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Cancer Research

कोलेजन-आधारित मचानों का उपयोग करके न्यूरोब्लास्टोमा का त्रि-आयामी इन विट्रो बायोमिमेटिक मॉडल

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62627
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 4, 3,5,6, 1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 7Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen's Green, Dublin 2, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland, 7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

यह पेपर पहले से वर्णित त्रि-आयामी कोलेजन-आधारित मचानों पर न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों को बीज देने, पूर्व निर्धारित समय सीमा के लिए सेल विकास को बनाए रखने और कई सेल विकास और सेल व्यवहार विश्लेषण और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए मचानों को पुनः प्राप्त करने के लिए आवश्यक चरणों को सूचीबद्ध करता है, जो प्रयोगात्मक उद्देश्यों की एक श्रृंखला को पूरा करने के लिए अनुकूलनीय हैं।

Abstract

न्यूरोब्लास्टोमा बच्चों में सबसे आम एक्स्ट्राक्रैनियल ठोस ट्यूमर है, जो समग्र बाल चिकित्सा कैंसर से होने वाली मौतों का 15% है। मूल ट्यूमर ऊतक एक जटिल त्रि-आयामी (3 डी) माइक्रोएन्वायरमेंट है जिसमें कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं की परतें शामिल हैं जो एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से घिरी हुई हैं। ईसीएम शारीरिक और जैविक सहायता प्रदान करता है और रोग की प्रगति, रोगी रोग का निदान और चिकित्सीय प्रतिक्रिया में योगदान देता है।

यह पेपर न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों और कोलेजन-आधारित मचानों का उपयोग करके न्यूरोब्लास्टोमा माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने के लिए 3 डी पाड़-आधारित प्रणाली को इकट्ठा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। मचानों को या तो नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट (एनएचए) या ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स (जीएजी) के साथ पूरक किया जाता है, जो स्वाभाविक रूप से अस्थि और अस्थि मज्जा में उच्च सांद्रता में पाए जाते हैं, जो न्यूरोब्लास्टोमा के सबसे आम मेटास्टैटिक स्थल हैं। इन मचानों की 3 डी छिद्रपूर्ण संरचना न्यूरोब्लास्टोमा सेल अटैचमेंट, प्रसार और प्रवासन और सेल क्लस्टर के गठन की अनुमति देती है। इस 3 डी मैट्रिक्स में, चिकित्सीय के लिए सेल प्रतिक्रिया विवो स्थिति में अधिक प्रतिबिंबित होती है।

पाड़-आधारित संस्कृति प्रणाली पारंपरिक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति की तुलना में उच्च सेल घनत्व बनाए रख सकती है। इसलिए, प्रारंभिक सीडिंग सेल संख्याओं के लिए अनुकूलन प्रोटोकॉल वांछित प्रयोगात्मक समय सीमा पर निर्भर हैं। मॉडल की निगरानी डीएनए परिमाणीकरण के माध्यम से सेल वृद्धि, चयापचय परख के माध्यम से सेल व्यवहार्यता और हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन के माध्यम से मचानों के भीतर सेल वितरण का आकलन करके की जाती है।

इस मॉडल के अनुप्रयोगों में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के मूल्यांकन के साथ-साथ पारंपरिक दवाओं और एमआईआरएनए का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण शामिल है। 3 डी संस्कृति प्रणाली सेल और ईसीएम घटकों के सटीक हेरफेर की अनुमति देती है, जिससे मूल ट्यूमर ऊतक के समान अधिक शारीरिक रूप से वातावरण बनता है। इसलिए, यह 3 डी इन विट्रो मॉडल रोग रोगजनन की समझ को आगे बढ़ाएगा और विट्रो में प्राप्त परिणामों के बीच सहसंबंध में सुधार करेगा, पशु मॉडल में विवो में, और मानव विषयों में।

Introduction

न्यूरोब्लास्टोमा सहानुभूति तंत्रिका तंत्र का एक बाल चिकित्सा कैंसर है जो भ्रूण के विकास या प्रारंभिक प्रसवोत्तर जीवन के दौरान तंत्रिका शिखाकोशिकाओं के परिवर्तन के कारण उत्पन्न होता है। यह बच्चों में सबसे आम ठोस एक्स्ट्राक्रेनियल ट्यूमर है, जो 15 वर्ष से कम उम्र के रोगियों में निदान किए गए 8% घातकताओं का प्रतिनिधित्व करता है और सभी बचपन के कैंसर से होने वाली मौतों के 15% के लिए जिम्मेदार है। रोग विशिष्ट क्रोमोसोमल, आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तन, और हिस्टोपैथोलॉजी विशेषताओं के कारण अत्यधिक विषम नैदानिक व्यवहार प्रदर्शित करता है।

ये परिवर्तन न्यूरोब्लास्टोमा की आक्रामकता और बाल रोगियों में खराब परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, वर्तमान उपचार नैदानिक रूप से आक्रामक रोग2 के साथ लगभग 80% रोगियों के लिए लंबी अवधि में अप्रभावी साबित होते हैं, इस तथ्य पर प्रकाश डालते हुए कि रोगियों के इस समूह के लिए उपचार चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यह न्यूरोब्लास्टोमा विषमता और मेटास्टेस के तंत्र के कारण होने की संभावना है जो अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं जा रहा है। हालांकि, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) को अब व्यापक रूप से कई कैंसर की प्रगति में भूमिका निभाने के लिए माना जाता है; फिर भी यह न्यूरोब्लास्टोमा 3,4 में कम अध्ययन किया गया है।

देशी टीएमई एक जटिल 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट है जिसमें ईसीएम से घिरे कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाएं शामिल हैं। ईसीएम एक ऊतक के एककोशिकीय घटक को संदर्भित करता है जो अपने सेलुलर निवासियों को संरचनात्मक और जैव रासायनिक सहायता प्रदान करता है और रोग की प्रगति, रोगी रोग का निदान और चिकित्सीय प्रतिक्रियामें योगदान देता है। रोग की प्रगति का यह प्रचार "गतिशील पारस्परिकता" या कोशिकाओं और ईसीएम 6,7,8 के बीच चल रहे द्विदिश संचार के कारण है। जैसे-जैसे कैंसर बढ़ता है, स्ट्रोमल कोलेजन को अक्सर स्ट्रोमा-कैंसर इंटरफ़ेस के लंबवत रैखिक पैटर्न में पुनर्गठित किया जाता है, जिसे कैंसर कोशिकाएं मेटास्टेसिस 9,10,11 के लिए प्रवासी मार्ग के रूप में उपयोग करती हैं।

इस मूल कार्यात्मक जैविक मचान के मुख्य घटकों में कोलेजन टाइप I और II और अन्य प्रोटीन का एक रेशेदार नेटवर्क शामिल है, जिसमें इलास्टिन, ग्लाइकोप्रोटीन जैसे लैमिनिन, साथ ही प्रोटीओग्लाइकेन्स और अन्य घुलनशील घटकों की एक श्रृंखला 12,13 शामिल है। देशी ईसीएम के ये प्रोटीन अब 3 डी इन विट्रो मॉडल3 विकसित करने के लिए आकर्षक प्राकृतिक बायोमोलेक्यूल्स बन गए हैं। इन विट्रो सेल संस्कृति के लिए 3 डी मचानों का अनुप्रयोग पारंपरिक 2 डी मोनोलेयर संस्कृति की तुलना में टीएमई के अधिक शारीरिक प्रतिनिधित्व के कारण लोकप्रियता में बढ़ रहा है। निर्मित 3 डी मचान सेल लगाव, प्रसार, प्रवासन, चयापचय और विवो जैविक प्रणालियों में देखी गई उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया में सहायता करते हैं।

इन 3 डी मचानों का प्रमुख घटक कोलेजन है, जो ऊतक की मरम्मत, एंजियोजेनेसिस, ऊतक मोर्फोजेनेसिस, सेल आसंजन और माइग्रेशन11 सहित कई सामान्य जैविक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। कोलेजन-आधारित 3 डी मैट्रिसेस ने ईसीएम मॉडल के लिए अपनी मजबूत कार्यक्षमता दिखाई है, जो सेल-ईसीएम इंटरैक्शन के साथ-साथ सेल माइग्रेशन और आक्रमण को सक्षम करते हुए इन विट्रो बायोमिमेटिक माइक्रोएन्वायरमेंट के रूप में कार्य करता है। ये 3 डी मैट्रिसेस न्यूरोब्लास्टोमा17,18 सहित कई कैंसर मॉडल 14,15,16 में पारंपरिक 2 डी या "फ्लैट" संस्कृति की तुलना में कीमोथेरेपी दवाओं के लिए सेल प्रतिक्रिया का अधिक सटीक विश्लेषण प्रदान करते हैं। 3 डी सेल संस्कृतियों के आनुवंशिक विश्लेषण ने पशु मॉडल19 की तुलना में भी मानव ऊतक प्रोफ़ाइल के साथ एक उच्च सहसंबंध की सूचना दी है। कुल मिलाकर, इन 3 डी मचानों की आधारशिला कोशिकाओं को एक उपयुक्त इन विट्रो वातावरण प्रदान करना है, जो देशी ऊतक वास्तुकला को पुन: उत्पन्न करता है और द्विदिश आणविक क्रॉसटॉक8 की सुविधा प्रदान करता है।

कोलेजन-आधारित मॉडल की जटिलता को बढ़ाने के लिए, अन्य सामान्य ईसीएम घटकों को ऊतक इंजीनियरिंग प्रक्रिया में शामिल किया जाता है, इस प्रकार विभिन्न ऊतकों के आला टीएमई को प्रतिबिंबित करने के लिए अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल बनाते हैं। उदाहरण के लिए, जीएजी, सभी स्तनधारी ऊतकों में मौजूद नकारात्मक रूप से चार्ज पॉलीसेकेराइड20, सेल लगाव, प्रवासन, प्रसार और भेदभाव की सुविधा प्रदान करते हैं। चोंड्रोइटिन सल्फेट हड्डी और उपास्थि में पाया जाने वाला एक विशिष्ट प्रकार का जीएजी है, जिसका उपयोग पहले हड्डी की मरम्मत 21,22,23,24,25 के लिए ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में किया गया है। नैनो-हाइड्रॉक्सीपैटाइट (एनएचए) मानव हड्डी के ऊतकों की खनिज संरचना का मुख्य अकार्बनिक घटक है, जो वजन26 से हड्डी के 65% तक का गठन करता है और इसलिए हड्डी के प्रतिस्थापन और पुनर्जननके लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, जीएजी और एनएचए प्राथमिक न्यूरोब्लास्टोमा ईसीएम के पुनर्निर्माण और न्यूरोब्लास्टोमा, अस्थि मज्जा (70.5%), और हड्डी (55.7%) की सबसे आम मेटास्टैटिक साइटों को मॉडलिंग करने के लिए आकर्षक कंपोजिट हैं।

इन ईसीएम घटकों को शामिल करने वाले मचानों को मूल रूप से हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए उनकी जैव-रासायनिकता, विषाक्तता और ऑस्टियोकंडक्टिव और ओस्टियोइंडक्टिवविशेषताओं के व्यापक विश्लेषण के साथ विकसित किया गया था। वे अपने भौतिक और जैविक गुणों को नियंत्रित करने के लिए फ्रीज-सुखाने की तकनीकों का उपयोग करके उत्पादित छिद्रपूर्ण, कोलेजन-आधारित मैट्रिक्स हैं। कोलेजन स्काफोल्ड्स को या तो एनएचए (कोल-आई-एनएचए) या चोंड्रोइटिन-6-सल्फेट (कोल-आई-जीएजी) के साथ पूरक किया गया, स्तन कैंसर31 में प्राथमिक टीएमई और प्रोस्टेट कैंसर15 में हड्डी के मेटास्टेसिस के साथ-साथ न्यूरोब्लास्टोमा17 की नकल करने में सफलता का प्रदर्शन किया। इन मिश्रित मचानों के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली फ्रीज-सुखाने की तकनीक22,23,24 मचानों के भीतर छिद्र आकार और सरंध्रता में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकरूपता पैदा करती है। संक्षेप में, एक कोलेजन घोल (0.5 डब्ल्यूटी%) 0.05 एम एसिटिक एसिड के साथ फाइब्रिलर कोलेजन को मिलाकर बनाया जाता है। कोल-आई-जीएजी के लिए, शार्क कार्टिलेज से अलग किए गए क्रोन्डोटिन-6-सल्फेट का 0.05 डब्ल्यूटी% मिश्रण करते समय कोलेजन घोल में जोड़ा जाता है। मिश्रित कोल-आई-एनएचए मचानों के लिए, नैनो-आकार के हाइड्रॉक्सीपैटाइट कणों को पहले वर्णित27 के रूप में संश्लेषित किया जाता है और सम्मिश्रण प्रक्रिया के दौरान कोलेजन के वजन के 2: 1 अनुपात में कोलेजन घोल में जोड़ा जाता है। सभी मचानों को 24 घंटे25 के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर डीहाइड्रोथर्मल उपचार का उपयोग करके शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक और स्टरलाइज़ किया जाता है। बेलनाकार मचानों (6 मिमी व्यास, 4 मिमी ऊंचाई) को बायोप्सी पंच का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है और संरचनाओं के यांत्रिक गुणों में सुधार करने के लिए आसुत जल (डीएच2ओ) में 3 एमएम एन-(3-डाइमिथाइलएमिनोप्रोपिल)-एन-एथिलकार्बोडिमाइड हाइड्रोक्लोराइड और 5.5 एमएम एन-हाइड्रॉक्सीसक्सिनिमाइड (ईडीएसी / एनएचएस) के साथ रासायनिक रूप से क्रॉसलिंक किया जा सकताहै। दो कोलेजन मचानों की यह अच्छी तरह से अनुकूलित विनिर्माण प्रक्रिया प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य यांत्रिक गुणों के साथ मचान बनाती है, जिसमें छिद्र आकार, छिद्र और कठोरता (केपीए) शामिल हैं। कोल-आई-जीएजी और कॉल-आई-एनएचए दोनों मचानों में अलग-अलग भौतिक गुण होते हैं, जो विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों का निर्माण करते हैं। प्रत्येक मचान के गुण तालिका 1 में प्रदर्शित किए गए हैं।

Coll-I-GAG Coll-I-nHA
मचान का आकार
(व्यास [मिमी] x ऊंचाई [मिमी])		 6 x 4 17 6 x 4 17
कोलेजन एकाग्रता (wt. %) 0.5 17 0.5 17
सब्सट्रेट एकाग्रता (wt. %)
[कोलेजन के वजन के आधार पर]		 0.05 15,17 200 17
औसत छिद्र आकार (मिमी) 96 22 96 – 120 29
सरंध्रता (%) 99.5 23 98.9 – 99.4 27
कठोरता (kPa) 1.5 27 5.5 - 8.63 29

तालिका 1: न्यूरोब्लास्टोमा जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अपनाए गए दो मचानों के यांत्रिक गुणों का अवलोकन।

यह पेपर न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों का उपयोग करके न्यूरोब्लास्टोमा माइक्रोएन्वायरमेंट की बेहतर नकल करने के लिए 3 डी पाड़-आधारित प्रणाली को इकट्ठा करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और पहले वर्णित कोलेजन-आधारित मचानों को एनएचए (कोल-आई-एनएचए) या चोंड्रोइटिन -6-सल्फेट (कॉल-आई-जीएजी) के साथ पूरक किया गया था। प्रोटोकॉल में 2 डी मोनोलेयर संस्कृति चित्रा 1 से अनुकूलित पहले से अनुकूलित सस्ती विधियों का उपयोग करके अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण में न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के विकास तंत्र का विश्लेषण करने के लिए डाउनस्ट्रीम तरीके शामिल हैं।

Figure 1
चित्र 1: समग्र प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो। (ए) कोशिकाओं को पर्याप्त संख्या में उगाया जाता है, विभाजित, गिना जाता है, और माध्यम की उचित मात्रा में पुन: निलंबित किया जाता है। (बी) यह सेल स्टॉक तब विभिन्न घनत्वों के कुल 4 सेल निलंबन तैयार करने के लिए सीरियल कमजोर पड़ने से गुजरता है। (C) कोलेजन-आधारित मचानों को बाँझ रूप से गैर-अनुगामी 24-वेल प्लेटों में चढ़ाया जाता है, और (D) प्रत्येक मचान के केंद्र में 20 μL सेल निलंबन जोड़ा जाता है और 3-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5%CO2 और 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दिया जाता है। (च) प्रत्येक पूर्व निर्धारित समय बिंदु पर, सेल व्यवहार्यता और विकास मूल्यांकन, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन के लिए कई मचानों को पुनः प्राप्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. प्रायोगिक डिजाइन

नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक मचानों और कोशिकाओं की संख्या प्रयोग के पैमाने पर निर्भर करेगी और प्रयोगात्मक डिजाइन पर इस खंड में उपकरणों का उपयोग करके गणना की जा सकती है।

  1. आवश्यक मचानों की संख्या
    1. सेल जीव विज्ञान (जैसे, सेल विकास और चयापचय) में परिवर्तन के लिए समग्र प्रयोगात्मक समयरेखा और मूल्यांकन अंतराल निर्धारित करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, प्रयोगात्मक समय सीमा 14 दिन है, जिसमें हर 7 दिनों में सेल वृद्धि का आकलन होता है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक समय बिंदु दिन 1, 7, 14 हैं जो कुल 3 समय बिंदु देते हैं।
    2. इसके बाद, प्रत्येक समय बिंदु पर लागू किए जाने वाले प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की संख्या तय करें। परिवर्तनों की निगरानी के लिए हर समय एक ही विश्लेषण को पूरा करने का प्रयास करें।
      नोट: मचानों पर सेल वृद्धि के विशिष्ट विश्लेषण में सेल व्यवहार्यता परख, डीएनए परिमाणीकरण, हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन और इमेजिंग, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण शामिल हैं। इन पर आगे खंड 5 में चर्चा की जाएगी।
    3. तय करें कि कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक ही मचान का उपयोग कब करना है, उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त परख का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन के बाद, डीएनए / आरएनए अलगाव के लिए मचान का पुन: उपयोग करें (5.1.11 में चर्चा की गई है)।
    4. प्रत्येक अनुप्रयोग के लिए कम से कम 3 जैविक प्रतिकृतियां रखें, उदाहरण के लिए, सेल व्यवहार्यता और डीएनए परिमाणीकरण के लिए 3 मचान, हिस्टोलॉजी के लिए 3 और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए 3। चूंकि यह प्रति समय 9 मचानों के बराबर है, इसलिए 3 समय बिंदुओं के लिए 27 मचानों का उपयोग करने की योजना है।
    5. अंत में, इस संख्या को प्रयोगात्मक मापदंडों या स्थितियों की संख्या से गुणा करें (उदाहरण के लिए, कई सेल लाइनों का आकलन, प्रारंभिक सीडिंग घनत्व, पाड़ रचनाएं)।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक सेल लाइन के लिए 4 अलग-अलग प्रारंभिक सीडिंग घनत्व का आकलन किया जा रहा था, जिसके परिणामस्वरूप 108 (27 मचान x 4 स्थितियां) मचानों की आवश्यकता थी। मानवीय भूल को ध्यान में रखते हुए और अतिरिक्त कवरेज देने के लिए, इस संख्या में ~ 10% जोड़ें, उदाहरण के लिए, यदि 108 मचानों की आवश्यकता है, तो 120 मचान तैयार करें।
  2. आवश्यक कक्षों की संख्या
    नोट: दिन 0 पर बेलनाकार मचान (व्यास 6 मिमी, ऊंचाई 4 मिमी) पर कोशिकाओं को बोने के लिए सेल निलंबन की 20 μL मात्रा की सिफारिश की जाती है। सेल निलंबन के इस 20 μL में कोशिकाओं की संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार समायोजित की जाती है, जिसकी गणना खंड 1.1 में की जाती है। एक सामान्य प्रारंभिक सीडिंग घनत्व 2 × 105 कोशिकाएं प्रति 20 μL है, जिसका उपयोग नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कुल मात्रा की गणना करने के लिए, प्रारंभिक 2 × 105 कोशिकाओं प्रति 20 μL को आवश्यक मचानों की संख्या से गुणा करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, 30 मचानों को 20 μL से गुणा करने पर कुल मात्रा 600 μL मिलती है। यदि प्रत्येक मचान को 2 × 10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, तो 600 μL निलंबन में कुल 6 × 10 6 कोशिकाएं (2 × 105 × 30) होती हैं, जिससे 600 μL में 6 ×10 6 कोशिकाओं की अंतिम आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक मापदंडों की संख्या आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या को निर्धारित करेगी। इसलिए, यह प्रोटोकॉल एक मल्टीलेयर सेल कल्चर फ्लास्क का उपयोग करके सेल कल्चर को रेखांकित करता है, जो 10 पारंपरिक 175 सेमी2 फ्लास्क के समान कोशिकाओं को संभाल सकता है।

2. कोलेजन-आधारित मचानों की तैयारी

नोट: कोल-आई-एनएचए और कोल-आई-जीएजी बेलनाकार मचान (व्यास 6 मिमी, ऊंचाई 4 मिमी) स्थापित विधियों 15,21,27 का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं। एक बार पहले प्रकाशित विधियों17 के अनुसार रासायनिक रूप से क्रॉसलिंक होने के बाद, मचानों का उपयोग 1 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।

  1. वांछित यांत्रिक गुणों के साथ मचानों के निर्माण के बाद, सुनिश्चित करें कि मचान पूरी तरह से हाइड्रेटेड हैं और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में अच्छी तरह से धोए गए हैं।
    नोट: यह आम तौर पर मचानों के क्रॉसलिंकिंग के बाद ~ 12 घंटे लगते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 एमएल टिशू कल्चर अपशिष्ट कंटेनरों में किया जा सकता है, जिसमें प्रति कंटेनर अधिकतम 50 मचान और प्रति मचान 2 एमएल पीबीएस होता है।
  2. उपयोग के लिए तैयार होने तक पीबीएस में मचानों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. एक बहुस्तरीय सेल कल्चर फ्लास्क में न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं का प्रचार करें

नोट: मल्टीलेयर फ्लास्क के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व अलग-अलग होगा। इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार इष्टतम घनत्व 1 × 107 कोशिकाएं हैं। मल्टीलेयर फ्लास्क को बोने से पहले, कोशिकाओं को एक उपयुक्त ऊतक संस्कृति फ्लास्क (जैसे, टी 175 सेमी2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क) में 1 × 107 कोशिकाओं या उससे अधिक के घनत्व तक फैलाएं। कोशिकाओं को बहुस्तरीय फ्लास्क (खंड 3.1) में बीज देने के लिए, उन्हें 70-80% कंफ्लुएंट तक बढ़ाएं, फसल लें और प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, सेल गिनती करने के लिए चरण 3.2.16-3.2.20 का उल्लेख करें। एक बार सेल निलंबन की गणना हो जाने के बाद, मल्टीलेयर फ्लास्क के सीडिंग के लिए तुरंत आगे बढ़ें। बाँझपन बनाए रखने के लिए सेल कल्चर का काम एक लामिनर फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।

  1. मल्टीलेयर सेल कल्चर फ्लास्क को सीडिंग करना।
    1. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 550 एमएल पूर्ण विकास माध्यम (उपयोग में सेल लाइन के आधार पर भिन्न होता है) और 100 एमएल बाँझ पीबीएस को गर्म करें।
    2. काटे गए सेल निलंबन का उपयोग करके, समीकरण (1) का उपयोग करके 1 ×10 7 कोशिकाओं के इष्टतम सीडिंग घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा की गणना करें, जहां वांट मल्टीलेयर फ्लास्क को सीडिंग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को संदर्भित करता है, और एचएवी सेल निलंबन में कोशिकाओं / एमएल की संख्या को संदर्भित करता है:
      Equation 1(1)
      उदाहरणस्‍वरूप। Equation 2
    3. सेल सस्पेंशन की आवश्यक मात्रा को प्रीवार्म्ड ग्रोथ माध्यम के 100 एमएल में जोड़ें।
    4. हुड में एक नया मल्टीलेयर फ्लास्क लें, टोपी हटा दें, और फ्लास्क को 60 डिग्री कोण पर रखें। धीरे-धीरे सेल निलंबन के सभी 100 एमएल को फ्लास्क में पिपेट करें, गर्दन के कोण वाले पक्ष के नीचे। फ्लास्क को कैप करें और इसे इसके किनारे रखें ताकि कोशिकाएं पूरे परतों में समान रूप से वितरित हो सकें।
    5. 60 ° कोण पर, गर्दन के कोण वाले हिस्से को धीरे-धीरे डालकर या पाइप करके मल्टीलेयर फ्लास्क में 400 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड ग्रोथ मीडियम जोड़ें। यदि गर्दन भर जाती है, तो फ्लास्क को एक सीधी स्थिति में लौटाएं, या फ्लास्क को कैप करें और डालने से पहले इसे अपनी तरफ रखें।
      नोट: अत्यधिक बुलबुला गठन से बचने के लिए धीरे-धीरे डालें। सभी बुलबुले को शीर्ष तक उठने की अनुमति देने के लिए फ्लास्क को सीधी स्थिति में धीरे से टैप करें और उन्हें 10 एमएल पिपेट से हटा दें। सुनिश्चित करें कि फ्लास्क गर्दन के निचले धागे से भरा हुआ है; इसे प्राप्त करने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो अधिक माध्यम जोड़ें।
    6. मल्टीलेयर फ्लास्क को कैप करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर कोण वाली गर्दन के साथ इनक्यूबेट करें।
    7. कंफ्लुएंसी के लिए हर 2-3 दिनों में विकास की जांच करें। मल्टीलेयर फ्लास्क की नीचे की दो परतों के संयोजन की जांच करने के लिए, उन्हें उल्टे माइक्रोस्कोप के 4x उद्देश्य लेंस के तहत देखें।
      नोट: जब 1 × 107 न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के साथ बीज दिया जाता है, तो 10-परत फ्लास्क को आमतौर पर कंफ्लुएंट बनने में एक सप्ताह लगेगा- हालांकि यह उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  2. मल्टीलेयर फ्लास्क में कोशिकाओं का नियमित रखरखाव
    1. पूर्ण विकास माध्यम के 550 एमएल (उपयोग में सेल लाइन के आधार पर भिन्न होता है), 50-100 एमएल ट्रिप्सिन, और 300 एमएल बाँझ पीबीएस को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    2. 70-80% कंफ्लुएंसी के लिए मल्टीलेयर फ्लास्क की जांच करें।
    3. मल्टीलेयर फ्लास्क को एक लामिनर फ्लो हुड में रखें और फ्लास्क से खर्च किए गए माध्यम को डालकर फेंक दें। प्रारंभ में, फ्लास्क को झुकाएं ताकि माध्यम एयर डैम पर अपशिष्ट कंटेनर में डाल रहा हो। डालते समय, फ्लास्क को 180 डिग्री तक घुमाएं जब तक कि माध्यम फ्लास्क की कोण वाली गर्दन से नीचे न बह रहा हो। किसी भी शेष तरल को खत्म करने के लिए फ्लास्क को इस अक्ष के साथ आगे और पीछे घुमाएं।
    4. कोणवाली गर्दन के नीचे धीरे-धीरे 100 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड बाँझ पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को धोएं। फ्लास्क को कैप करें, पीबीएस के समान वितरण की अनुमति देने के लिए इसे अपनी तरफ रखें, और फ्लास्क को कोशिकाओं को धोने के लिए वापस और आगे घुमाएं।
    5. पीबीएस वॉश को 3.2.3 के समान तरीके से छोड़ दें। धोने के चरणों को दोहराएं।
    6. प्रीवार्म्ड बाँझ पीबीएस के 50 एमएल में प्रीवार्म्ड ट्रिप्सिन के 50 एमएल को पतला करें। मल्टीलेयर फ्लास्क, कैप में 100 एमएल पतला ट्रिप्सिन घोल जोड़ें, और ट्रिप्सिन के समान वितरण की अनुमति देने के लिए फ्लास्क को इसके किनारे रखें। यदि सेल लाइन अत्यधिक अनुयायी है, तो 100 एमएल अघुलनशील ट्रिप्सिन का उपयोग करें।
    7. माइक्रोस्कोप के तहत सेल डिटेचमेंट की निगरानी करते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और 95% आर्द्रता पर फ्लास्क को2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। यदि आवश्यक हो, तो टुकड़ी की सहायता के लिए फ्लास्क को मजबूती से टैप करें या इसे एक और मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    8. मल्टीलेयर फ्लास्क को एक लामिनर फ्लो हुड में रखें और 100 एमएल विकास माध्यम के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें। फ्लास्क को कैप करें, इसे इसके किनारे पर रखें, और पूर्ण न्यूट्रलाइजेशन सुनिश्चित करने के लिए पीछे और आगे की ओर चलें।
    9. न्यूट्रलाइज्ड सेल सस्पेंशन को 4 x 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें।
      नोट: यदि पूर्ण सेल फसल की आवश्यकता है, तो मल्टीलेयर फ्लास्क को 100 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ फिर से धोएं और इसे 2 x 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें।
    10. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 3-4 मिनट के लिए 340 × ग्राम पर 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लामिनर फ्लो हुड में वापस करें और प्रत्येक गोली से जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
      नोट: गोली बड़ी और अपेक्षाकृत ढीली होगी और इसलिए, आसानी से बाधित किया जा सकता है।
    12. प्रत्येक गोली में 1-5 मिलीलीटर वृद्धि माध्यम जोड़ें और इसे कई बार ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से निलंबित करें।
    13. एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 4 पुन: निलंबित छर्रों को एक साथ पूल करें, उन्हें पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं, और कुल मात्रा नोट करें।
    14. सेल गिनती के लिए सेल निलंबन का एक उपयुक्त कमजोर पड़ने का प्रयास करें ताकि हेमोसाइटोमीटर पर प्रत्येक बाहरी वर्ग में 30-100 कोशिकाएं हों।
      नोट: एक उपयुक्त प्रारंभिक कमजोर पड़ने 1: 100 है; इसके लिए, सेल सस्पेंशन के पिपेट 10 μL को एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें और इसे बाँझ पीबीएस के 990 μL के साथ पतला करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए मिश्रण को कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    15. गिनती करते समय इनक्यूबेटर में सेल स्टॉक युक्त 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
    16. एक साफ हेमोसाइटोमीटर लेते हुए, ग्रिड पर एक साफ कवरस्लिप रखें, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
    17. हेमोसाइटोमीटर कक्ष में पतला सेल निलंबन का पिपेट 10 μL। यदि सभी 10 μL वितरित होने से पहले कक्ष भर जाता है, तो पाइपिंग बंद कर दें।
    18. हेमोसाइटोमीटर को प्रकाश माइक्रोस्कोप के 4x उद्देश्य के तहत रखें। कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए मोटे और ठीक फोकस को समायोजित करें।
    19. कक्ष के चार बाहरी कोने वर्गों में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें जैसा कि चित्र 2 में हाइलाइट किया गया है। प्रति वर्ग औसत कोशिकाओं की गणना करने के लिए चार गणनाएं जोड़ें और 4 से विभाजित करें।

Figure 2
चित्रा 2: हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती। कवरस्लिप के नीचे हेमोसाइटोमीटर में दस माइक्रोलीटर सेल निलंबन जोड़ा जाता है। कक्ष को तब माइक्रोस्कोप के 4x उद्देश्य लेंस के तहत रखा जाता है, और ग्रिड के चार बाहरी कोनों में कोशिकाओं की संख्या गिनी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. औसत गणना को तनुकरण कारक (जैसे, 100) से गुणा करें और समीकरण (2) का उपयोग करके प्रति एमएल कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए इस संख्या को 10,000 से गुणा करें।
    Equation 3 (2)
  2. सेल स्टॉक की कुल मात्रा से गुणा करके स्टॉक समाधान में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें (उदाहरण के लिए, यदि 4 पुन: निलंबित छर्रों ने 20 एमएल समाधान बनाया, तो कोशिकाओं / एमएल को 20 से गुणा करें)।
  3. मल्टीलेयर फ्लास्क को बनाए रखने के लिए, चरण 3.1.2 में उल्लिखित समीकरण (1) का उपयोग 1 ×10 7 कोशिकाओं को फ्लास्क में वापस बीज ने के लिए आवश्यक सेल स्टॉक की मात्रा की गणना करने के लिए करें और फ्लास्क को फिर से बीज देने के लिए चरण 3.1.3-3.1.6 करें। यदि मचानों को बीज देने के लिए तैयार हैं, तो अगले खंड पर आगे बढ़ें।

4. मचानों पर बीज न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाएं

  1. स्टॉक सेल सस्पेंशन तैयार करें
    नोट: यह प्रोटोकॉल प्रत्येक घनत्व के बीच 2 के गुणन कारक के साथ न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के चार अलग-अलग सीडिंग घनत्व बनाने के लिए चरणों की रूपरेखा तैयार करेगा। इसलिए स्टॉक सस्पेंशन से तीन और सेल सस्पेंशन बनाने के लिए एक सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग किया जाएगा। बाँझपन बनाए रखने के लिए सेल कल्चर का काम एक लामिनर फ्लो हुड में किया जाना चाहिए।
    1. पहली सीडिंग घनत्व या सेल स्टॉक निलंबन तैयार करने के लिए मल्टीलेयर फ्लास्क (खंड 3.2.19 में गिना गया) में कोशिकाओं की कुल संख्या से आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा की गणना करने के लिए समीकरण (3) का उपयोग करें।
      Equation 4(3)
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि 30 मचानों के लिए आवश्यक अधिकतम सीडिंग घनत्व 6 × 10 5 सेल प्रति मचान है, जिसमें प्रत्येक मचान को 20 μL सेल निलंबन प्राप्त होता है, तो स्टॉक सेल निलंबन को 600 μL (20 μL × 30 मचानों) की कुल मात्रा में 1.8 × 107 कोशिकाओं (6 × 105 कोशिकाओं × 30 मचानों) की आवश्यकता होगी।
      जैसा कि इस तैयारी से एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन किया जाएगा, इन संख्याओं को दोगुना किया जाना चाहिए, यानी, 1200 μL की कुल मात्रा में 3.6 × 107 कोशिकाएं। इसे प्रति एमएल कोशिकाओं में वांछित में परिवर्तित करने के लिए; 3.6 × 107 को 1200 μL से विभाजित करें और 1000 μL से गुणा करें, जिससे प्रति mL 3 × 107 सेल मिलते हैं।
      ​Equation 5
    2. सेल स्टॉक की आवश्यक मात्रा को बाँझ 2 एमएल या 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और विकास माध्यम के साथ 1200 μL की अंतिम मात्रा में लाएं। इस ट्यूब को घनत्व 1 (चित्रा 3) के रूप में लेबल करें।
  2. एकाधिक सीडिंग घनत्व सेल सस्पेंशन बनाने के लिए सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    1. चरण 4.1.1 में तैयार घनत्व 1 से, चित्रा 3 के अनुसार सीरियल कमजोर पड़ने के माध्यम से सेल निलंबन के तीन और घनत्व तैयार करें।
    2. विकास माध्यम में प्रत्येक घनत्व को 2 के कारक से पतला करें। सबसे पहले, तीन बाँझ 2 एमएल या 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विकास माध्यम की आवश्यक अंतिम मात्रा (पिछले उदाहरण से 600 μL) जोड़ें।
    3. घनत्व 1 (600 μL) के आधे हिस्से को ट्यूबों में से एक में स्थानांतरित करें, सेल निलंबन को पतला करने के लिए माध्यम के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। इस ट्यूब को घनत्व 2 के रूप में लेबल करें।
    4. घनत्व 2 (600 μL) के आधे हिस्से को अगली ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेल निलंबन को पतला करने के लिए माध्यम के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। इस ट्यूब को घनत्व 3 के रूप में लेबल करें।
    5. घनत्व 3 (600 μL) के आधे हिस्से को अगली ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेल निलंबन को पतला करने के लिए माध्यम के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। इस ट्यूब को घनत्व 4 के रूप में लेबल करें।
    6. घनत्व 4 से 600 μL को छोड़ दें ताकि सभी चार तैयारियों में 600 μL की अंतिम मात्रा हो।
    7. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 600 μL विकास माध्यम को केवल बाँझ 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। सीरियल कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 3 देखें।

Figure 3
चित्रा 3: 4 अलग-अलग पाड़ सीडिंग घनत्व के लिए 4 निलंबन तैयार करने के लिए सेल स्टॉक का क्रमिक कमजोर पड़ना। (ए) संख्याओं को प्रति मचान वांछित सीडिंग घनत्व के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है और (बी) प्रति घनत्व मचानों की कुल संख्या के लिए गुणा किया जा सकता है, जिसमें प्रत्येक मचान को 20 μL सेल निलंबन प्राप्त होता है। इस उदाहरण में, घनत्व 1 को प्रति मचान 6 × 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जो 30 मचानों के लिए 600 μL में 1.8 ×10 7 कोशिकाओं के बराबर है। सीरियल कमजोर पड़ने की शुरुआत करने के लिए इस संख्या को दोगुना कर दिया जाता है, क्योंकि 600 μL को फिर स्थानांतरित किया जाता है और अगली ट्यूब में 600 μL विकास माध्यम में पतला किया जाता है। यह प्रक्रिया तब तक जारी रहती है जब तक कि प्रत्येक के बीच 2 के कारक के साथ 4 सेल निलंबन न हों। एक नकारात्मक नियंत्रण केवल एक ट्यूब में 600 μL माध्यम जोड़कर बनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. मचानों में सेल निलंबन जोड़ना।
    नोट: रेफ्रिजरेटर से मचानों (पीबीएस में संग्रहीत) को हटा दें और कोशिकाओं को जोड़ने से पहले उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर आने की अनुमति दें।
    1. पीबीएस में मचानों को लामिनर प्रवाह हुड में लाएं।
    2. बाँझ चिमटी का उपयोग करके, मचानों को गैर-अनुयायी 24-वेल प्लेटों में प्रति कुएं एक मचान के साथ रखें (चित्र 1 सी)। धीरे से मचानों को उनके कोनों से उठाएं और अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए कंटेनर के किनारे पर उन्हें हल्के से दबाएं। कुओं के केंद्र में मचानों को त्वचा के बगल में रखें (मचान की चमकदार परत की तरफ, प्लास्टिक 24-वेल प्लेटों में नीचे की ओर)।
    3. सेल लाइन, प्रासंगिक मापदंडों (जैसे, सीडिंग घनत्व), और समय बिंदुओं के विवरण के साथ 24-वेल प्लेटों को लेबल करें। एक समय में एक सेल सीडिंग घनत्व के साथ काम करें, शेष घनत्व को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में उपयोग के लिए तैयार रखें।
    4. लैमिनर फ्लो हुड में, प्रत्येक मचान के केंद्र में 20 μL प्रासंगिक सेल निलंबन को धीरे से जोड़ने के लिए एक P20 पिपेट और बाँझ युक्तियों का उपयोग करें (चित्रा 1 डी)। मचानों में कोशिकाओं को जोड़ते समय कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाकर कोशिकाओं को निलंबन में अच्छी तरह से रखें। सुनिश्चित करें कि निलंबन मचान के शीर्ष पर रहता है और कुएं के आधार पर स्लाइड नहीं करता है, क्योंकि यह मचान से सेल अटैचमेंट की अनुमति नहीं देगा।
    5. एक बार जब कोशिकाओं को जोड़ दिया जाता है, तो प्लेटों को 3-5 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता) के लिए इनक्यूबेट करें ताकि अधिकांश कोशिकाएं संलग्न हो सकें।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, धीरे-धीरे और धीरे से प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर पूर्व-गर्म विकास माध्यम जोड़ें (चित्रा 1 ई)। अधिक धीमी और नियंत्रित गति की अनुमति देने के लिए माध्यम को जोड़ने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें, मचानों के विस्थापन को रोकते हैं। यदि बहुत अधिक संख्या में मचानों के साथ काम कर रहे हैं, तो पिपेट गन के साथ 10 एमएल पिपेट का उपयोग 'ड्रॉप' और 'लो' पर सेट करें।
    7. रात भर 24-अच्छी प्लेटों को इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता)।
  2. मचानों पर कोशिकाओं का रखरखाव।
    1. सेल अटैचमेंट (दिन 1) के पहले 24 घंटे के बाद, बीज वाले मचानों को नए गैर-अनुयायी 24-वेल प्लेटों में स्थानांतरित करें, और 1-2 एमएल ताजा विकास माध्यम जोड़ें।
      नोट: यह कदम उन कोशिकाओं को हटा देता है जो मचानों पर बढ़ने की अनुमति देने के बजाय प्लास्टिक 24-वेल प्लेटों के तल पर गिर गए हैं। दिन 1 के रूप में नामित मचान प्रतिकृतियों को 24 घंटे के बाद हटा दिया जाएगा, जैसा कि धारा 5 में चर्चा की गई है; इसलिए, रखरखाव इन मचानों पर लागू नहीं होता है।
    2. विकास माध्यम के रंग में परिवर्तन के लिए शुरू में हर 2-3 दिनों में मचानों की निगरानी करें। जैसे-जैसे समय बढ़ता है और मचानों के भीतर कोशिकाएं बढ़ती हैं, कोशिकाओं को अधिक बार खिलाते हैं।
    3. धीमी गति से मोड पर 10 एमएल पिपेट गन का उपयोग करके, खर्च किए गए माध्यम के 1 एमएल को हटा दें और फेंक दें। यदि वातानुकूलित माध्यम की आवश्यकता वाले प्रयोगों को पूरा किया जाता है, तो 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जैविक प्रतिकृति के खर्च किए गए माध्यम को इकट्ठा करें, सेलुलर मलबे को पेलेट करने के लिए 2 मिनट के लिए 340 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. धीरे से पिपेट पर फिर से ड्रिप फ़ंक्शन का उपयोग करके मचानों में 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड ग्रोथ मीडियम जोड़ें, और 24-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता) में वापस कर दें। जब भी वांछित विकास अवधि की अवधि के लिए माध्यम खर्च किया जाता है तो दोहराएं।

5. पाड़ पुनर्प्राप्ति और अनुप्रयोग

नोट: प्रत्येक समय बिंदु पर, मचानों पर सेल वृद्धि की निगरानी करने या जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का आकलन करने के लिए कई अनुप्रयोगों का उपयोग किया जा सकता है। पाड़ पुनर्प्राप्ति की स्थिति किए जाने वाले विश्लेषण पर निर्भर करेगी, जिसमें निम्नलिखित उपखंडों में उल्लिखित कई पुनर्प्राप्ति विधियां हैं और चित्रा 4 में प्रदर्शित की गई हैं।

  1. मचानों के भीतर सेल व्यवहार्यता का आकलन।
    1. लामिनर प्रवाह हुड में सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.2 μm बाँझ फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करके उचित सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक को निष्फल करें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्ण विकास माध्यम और बाँझ पीबीएस के साथ इस बाँझ समाधान को गर्म करें।
    2. लैमिनर फ्लो हुड में, बाँझ चिमटी का उपयोग करके मचानों को एक ताजा 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है। प्लेट को सभी प्रासंगिक विवरणों के साथ लेबल करें।
      नोट: तीन प्रतियों में विश्लेषण करें।
    3. प्रत्येक कुएं में 900 μL प्रीवार्म्ड ग्रोथ मीडियम जोड़ें, इसके बाद बाँझ सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के 100 μL हों। बिना मचान वाले कुएं में 900 μL मध्यम और 100 μL बाँझ सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। प्लेट पर ढक्कन को बदलें, और धीरे से प्लेट को ~ 3 मिनट के लिए हिलाएं ताकि पूरे कुएं में पतला सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक समान रूप से वितरित किया जा सके। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक सेल लाइन के लिए इनक्यूबेशन समय अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी; निर्माता के दिशानिर्देशों का संदर्भ लें। न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों के लिए, 4-6 घंटे इनक्यूबेशन इष्टतम दिखाई देता है।
    4. इनक्यूबेशन बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और धीरे से कुछ सेकंड के लिए हिलाएं।
    5. लैमिनर फ्लो हुड में, एक नई, पारभासी 96-वेल प्लेट खोलें। 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से, इनक्यूबेट किए गए माध्यम और अभिकर्मक को 100 μL प्रति कुएं के साथ 96-वेल प्लेट के तीन कुओं में स्थानांतरित करें, जिससे तकनीकी तीन प्रतियाँ मिलती हैं।
      नोट: यह स्थानांतरण 24-वेल प्लेट के कुओं में 700 μL छोड़ देगा।
    6. सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में 96-वेल प्लेट को कवर करें।
    7. 24-वेल प्लेट में प्रत्येक मचान से शेष 700 μL कुएं की सामग्री को निकालें और फेंक दें। प्रत्येक मचान को 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
      नोट: मचानों से सभी रंग नहीं हटाए जाएंगे। इन मचानों का उपयोग आगे के अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, डीएनए परिमाणीकरण, उन्हें 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO3) समाधान में 1% ट्राइटन एक्स -100 के 1 मिलीलीटर में रखकर और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करके (अनुभाग 5.2, चित्रा 4 बी देखें)।
    8. लैमिनर फ्लो हुड से 96-वेल प्लेट को निकालें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 570 एनएम और 600 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को मापें। दोनों तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण मूल्यों को रिकॉर्ड करें और कोशिकाओं द्वारा सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के प्रतिशत में कमी की गणना करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    9. उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता परिणामों को ग्राफ और सांख्यिकीय विश्लेषण करें। त्रुटि पट्टियों का उत्पादन करने और परख परिवर्तनशीलता को इंगित करने के लिए जैविक तीन प्रतियों को इनपुट करें।
    10. प्रयोगात्मक समय सीमा में सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन की जांच करने के लिए, उपयुक्त बायोस्टैटिस्टिकल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके साधनों की कई तुलनाओं के साथ विचरण (एनोवा) परीक्षण का एक-तरफा विश्लेषण करें।
    11. ग्राफ़ पर समय बिंदुओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करें जैसे ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001), और **** (P≤0.0001)।

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्येक समय बिंदु पर विभिन्न विश्लेषणों के लिए मचानों की पुनर्प्राप्ति। (ए) सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए तीन पाड़ प्रतिकृतियां प्राप्त की जाती हैं। (बी) इन मचानों को पीबीएस में धोया जा सकता है, 0.1 एम एनएएचसीओ3 में 1% ट्राइटन एक्स -100 में रखा जा सकता है, और डीएनए परिमाणीकरण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। (सी) 15 मिनट के लिए 10% पीएफए में तीन और प्रतिकृतियां तय की जाती हैं, पीबीएस में बेअसर की जाती हैं, और हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन और इमेजिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। (डी) अंत में, 3 प्रतिकृतियों को फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित सेल लाइसिस अभिकर्मक में जोड़ा जाता है और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. मचानों में कोशिकाओं से डीएनए का परिमाणीकरण।
    नोट: जैसा कि चरण 5.1.7 के बाद नोट में उल्लेख किया गया है, डीएनए परिमाणीकरण के लिए मचानों की पुनर्प्राप्ति में मचानों को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखना शामिल है, जिसमें 0.1 एम एनएएचसीओ3 समाधान में 1% ट्राइटन एक्स -100 का 1 एमएल होता है, इसके बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण होता है। डीएनए विश्लेषण किए जाने से पहले, कोशिकाओं को न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं को उचित रूप से व्यवस्थित करने और मात्रा निर्धारण के लिए डीएनए जारी करने के लिए तीन फ्रीज-पिघलना चक्रों से गुजरना होगा।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस से ट्राइटन एक्स -100 में पहले संग्रहीत नमूने निकालें। नमूने को आरटी पर 1-3 घंटे के लिए या पिघलने तक छोड़ दें।
    2. 10-20 सेकंड के लिए नमूने को भंवर करें, और नमूने को 18-24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या पूरी तरह से जमे होने तक वापस रखें। कुल तीन फ्रीज-पिघलाव चक्रों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. डीएनए उपज को अधिकतम करने के लिए, मचानों में कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक ऊतक लिस्टर का उपयोग करें।
      1. ट्राइटन एक्स -100 में एक मचान युक्त 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक धातु मोती रखें, और 2-3 मिनट के लिए नमूने को 50 दोलनों / सेकंड पर हिलाने के लिए एडाप्टर के भीतर ट्यूब रखें।
        नोट: गोल-तल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करें क्योंकि धातु मोती एक पतली-नीचे ट्यूब में दर्ज हो सकता है।
    4. फ्लोरोसेंट डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (डीएसडीएनए) दाग लगाकर ट्राइटन एक्स -100 समाधान में डीएनए की मात्रा निर्धारित करें और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके उत्सर्जन को मापें। निर्माता के दिशानिर्देशों का संदर्भ लें; टीई बफर में सीरियल कमजोर पड़ने के माध्यम से 8 डीएसडीएनए मानकों को तैयार करने के लिए ट्राइस-एथिलीनडायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (टीई) बफर में नमूनों को उचित रूप से पतला करें (चित्रा 5)।
    5. काले अपारदर्शी 96-वेल प्लेटों में, तकनीकी तीन प्रतियों में कुओं में प्रत्येक मानक या नमूने के 100 μL जोड़ें।
    6. टीई बफर में फ्लोरोसेंट डीएसडीएनए दाग को 200 गुना पतला करें और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक मानक / नमूने में 100 μL जोड़ें। प्लेट को टिनफॉइल में कवर करें और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    7. 520 एनएम पर प्रत्येक कुएं की प्रतिदीप्ति को मापें और रिकॉर्ड करें। प्रत्येक नमूने में डीएनए की एकाग्रता की गणना करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें।
      नोट: यदि प्रति सेल डीएनए की औसत एकाग्रता का उपयोग सेल लाइन के लिए जाना जाता है, तो डीएनए एकाग्रता मूल्यों को समीकरण (4) का उपयोग करके सेल संख्याओं में परिवर्तित किया जा सकता है।
      Equation 6(4)
    8. उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डीएनए परिमाणीकरण परिणामों को ग्राफ और सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण करें। त्रुटि पट्टियों का उत्पादन करने और परख परिवर्तनशीलता को इंगित करने के लिए जैविक तीन प्रतियों को इनपुट करें।
    9. प्रयोगात्मक समय सीमा में डीएनए एकाग्रता / सेल संख्याओं में परिवर्तन की जांच करने के लिए, उपयुक्त बायोस्टैटिस्टिकल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके साधनों की कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण करें।
    10. ग्राफ़ पर समय बिंदुओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करें जैसे ns (P>0.05), * (P≤0.05), ** (P≤0.01), *** (P≤0.001), और **** (P≤0.0001)।

Figure 5
चित्रा 5: एक मानक वक्र की पीढ़ी के लिए आठ डीएनए मानकों की तैयारी। 100 μg / mL पर 3DNA का एक स्टॉक समाधान प्रदान किया जाता है। इसे 2000 एनजी / एमएल पर मानक ए बनाने के लिए टीई बफर में 50 गुना पतला किया जाता है; ए के 400 μL को फिर ट्यूब बी में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें 400 μL TE बफर होता है; 400 μL B को तब C में 2 गुना स्थानांतरित और पतला किया जाता है, और इसी तरह जब तक G मानक H केवल TE बफर से बना होता है और इसलिए इसमें 0 ng/mL की डीएनए सांद्रता होती है। संक्षिप्त नाम: टीई = ट्रिस-ईडीटीए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन के लिए मचानों की तैयारी
    नोट: मचानों को माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग उद्देश्यों के लिए या तो इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के लिए पूरे मचानों के रूप में या हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के लिए फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइस के रूप में तय और दाग दिया जा सकता है। यह मचानों के भीतर सेल प्रवेश और वितरण के गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है और इसका उपयोग प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
    1. पीबीएस में 10% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि 500 μL प्रति मचान की अंतिम मात्रा के लिए पर्याप्त समाधान है।
    2. इस घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और पाड़ पुनर्प्राप्ति के लिए 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल करने के लिए 500 μL जोड़ें।
    3. गैर-अनुगामी 24-वेल प्लेटों (चरण 4.4.4) से मचानों को हटा दें और उन्हें लामिनर प्रवाह हुड में रखें।
    4. बाँझ चिमटी का उपयोग करके, मचानों को 10% पीएफए युक्त लेबल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। मचानों को 15 मिनट के लिए पीएफए समाधान में ठीक करने की अनुमति दें। प्रत्येक ट्यूब में 500 μL PBS जोड़कर PFA को बेअसर करें और 4 °C पर स्टोर करें।
    5. स्वचालित ऊतक प्रोसेसर के लिए मचान तैयार करने के लिए, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और उन्हें पेंसिल में सभी प्रासंगिक विवरणों के साथ लेबल किए गए प्लास्टिक कैसेट में रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें। ऊतक प्रोसेसर के धातु कंटेनर में सभी कैसेट रखें।
    6. ऊतक प्रोसेसर पर 12-चरण प्रोटोकॉल शुरू करें ताकि मचानों को ठीक किया जा सके, निर्जलित किया जा सके, साफ किया जा सके, और उन्हें रात भर पैराफिन के साथ घुसपैठ किया जा सके। संसाधित नमूने वाले कैसेट एकत्र करें।
    7. इसके बाद, मचानों को पैराफिन मोम ब्लॉकों में एम्बेड करें ताकि मचानों के माइक्रोटॉमी को धुंधला होने के लिए बहुत पतली स्लाइस में अनुमति मिल सके।
      नोट: कैसेट से उन्हें हटाते समय मचानों के अभिविन्यास पर विचार करना और उन्हें मोम में एम्बेड करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उस कोण को प्रभावित करेगा जिस पर चित्र लिए जाते हैं। मचानों में सेल घुसपैठ का आकलन करते समय यह महत्वपूर्ण है।
    8. मोम एम्बेडर और ठंडी प्लेट चालू करें; मोम के स्तर की जांच करने के लिए ढक्कन उठाएं। यदि आवश्यक हो तो रिफिल करें।
    9. एक समय में एक नमूने के साथ काम करते हुए, कैसेट खोलें, मचान को हटा दें, और इसे प्लास्टिक मोल्ड में केंद्रित करें।
    10. नमूने पर गर्म मोम डालें, यह सुनिश्चित करें कि सही अभिविन्यास बनाए रखा गया है और यदि आवश्यक हो, तो मोम के जमने से पहले गर्म चिमटी के साथ समायोजित करें। मोल्ड को भरने के लिए अधिक मोम डालें।
    11. प्लास्टिक मोल्ड के शीर्ष पर लेबल किए गए कैसेट ढक्कन रखें और शीर्ष पर मोम जोड़ें। मोम को ठोस बनाने के लिए मोल्ड को ठंडी प्लेट पर रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पैराफिन मोम माइक्रोटॉमी से पहले पूरी तरह से जम गया है, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
    12. माइक्रोटॉमी की तैयारी के लिए, 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान, सुखाने की प्लेट और माइक्रोटोम चालू करें।
    13. धारक में एक ब्लेड डालें और इसे सुरक्षित करने के लिए लीवर को कस लें।
    14. ट्रिम और अनुभाग मोटाई सेट करें, आम तौर पर मचान अनुभागों के लिए 5 मिमी।
    15. मोल्ड से एफएफपीई मचान को हटा दें, इसे माइक्रोटोम के सामने धारक में सुरक्षित करें, और वर्गों को काटने से पहले नमूने के किनारों के चारों ओर अतिरिक्त मोम को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें।
    16. चिकनी गति सुनिश्चित करते हुए, माइक्रोटोम के लीवर को घुमाकर मोम ब्लॉक में काटना शुरू करें।
    17. रिबन जैसे वर्गों को इकट्ठा करें, एक समय में लगभग 3 पाड़ खंड, और झुर्रियों को हटाने के लिए उन्हें धीरे से 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। चिमटी का उपयोग करके पानी के स्नान में धीरे से अनुभागों को अलग करें।
    18. पॉलीसिन-लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके, प्रत्येक खंड को पानी के स्नान से उठाएं ताकि अनुभाग स्लाइड के केंद्र में बैठे। प्रत्येक स्लाइड को पेंसिल से लेबल करें.
    19. कांच की स्लाइड को सुखाने की प्लेट पर या 60 डिग्री सेल्सियस सुखाने वाले ओवन में रखें। एक बार सूखजाने के बाद, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आवश्यक हिस्टोलॉजिकल या आईएचसी दाग के साथ आगे बढ़ें।
  2. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मचानों की पुनर्प्राप्ति।
    1. इनक्यूबेटर (चरण 4.4.4) से गैर-अनुयायी 24-वेल प्लेटों से मचानों को हटा दें और उन्हें लामिनर प्रवाह हुड में रखें।
    2. बाँझ चिमटी का उपयोग करके, मचानों को ताजा लेबल वाले 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. फ्यूम हुड में, मचानों में कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की वसूली की अनुमति देने के लिए प्रत्येक ट्यूब में फिनोल / गुआनिडाइन-आधारित सेल लाइसिस अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. उपयुक्त किट का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करें। एक मानक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) 17 का उपयोग करके, मचानों में कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करें।

Representative Results

यहां वर्णित कोलेजन-आधारित पाड़ मॉडल में न्यूरोब्लास्टोमा जीव विज्ञान का अध्ययन करने से लेकर एक ऐसे वातावरण में एंटीकैंसर चिकित्सीय की स्क्रीनिंग तक कई अनुप्रयोग हैं जो पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में देशी ट्यूमर के समान शारीरिक रूप से समान है। किसी दिए गए शोध प्रश्न का परीक्षण करने से पहले, वांछित प्रयोगात्मक समय सीमा के भीतर सेल लगाव, प्रसार और घुसपैठ का पूर्ण लक्षण वर्णन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। विकास की स्थिति प्रत्येक विशिष्ट सेल लाइन के जीव विज्ञान पर निर्भर करेगी। महत्वपूर्ण रूप से, इष्टतम परिस्थितियों और मजबूत प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए सेल विकास मूल्यांकन के कई तरीकों को लागू किया जाना चाहिए।

यहां, मचानों पर उगाए गए न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन एक रंगीन सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके किया गया था। इस परख को प्रयोगात्मक समय सीमा के दौरान वांछित रूप से अक्सर किया जा सकता है। वर्णित प्रयोग के लिए, सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन दो न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों, केलीलुक और आईएमआर 32 के लिए दिन 1, 7 और 14 पर किया गया था, जो 4 अलग-अलग घनत्वों पर कोल-आई-एनएचए मचानों पर उगाया गया था (चित्रा 6)। दिन 1 पर व्यवहार्यता को बाद के सभी मापों की तुलना करने के लिए एक आधार रेखा के रूप में सेट किया गया था। सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक की कमी की दर सेल जीव विज्ञान और व्यक्तिगत सेल लाइनों की विकास विशेषताओं को प्रतिबिंबित करती है, जिसमें उनकी प्रसार दर और चयापचय शामिल हैं। मचानों पर बीजित कोशिकाओं की संख्या और कमी के स्तर के बीच एक सहसंबंध की उम्मीद की गई थी। इस प्रयोग में, सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक की कमी आम तौर पर सभी घनत्वों पर दोनों सेल लाइनों के लिए प्रत्येक समय बिंदु के साथ बढ़ जाती है, जैसा कि अपेक्षित है।

प्रत्येक घनत्व को तब दोनों सेल लाइनों के लिए व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था ताकि समय बिंदुओं में कमी की तुलना की जा सके। समय बिंदुओं के बीच कमी में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा किया गया था (चित्रा 7)। सेल लाइनों और सभी सीडिंग घनत्व दोनों के लिए, दिन 1 और दिन 14 की तुलना करते समय सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक की कमी में उल्लेखनीय वृद्धि (पी <0.05) थी। इसने मचानों पर मौजूद चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि का संकेत दिया। 7-दिवसीय अंतराल (दिन 1 बनाम दिन 7, दिन 7 बनाम दिन 14) का आकलन करते समय यह वृद्धि सभी मामलों में महत्वपूर्ण नहीं थी, जो वांछित विकास विंडो को प्राप्त करने के लिए सीडिंग घनत्व के अनुकूलन के महत्व को दर्शाती है।

सेल व्यवहार्यता परख के परिणामों का समर्थन करने के लिए, मचानों पर सेल वृद्धि को अप्रत्यक्ष रूप से फ्लोरोसेंट डीएसडीएनए दाग (चित्रा 8 ए) का उपयोग करके मचानों से निकाले गए डीएसडीएनए की मात्रा का ठहराव के माध्यम से भी मापा जा सकता है। सेल व्यवहार्यता की तरह, प्रयोगात्मक समयरेखा के भीतर डीएनए का परिमाणीकरण जितनी बार वांछित हो उतना किया जा सकता है। हालांकि, इस विश्लेषण के लिए मचानों की पूर्ण पुनर्प्राप्ति और सेल विकास की समाप्ति की आवश्यकता होती है और इसलिए इसे प्रयोगात्मक योजना में शामिल किया जाना चाहिए जैसा कि खंड 1 में चर्चा की गई है। इस प्रयोग के लिए, डीएनए को दो न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों, केलील्यूक और आईएमआर 32 के लिए 1, 7 और 14 दिनों में परिमाणित किया गया था, जो 4 अलग-अलग घनत्वों पर कोल-आई-एनएचए मचानों पर उगाए गए थे। चूंकि इन सेल लाइनों के लिए प्रति सेल डीएसडीएनए की औसत एकाग्रता ज्ञात है, इसलिए मात्रात्मक डीएनए (चित्रा 8 बी) से प्रति नमूना कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करना संभव था।

डीएनए परिमाणीकरण ने सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन की तुलना में जैविक प्रतिकृति के बीच उच्च परिवर्तनशीलता को जन्म दिया, लेकिन आम तौर पर प्रत्येक समय बिंदु के लिए वृद्धि हुई, जिसमें 14 वें दिन उच्चतम स्तर निर्धारित किया गया। आईएमआर 32 कोशिकाएं केलीलुक कोशिकाओं की तुलना में डीएनए एकाग्रता द्वारा इंगित कोल-आई-एनएचए मचानों पर उच्च सेल संख्या तक पहुंचती हैं। प्रत्येक घनत्व को तब समय बिंदुओं में कमी की तुलना करने के लिए दो सेल लाइनों के लिए व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था। समय बिंदुओं (चित्रा 8 बी) के बीच कमी में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा किया गया था।

सेल लाइनों और सभी सीडिंग घनत्व दोनों के लिए, दिन 1 और दिन 14 की तुलना करते समय सेल संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि (पी < 0.05) थी, जिसमें केलीलुक के अपवाद के साथ सीडिंग घनत्व 4 (1 × 105 सेल / पाड़) था, जिसने किसी भी समय बिंदु में महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं की। सेल व्यवहार्यता परिणामों के समान, 7-दिवसीय अंतराल (दिन 1 बनाम दिन 7, दिन 7 बनाम दिन 14) का आकलन करते समय सभी मामलों में वृद्धि महत्वपूर्ण नहीं थी। सेल व्यवहार्यता और डीएनए परिमाणीकरण के लिए समय बिंदु रुझानों की तुलना करते समय, दोनों विश्लेषणों के बीच कुछ मामूली अंतर थे। हालांकि, समग्र समान रुझान देखे गए, अधिकांश घनत्वों के लिए 7-दिन के अंतराल के बीच औसत मान बढ़ रहे थे। यह एक से अधिक विधियों का उपयोग करके सेल विकास की निगरानी के महत्व को दर्शाता है।

मचानों पर कोशिका विकास आकृति विज्ञान और वितरण का एक दृश्य मूल्यांकन लागू किया गया था, जिसमें पारंपरिक हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने के साथ-साथ आईएचसी भी शामिल था। यह उम्मीद की जाती है कि अलग-अलग सेल लाइनों के विभिन्न विकास पैटर्न से मचानों पर विभिन्न स्थानिक व्यवस्था एं होंगी, जिसमें मचान और सेल क्लस्टरिंग में प्रवेश की विभिन्न डिग्री शामिल हैं। मचानों को फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड किया गया था, और 5 मिमी वर्गों (चित्रा 9 ए) में काटा गया था, जिससे हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग और आईएचसी सहित कई विज़ुअलाइज़ेशन तकनीकों के लिए मचानों को तैयार किया गया था।

नियमित एच एंड ई धुंधलापन केली, केलीसिस 83, और आईएमआर 32 कोशिकाओं पर लागू किया गया था जो कोलेजन-आधारित मचानों पर 1, 7 और 14 दिनों में विकसित हुए थे (चित्रा 9 बी)। इसने 14 दिनों की अवधि में दो कोलेजन-आधारित मचानों पर कोशिकाओं के स्थानिक अभिविन्यास के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी। सिस्प्लाटिन-संवेदनशील केली कोशिकाओं और प्रतिरोधी केलीसिस 83 कोशिकाओं को कोल-आई-एनएचए मचानों (चित्रा 9 बी, आई) और कॉल-आई-जीएजी मचानों (चित्रा 9 बी, ii) दोनों पर विकसित किया गया था। पहले प्रकाशित आंकड़ों के अनुरूप, केलीसिस 83 कोशिकाएं उच्च दर से बढ़ीं और कम आक्रामक केली सेल लाइन की तुलना में दोनों मचान रचनाओं में गहराई से घुसपैठ की। कोल-आई-एनएचए पर उगाए गए एक अन्य न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन, आईएमआर 32 का एच एंड ई दाग एक विपरीत विकास पैटर्न को दर्शाता है (चित्रा 9 बी, iii)। यह सेल लाइन 14 दिनों की अवधि में कोलेजन स्काफोल्ड्स पर बड़े, घनी आबादी वाले समूहों में बढ़ी। ब्राइटफील्ड कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोलेजन फाइबर के ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण कोलेजन-आधारित मचानों (चित्रा 9 सी) के छिद्रपूर्ण वास्तुकला की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

हमने प्रयोगात्मक समयरेखा के दौरान विशिष्ट सेल लक्षणों की निगरानी के लिए साइटोस्केलेटल एक्टिन और परमाणु काउंटरस्टेन, 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) को लक्षित करने वाले फैलोइडिन के साथ कोशिकाओं को दाग दिया। इस तकनीक का उपयोग करके कोल-आई-जीएजी मचानों पर केली और केलीसिस 83 कोशिकाओं में एक्टिन की बहुतायत देखी गई (चित्रा 9 डी)। इन परिणामों से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मचानों पर उगाए गए न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं से स्थानिक रूप से हल की गई जानकारी प्राप्त करने के लिए कई इमेजिंग तकनीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। एक निश्चित अवधि में कोलेजन-आधारित मचानों पर सेल विकास पैटर्न का यह लक्षण वर्णन किसी भी डाउनस्ट्रीम जैव रासायनिक परख की समझ और व्याख्या में सुधार करेगा।

कोलेजन-आधारित मचानों पर उगाई गई कोशिकाओं द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण विवो परिदृश्यों में सेलुलर गतिविधि की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। पहले प्रकाशित आंकड़ों ने सेल मोनोलेयर के साथ-साथ कोल-आई-एनएचए और कॉल-आई-जीएजी स्काफोल्ड्स (चित्रा 10) में विकसित केलीलुक और केलीसिस 83ल्यूक कोशिकाओं द्वारा न्यूरोब्लास्टोमा के सरोगेट स्रावित मार्कर के रूप में क्रोमोग्रानिन ए (सीजीए) की अभिव्यक्ति की जांच की। सीजीए का मूल्यांकन एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) (चित्रा 10 ए) का उपयोग करके वातानुकूलित मीडिया में किया गया था। सीजीए को केली (चित्रा 10 बी, सी) की तुलना में अधिक आक्रामक केमो-प्रतिरोधी केलीसिस 83 सेल लाइन में उच्च दर पर स्रावित किया जाता है। यह कोल-आई-जीएजी और कोल-आई-एनएचए स्काफोल्ड्स (पी<0.05) दोनों पर 7 वें दिन महत्वपूर्ण था, जबकि पारंपरिक 2 डी संस्कृति द्वारा मोनोलेयर के रूप में विकसित कोशिकाओं के लिए इस समय कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

ये परिणाम एक मोनोलेयर में कोशिकाओं को बढ़ने पर प्रतिबंधित प्रयोगात्मक समयरेखा को भी उजागर करते हैं, जिसमें कोशिकाओं के प्रवाह तक पहुंचने से पहले केवल 7 दिनों का विकास संभव साबित होता है। मचानों पर कोशिकाओं की वृद्धि इस सीमा को दूर करती है क्योंकि उन्हें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिस्थितियों में लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है। सेल व्यवहार्यता, डीएनए सामग्री, सेलुलर आकृति विज्ञान और स्थानिक व्यवस्था, और अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर जानकारी प्राप्त करने के लिए तकनीकों का उपरोक्त संयोजन कोलेजन-आधारित मचानों की एक श्रृंखला पर न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के विकास के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और वांछित अनुप्रयोगों को पूरा करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: सेल व्यवहार्यता विश्लेषण। (ए) एक वर्णमिति सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके कोलेजन-आधारित मचानों पर न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की व्यवहार्यता को मापने के लिए सामान्य प्रक्रिया। निर्माता के दिशानिर्देशों का उल्लेख करते हुए, प्रत्येक नई सेल लाइन के लिए इनक्यूबेशन अवधि को अनुकूलित किया जाना चाहिए। (ख) कोल-आई-एनएचए मचानों पर उगाए गए केलीलुक और आईएमआर32 कोशिकाओं द्वारा सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक में चार अलग-अलग प्रारंभिक सीडिंग घनत्वों पर उगाए गए सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक में प्रतिशत कमी, जिसे 1, 7 और 14 दिनों में मापा जाता है। नमूने जैविक तीन प्रतियों में मूल्यांकन किए गए थे, जिसमें मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियां थीं। संक्षेप: एनएचए = नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट; कोल-आई-एनएचए = कोलेजन स्काफोल्ड्स एनएचए के साथ पूरक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: 14 दिनों की अवधि में कोल-आई-एनएचए पर उगाई गई कोशिकाओं के लिए सीडिंग घनत्व द्वारा सेल व्यवहार्यता। (ए) केलील्यूक; (ख) आईएमआर 32। शीर्षक सेल नंबर दिन 0 पर मचानों पर प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व को संदर्भित करता है। नमूनों का मूल्यांकन जैविक तीन प्रतियों में किया गया था, जो तीन प्रतियों द्वारा इंगित किया गया था, जिसमें सलाखों ने माध्य का प्रतिनिधित्व किया था। एकाधिक तुलनाओं के साथ वन-वे एनोवा का उपयोग तीन समय बिंदुओं में % सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक कमी में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए किया गया था, जो ग्राफ (एनएस पी > 0.05, * पी ≤ 0.05, ** पी ≤ 0.01, *** पी ≤ 0.001, **** पी ≤ 0.0001) पर नोट किया गया था। संक्षेप: एनएचए = नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट; कोल-आई-एनएचए = कोलेजन स्काफोल्ड्स एनएचए के साथ पूरक; एनोवा = विचरण का विश्लेषण; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: मचानों में कोशिकाओं से निकाले गए डीएनए का परिमाणीकरण । (ए) फ्लोरोसेंट डीएसडीएनए दाग का उपयोग करके कोलेजन-आधारित मचानों पर उगाई गई कोशिकाओं से डीएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने की प्रक्रिया। (बी) 14 दिनों की अवधि में कोल-आई-एनएचए पर उगाए गए केलील्यूक और आईएमआर 32 कोशिकाओं के लिए सीडिंग घनत्व द्वारा डीएनए परिमाणीकरण विश्लेषण से सेल संख्या। शीर्षक सेल नंबर 0 दिन पर मचानों पर प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व को संदर्भित करता है। नमूनों का मूल्यांकन जैविक तीन प्रतियों में किया गया था, जो तीन प्रतियों द्वारा इंगित किया गया था, जिसमें सलाखों ने माध्य का प्रतिनिधित्व किया था। एकाधिक तुलनाओं के साथ वन-वे एनोवा का उपयोग तीन समय बिंदुओं में सेल संख्याओं में महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए किया गया था, जो ग्राफ (एनएस पी > 0.05, * पी ≤ 0.05, ** पी ≤ 0.01, *** पी ≤ 0.001, **** पी ≤ 0.0001) पर नोट किया गया था। संक्षेप: एनएचए = नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट; कोल-आई-एनएचए = कोलेजन स्काफोल्ड्स एनएचए के साथ पूरक; डीएसडीएनए = डबल-फंसे डीएनए; टीई = ट्रिस-ईडीटीए; एनोवा = विचरण का विश्लेषण; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: मचानों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण के लिए ऊतक प्रसंस्करण चरण। (ए) छवि विश्लेषण के लिए मचानों को संसाधित करने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह प्रक्रिया प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंटली लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके नियमित हिस्टोलॉजिकल धुंधला और विशिष्ट एंटीबॉडी जांच की अनुमति देती है। (बी) एच एंड ई धुंधला होने के अधीन तीन न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों की प्रतिनिधि छवियां। प्रयोग के समय के दौरान विकास पैटर्न की निगरानी के लिए दिन 1, 7, 14 पर एच एंड ई छवियां ली जाती हैं। स्केल बार = 200 μm। डैश्ड वर्ग उस क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे निचले बाएं किनारे पर 20x छवियों में ज़ूम-इन के लिए चुना गया था। स्केल बार = 20 μm. (i और ii) दो प्रकार के कोलेजन-आधारित मचानों पर केली और केलीसिस 83 न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों (क्रमशः ऊपरी और निचले पैनलों) के H & E। (iii) आईएमआर 32 सेल लाइन का एच एंड ई, जो कोल-आई-एनएचए पाड़ पर क्लस्टर सेलुलर विकास का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) ब्राइटफील्ड कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के अधीन केली सेल लाइन की प्रतिनिधि छवि। कोलेजन ऑटोफ्लोरेसेंस छिद्रपूर्ण मचान के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। 10x स्केल बार = 200 μm, 20x स्केल बार = 20 μm. (D) एम्बेडेड मचानों की प्रतिनिधि छवि जिसके बाद IHC द्वारा 10x आवर्धन पर फेलोइडिन और DAPI के साथ विश्लेषण, स्केल बार = 200 μm. छोटे अंदर के वर्ग ज़ूम-इन छवियों (20x), स्केल बार = 20 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: एनएचए = नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट; कोल-आई-एनएचए = कोलेजन स्काफोल्ड्स एनएचए के साथ पूरक; जीएजी = ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन; कोल-आई-जीएजी = कोलेजन स्काफोल्ड्स चोंड्रोइटिन -6-सल्फेट के साथ पूरक; एच एंड ई = हेमटोक्सीलिन और ईओसिन; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: 2 डी प्लास्टिक की तुलना में 3 डी कोलेजन-आधारित मचानों पर विकसित न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति। (ए) 2 डी प्लास्टिक या 3 डी कोलेजन आधारित मचानों पर उगाई गई कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया पर सीजीए एलिसा का प्रदर्शन कैसे किया गया था, इसका एक योजनाबद्ध। (बी) सीजीए प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर 2 डी प्लास्टिक मोनोलेयर पर उगाई गई कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से लिया गया है। चूंकि कोशिकाएं 7 दिनों के बाद कॉन्फ्लुएंसी तक पहुंच गईं, इसलिए 14-दिवसीय समय बिंदु पठनीय नहीं था। प्लास्टिक पर दिन 7 तक, केली और केलीसिस 83 सेल लाइनों के बीच सीजीए के स्तर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। (ग) सीजीए एलिसा ने लगातार 14 दिनों तक कोलेजन आधारित मचानों पर उगाई गई कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके प्रदर्शन किया। दिन 7 पर, दोनों कोलेजन मचानों पर, सीजीए का स्तर अधिक आक्रामक केलीसिस 83 सेल लाइन में अधिक होता है, जो 2 डी मोनोलेयर की तुलना में 3 डी मैट्रिक्स में सीजीए के अधिक शारीरिक प्रासंगिक स्तरों को उजागर करता है। इस आंकड़े को कर्टिन एट अल.17 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: 3 डी = तीन आयामी; 2 डी = दो आयामी; सीजीए = क्रोमोग्रानिन ए; एलिसा = एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख; एनएचए = नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट; कोल-आई-एनएचए = कोलेजन स्काफोल्ड्स एनएचए के साथ पूरक; जीएजी = ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन; कोल-आई-जीएजी = कोलेजन स्काफोल्ड्स चोंड्रोइटिन -6-सल्फेट के साथ पूरक; टीएमबी = 3,3',5,5'-टेट्रामिथाइलबेंज़िडाइन; एचआरपी = हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

3 डी पाड़-कैंसर सेल मॉडल को सरलीकृत टीएमई32 में न्यूरोब्लास्टोमा सेल विकास, व्यवहार्यता और कोशिकाओं की घुसपैठ में यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी उपकरण के रूप में साबित किया गया है। यहां वर्णित 3 डी न्यूरोब्लास्टोमा मॉडल न्यूनतम टीएमई की नकल करता है और 2 डी मोनोलेयर संस्कृति की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक डेटा प्रदान करता है। 3 डी सेल संस्कृति का एक बड़ा दोष प्रयोगात्मक जटिलता और लंबी समय सीमा में वृद्धि है। यहां वर्णित कोलेजन-आधारित मचानों पर न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के बीज, विकास और रखरखाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, जिसके बाद डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और अनुप्रयोग हैं, जो सेल विकास के मजबूत लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। हमने 14-दिवसीय प्रयोगात्मक विंडो में एंटीकैंसर दवा उपचार का आकलन करने के लिए एक अनुमानित और नियंत्रणीय वातावरण बनाने के लिए मचानों के लिए इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का लक्ष्य रखा। इन सभी वर्णित सरल प्रोटोकॉल का संयोजन पाड़-आधारित इन विट्रो कल्चर सिस्टम में न्यूरोब्लास्टोमा सेल विकास का एक अच्छी तरह से मूल्यांकन प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल सेटअप में महत्वपूर्ण बिंदुओं पर जोर दिया गया है ताकि वैज्ञानिकों को अपनी प्रयोगशालाओं में जल्दी से स्थापित करने की अनुमति मिल सके। उदाहरण के लिए, वर्णमिति सेल व्यवहार्यता परख के बेहतर प्रदर्शन के लिए संकेतित इनक्यूबेशन समय सभी कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए मचान छिद्रों में अभिकर्मक के गहरे प्रवेश की अनुमति देता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट डीएसडीएनए धुंधला तकनीक मजबूत और सीधी है; हालांकि, मचानों से डीएनए रिलीज के लिए जोरदार सेल लाइसिस की आवश्यकता होती है क्योंकि कोशिकाएं कोलेजन फाइबर के भीतर 'फंस' जाती हैं।

वर्णित सरल डीएनए परिमाणीकरण परख का उपयोग करके, हम इस मॉडल का उपयोग करके एंटीकैंसर दवा स्क्रीनिंग के लिए कोलेजन-आधारित मचानों पर लॉग विकास चरण की पहचान कर सकते हैं। वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग में, 4 प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व का उपयोग समग्र 14-दिवसीय अवधि और दिन 1, 7 और 14 पर विश्लेषण समय बिंदुओं के साथ किया गया था। हमने पहचान की कि 4 × 105 कोशिकाओं / मचान पर बीजित केलीलुक कोशिकाओं में दिन 7 और 14 के बीच सबसे महत्वपूर्ण सक्रिय प्रसार खिड़की है। यह लॉग चरण विकास डेटा विभिन्न सेल साइटोटॉक्सिसिटी प्रयोगों की विश्वसनीय व्याख्या के लिए अनुमति देगा। यह दवा विषाक्तता के बजाय 3 डी छिद्रपूर्ण मंच पर दबी हुई वृद्धि के परिणामस्वरूप विकास या कोशिका मृत्यु में किसी भी गिरावट के बारे में अटकलों को समाप्त करता है। सेल व्यवहार्यता भी विभिन्न सेल प्रकारों33,34 के विकास का समर्थन करने के लिए 3 डी प्लेटफार्मों की उपयुक्तता के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मूल्यांकन है। जबकि सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए कई परख हैं, जिसमें जीवित / मृत धुंधलापन, एटीपी माप, प्रसार परख शामिल हैं, हमने पाया कि अलामार ब्लू कलरमेट्रिक सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग डीएनए परिमाणीकरण डेटा का समर्थन करने के लिए एक सरल और प्रभावी तकनीक है।

डीएनए परिमाणीकरण और सेल व्यवहार्यता के संयुक्त उपयोग ने पूरक सबूत प्रदान किए कि, औसतन, 14-दिवसीय अवधि में निरंतर विकास प्राप्त करने के लिए मचान पर बीज कोशिकाओं के लिए इष्टतम घनत्व 2-4 × 105 कोशिकाओं / मचान है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न प्रयोगात्मक समय सीमा, विश्लेषण समय बिंदुओं और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल मचानों पर न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मोनोकल्चर सेल विकास के मूल्यांकन का वर्णन करता है, लेकिन मचानों को सह-संस्कृति के लिए एक मंच के रूप में उपयोग के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है, जिसका वर्णन डो अमरल एट अल द्वारा किया गया है, जिन्होंने घाव भरने की जांच में केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को सह-कल्चर करने के लिए कोलेजन-जीएजी स्काफोल्ड्स का उपयोग कियाथा।

वर्णित 3 डी मॉडल विभिन्न प्रसिद्ध तकनीकों, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और मानक एच एंड ई का उपयोग करके सेल विकास और घुसपैठ के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। मचानों पर कोशिका आकृति विज्ञान और विकास पैटर्न की विविधता के कारण जैव रासायनिक परख का उपयोग करके विकास के लक्षण वर्णन के साथ कोशिकाओं की कल्पना करना महत्वपूर्ण है। विकास पैटर्न को समझने से विकास व्यवहार और एंटीकैंसर दवाओं के लिए भविष्य की प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि मिल सकती है। उदाहरण के लिए, डीएनए परिमाणीकरण का उपयोग करके आईएमआर 32 विकास केली के समान पैटर्न उत्पन्न करता है, हालांकि एच एंड ई का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन पर, आईएमआर 32 केली की तुलना में बड़े समूहों में बढ़ता है, जिसने अधिक छितरी हुई वृद्धि प्रदर्शित की (चित्रा 9)। मचानों में सेल लाइनों के ये विविध विकास पैटर्न ट्यूमर विषमता के नैदानिक परिदृश्य को दर्शाते हैं। 3 डी मचानों में विभिन्न आकारिकी के साथ सेल लाइनों के एक पैनल का उपयोग करके एंटीकैंसर दवा प्रतिक्रिया की जांच करने से एक ही दवाओं के लिए रोगी की प्रतिक्रिया के लिए पूर्वानुमान मूल्य में वृद्धि होगी।

जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर या एलिसा जैसे अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके भी किया जा सकता है यदि रुचि का प्रोटीन स्रावित होता है। न्यूरोब्लास्टोमा प्रगति के एक सरोगेट मार्कर, क्रोमोग्रानिन ए (सीजीए) 36, का उपयोग 3 डी में न्यूरोब्लास्टोमा सेल वृद्धि को अतिरिक्त रूप से चिह्नित करने के लिए किया गया था। जैसा कि पिछले काम17 में वर्णित है, कोशिकाओं के प्रसार के रूप में सीजीए स्राव में वृद्धि हुई (चित्रा 10)। जबकि मोनोलेयर सेल संस्कृति इस वृद्धि को पकड़ नहीं सकी, क्योंकि प्रसार का मतलब था कि कोशिकाएं संस्कृति व्यंजनों में पूर्ण सामंजस्य तक पहुंच गईं, 3 डी कोलेजन स्काफोल्ड्स के उपयोग ने सीजीए स्राव के लंबे समय तक मूल्यांकन की अनुमति दी।

यह 3 डी इन विट्रो मॉडल न्यूरोब्लास्टोमा जीव विज्ञान और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए सभी शोध प्रश्नों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। सीमाओं में से एक मचानों के भीतर असमान सेल प्रवेश और अलग-अलग आकार के सेल समूहों का गठन है, जो किसी दिए गए सेल लाइन पर निर्भर करता है और पोषक तत्वों और परीक्षण दवाओं के बेकाबू प्रसार का कारण बन सकता है। यह सुविधा चिकित्सीय स्क्रीनिंग में मजबूती को प्रभावित करती है। हालांकि, इस सीमा के बावजूद, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि देशी ट्यूमर आकार और कैंसर कोशिका वितरण में भी विषम हैं और ट्यूमर ऊतक के भीतर कई अन्य सेल प्रकार होते हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम प्रत्येक सेल-आबादी वाले मचान को एकल सूक्ष्म ऊतक के रूप में उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं, जिसके लिए निम्नलिखित मापदंडों को अनुकूलित किया जाएगा: (ए) सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं और सेल समूहों तक पहुंचने के लिए इनक्यूबेशन बार, और (बी) मचान में कोशिकाओं के डीएनए को छोड़ने के लिए ऊतक लिस्टर के साथ मचानों पर कोशिकाओं के प्रीप्रोसेसिंग द्वारा ट्राइटन एक्स -100 बफर में कोशिकाओं का विश्लेषण।

इस प्रोटोकॉल की एक और तकनीकी सीमा इस मॉडल के लिए नए निर्मित मचानों के प्रत्येक बैच के यांत्रिक परीक्षण की कमी है। हालांकि, मचानों की मजबूत विनिर्माण प्रक्रिया का उपयोग करना, जिसे मचानों के भौतिक और रासायनिक गुणों के संबंध में बड़े पैमाने पर चित्रित किया गया है, जैसे कि संपीड़ित और तन्यता मापांक, सरंध्रता और दृश्य छिद्र संरचना, और समरूपता, यह सुनिश्चित करता है कि मचान गुणों को बैचों 21,24,27,30,37 के माध्यम से बनाए रखा जाए।

सारांश में, यह पेपर कोलेजन-आधारित मचानों पर सेलुलर विकास के विश्लेषण के लिए सरल तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है। प्रयोगात्मक समयरेखा और विश्लेषण बिंदुओं दोनों को विशिष्ट शोध प्रश्नों के आधार पर परस्पर बदला जा सकता है। यह प्रोटोकॉल अन्य सेल प्रकारों के लिए भी अनुकूलनीय है। ऊपर दिखाए गए परिणाम इस बात का सबूत देते हैं कि विधियों के इस संकलन ने 14 दिनों में निरंतर विकास बनाने के लिए विभिन्न न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व में अंतर्दृष्टि कैसे दी। इस प्रोटोकॉल में सभी तरीकों से प्राप्त परिणामों का समामेलन 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स के भीतर सेल विकास की बेहतर समझ पैदा करता है। इस मॉडल के भविष्य के उपयोग में न्यूरोब्लास्टोमा टीएमई के लिए विशिष्ट सह-संस्कृति प्रणाली और विभिन्न उपन्यास एंटीकैंसर दवाओं का परीक्षण शामिल होगा।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय बाल अनुसंधान केंद्र (एनसीआरसी), आयरिश रिसर्च काउंसिल (आईआरसी), और न्यूरोब्लास्टोमा यूके द्वारा समर्थित किया गया था। चित्र बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
IMR-32 ATCC CCL-127
Kelly ECACC 82110411
KellyCis83 Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) - Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired
SH-SY5Y ATCC CRL-2266
Disposable
0.22 µm syringe filter Millex SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 120.086
100 mL sterile Pot Starstedt -
10 mL plastic pipette Cellstar 607 180
15 mL Falcon tube Starstedt 62.554.502
25 mL plastic pipette Cellstar 760 180
50 mL Falcon tube Starstedt 62.547.254
5 mL plastic pipette Cellstar 606 180
6 mm Biopsy punches Kai Medical BP-60F
Aluminium foil - -
Cover Slip Menzel-Glaser -
HYPERflask Corning CLS10030
Microscope slides Thermo Scientific J1840AMNT
Opaque black 96-well plate Costar 3915
Sterile P10 tips Starlab S1121-3810
Sterile P1000 tips Starlab S1122-1830
Sterile P20 tips Starlab S1123-1810
Sterile P200 tips Starlab S1120-8810
T-175 (175 cm2 flask) Sarstedt 83.3912
T-75 (75 cm2 flask) Sarstedt 83.3911.302
Translucent clear 96 well plate Cellstar 655180
Translucent non-adherent 24 well plates Cellstar 83.3922.500
Equipment
Autoclave Astell -
Automatic tissue processor Leica TP1020
Centrifuge 5804 Eppendorf -
Hemocytometer Hausser  Scientific -
Incubator ThermoScientific -
Microtome Leica RM2255
Oven Memmert Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P10 pipette Gilson
P100 pipette Gilson
P1000 pipette Gilson
P20 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P200 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Paraffin section flotation bath Electrothermal MH8517 Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Pipette electronic dispenser Corning StripipetterUltra Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Plate cooler Leica EG1140C Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Refrigerator -20 °C Liebherr -
Refrigerator -80 °C Liebherr -
Refrigerator 4 °C Liebherr -
Seesaw Rocker DLAb SK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V Platereader PerkinElmer 1420
Tissue culture hood/Laminar flow hood GMI 8038-30-1044
Tissue Lyser Qiagen TissueLyser LT
Tweezers - -
Water bath Grant -
Wax embedder Leica EG1140H
Materials
1 L Water Adrona - Biosciences 568
1% Triton-X Sigma Aldrich 9002-93-1
10x PBS tablets Sigma Aldrich P4417-100TAB
37% paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Alamar Blue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1100
Collagen- glycosaminoglycan scaffold Tissue engineering research group (TERG)
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold Tissue engineering research group (TERG)
dH20 Adrona - Biosciences 568
Eosin Sigma-Aldrich E4009 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOH Sigma-Aldrich 1.00983.2500 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12 Gibco 21765-029
FBS Gibco 10270-106
Hemaytoxylin Sigma-Aldrich HHS32-1L
L-Glutamine Gibco 25030-024
MEM Gibco 21090-022
miRNA easy Kit Qiagen 217004
MNEAA’s Gibco 11140-035
Penicillin/streptomycin Gibco 015140-122
Qiazol Qiagen 79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
RPMI Gibco 21875-034
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S7795-500G
Tissue embedding Medium Sigma A6330-4LB
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Software
Excel - Excel 2016
ImageJ - -
Prism - Version 9

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त्रि-आयामी इन विट्रो बायोमिमेटिक मॉडल न्यूरोब्लास्टोमा कोलेजन-आधारित मचान बाल चिकित्सा कैंसर ट्यूमर ऊतक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रोग प्रगति रोगी रोग का निदान चिकित्सीय प्रतिक्रिया न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनें नैनोहाइड्रॉक्सीपैटाइट (एनएचए) ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स (जीएजी) हड्डी और अस्थि मज्जा मेटास्टैटिक साइटें छिद्रपूर्ण संरचना सेल लगाव प्रसार प्रवासन सेल क्लस्टर चिकित्सीय विवो स्थिति में पाड़-आधारित संस्कृति प्रणाली द्वि-आयामी (2 डी) सेल। संस्कृति डीएनए परिमाणीकरण सेल व्यवहार्यता

Erratum

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

कोलेजन-आधारित मचानों का उपयोग करके न्यूरोब्लास्टोमा का त्रि-आयामी <em>इन विट्रो</em> बायोमिमेटिक मॉडल
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Gallagher, C., Murphy, C., Kelly, G., O’Brien, F. J., Piskareva, O. Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds. J. Vis. Exp. (173), e62627, doi:10.3791/62627 (2021).

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