
Hemaytoxylin Sigma-Aldrich HHS32-1L
L-Glutamine Gibco 25030-024
MEM Gibco 21090-022
miRNA easy Kit Qiagen 217004
MNEAA’s Gibco 11140-035
Penicillin/streptomycin Gibco 015140-122
Qiazol Qiagen 79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
RPMI Gibco 21875-034
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S7795-500G
Tissue embedding Medium Sigma A6330-4LB
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Software
Excel - Excel 2016
ImageJ - -
Prism - Version 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11 (2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38 (2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Tags

Tredimensjonal in vitro biomimetisk modell neuroblastom kollagenbaserte stillaser barnekreft tumorvev ekstracellulær matriks (ECM) sykdomsprogresjon pasientprognose terapeutisk respons neuroblastomcellelinjer nanohydroksyapatitt (nHA) glykosaminoglykaner (GAGs) bein og benmarg metastatiske steder porøs struktur cellefeste spredning migrasjon celleklynger terapeutika in vivo-situasjon stillasbasert kultursystem todimensjonal (2D) celle Kultur DNA-kvantifisering celle levedyktighet

Erratum

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Tredimensjonal <em>in vitro</em> biomimetisk modell av neuroblastom ved bruk av kollagenbaserte stillas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly,… More

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly, G., O’Brien, F. J., Piskareva, O. Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds. J. Vis. Exp. (173), e62627, doi:10.3791/62627 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter