Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tredimensionell in vitro biomimetisk modell av neuroblastom med hjälp av kollagenbaserade strukturer

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62627
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 4, 3,5,6, 1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 7Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen's Green, Dublin 2, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland, 7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denna artikel listar de steg som krävs för att så neuroblastomcellinjer på tidigare beskrivna tredimensionella kollagenbaserade strukturer, upprätthålla celltillväxt under en förutbestämd tidsram och hämta strukturer för flera celltillväxt- och cellbeteendeanalyser och nedströmsapplikationer, anpassningsbara för att tillfredsställa en rad experimentella mål.

Abstract

Neuroblastom är den vanligaste extrakraniella solida tumören hos barn och står för 15 % av de totala dödsfallen i barncancer. Den naturliga tumörvävnaden är en komplex tredimensionell (3D) mikromiljö som involverar lager av cancerösa och icke-cancerösa celler omgivna av en extracellulär matris (ECM). ECM ger fysiskt och biologiskt stöd och bidrar till sjukdomsprogression, patientprognos och terapeutiskt svar.

Denna artikel beskriver ett protokoll för att sätta ihop ett 3D-ställningsbaserat system för att efterlikna neuroblastommikromiljön med hjälp av neuroblastomcellinjer och kollagenbaserade ställningar. Stödställningarna kompletteras med antingen nanohydroxiapatit (nHA) eller glykosaminoglykaner (GAG), som finns naturligt i höga koncentrationer i ben och benmärg, de vanligaste metastaserna för neuroblastom. Den 3D-porösa strukturen hos dessa strukturer möjliggör neuroblastomcellbindning, proliferation och migration och bildandet av cellkluster. I denna 3D-matris är cellens svar på terapier mer reflekterande av in vivo-situationen .

Det ställningsbaserade odlingssystemet kan upprätthålla högre celldensiteter än konventionell tvådimensionell (2D) cellodling. Därför är optimeringsprotokoll för initiala såddcellantal beroende av de önskade experimentella tidsramarna. Modellen övervakas genom att bedöma celltillväxt via DNA-kvantifiering, cellviabilitet via metaboliska analyser och celldistribution inom ställningarna via histologisk färgning.

Denna modells tillämpningar inkluderar bedömning av gen- och proteinuttrycksprofiler samt cytotoxicitetstestning med konventionella läkemedel och miRNA. 3D-odlingssystemet möjliggör exakt manipulation av cell- och ECM-komponenter, vilket skapar en miljö som är mer fysiologiskt lik naturlig tumörvävnad. Därför kommer denna 3D in vitro-modell att öka förståelsen för sjukdomspatogenesen och förbättra korrelationen mellan resultat som erhållits in vitro, in vivo i djurmodeller och försökspersoner.

Introduction

Neuroblastom är en barncancer i det sympatiska nervsystemet som uppstår under embryonal utveckling eller tidigt postnatalt liv på grund av omvandlingen av neurala toppceller1. Det är den vanligaste solida extrakraniella tumören hos barn, representerar 8 % av de maligniteter som diagnostiseras hos patienter under 15 år och är ansvarig för 15 % av alla dödsfall i barncancer. Sjukdomen uppvisar mycket heterogena kliniska beteenden på grund av specifika kromosomala, genetiska och epigenetiska förändringar och histopatologiska egenskaper.

Dessa förändringar bidrar till aggressiviteten hos neuroblastom och dåliga resultat hos pediatriska patienter. Nuvarande behandlingar visar sig därför vara ineffektiva på lång sikt för nästan 80 % av patienterna med den kliniskt aggressiva sjukdomen2, vilket belyser det faktum att behandlingen för denna patientgrupp fortfarande är utmanande. Detta beror sannolikt på att mekanismerna för neuroblastomheterogenitet och metastaser fortfarande inte är helt klarlagda. Tumörmikromiljön (TME) anses dock nu allmänt spela en roll i utvecklingen av många cancerformer. Ändå är det fortfarande understuderat i neuroblastom 3,4.

Den ursprungliga TME-mikromiljön är en komplex 3D-mikromiljö med cancerceller och icke-cancerceller omgivna av en ECM. ECM hänvisar till den acellulära komponenten i en vävnad som ger strukturellt och biokemiskt stöd till sina cellulära invånare och bidrar till sjukdomsprogression, patientprognos och terapeutiskt svar5. Detta främjande av sjukdomsprogression beror på "dynamisk ömsesidighet" eller pågående dubbelriktad kommunikation mellan celler och ECM 6,7,8. När cancern fortskrider omorganiseras stromalt kollagen ofta i linjära mönster vinkelrätt mot gränsytan mellan stroma och cancer, som cancerceller använder som en migrationsväg till metastasering 9,10,11.

Huvudkomponenterna i denna naturliga funktionella biologiska struktur inkluderar ett fibröst nätverk av kollagener typ I och II och andra proteiner, inklusive elastin, glykoproteiner som laminin, samt en rad proteoglykaner och andra lösliga komponenter12,13. Dessa proteiner i den ursprungliga ECM har nu blivit attraktiva naturliga biomolekyler för utveckling av 3D in vitro-modeller. Användningen av 3D-strukturer för in vitro-cellodling ökar i popularitet på grund av dess större fysiologiska representation av TME jämfört med traditionell 2D-monolagerodling. De tillverkade 3D-ställningarna hjälper cellbindning, proliferation, migration, metabolism och respons på stimuli som ses i in vivo biologiska system.

Huvudkomponenten i dessa 3D-strukturer är kollagen, som är en nyckelspelare i många normala biologiska processer, inklusive vävnadsreparation, angiogenes, vävnadsmorfogenes, cellvidhäftning och migration11. Kollagenbaserade 3D-matriser har visat sin robusta funktionalitet för att modellera ECM, och fungerar som en in vitro biomimetisk mikromiljö samtidigt som de möjliggör cell-ECM-interaktioner samt cellmigration och invasion. Dessa 3D-matriser ger också en mer exakt analys av cellsvar på kemoterapeutiska läkemedel än traditionell 2D- eller "platt" odling i många cancermodeller 14,15,16, inklusive neuroblastom 17,18. Genetisk analys av 3D-cellkulturer har rapporterat en högre korrelation med den mänskliga vävnadsprofilen även jämfört med djurmodeller19. Sammantaget är hörnstenen i dessa 3D-strukturer att ge cellerna en lämplig in vitro-miljö, vilket rekapitulerar den ursprungliga vävnadsarkitekturen och underlättar dubbelriktad molekylär överhörning8.

För att öka komplexiteten hos kollagenbaserade modeller inkorporeras andra vanliga ECM-komponenter i vävnadsteknikprocessen, vilket skapar mer fysiologiskt relevanta modeller för att återspegla nischade TME-metoder i olika vävnader. Till exempel underlättar GAG, negativt laddade polysackarider som finns i alla däggdjursvävnader20, cellbindning, migration, proliferation och differentiering. Kondroitinsulfat är en specifik typ av GAG som finns i ben och brosk, som tidigare har använts i vävnadstekniska applikationer för benreparation 21,22,23,24,25. Nanohydroxiapatit (nHA) är den huvudsakliga oorganiska beståndsdelen i mineralsammansättningen i mänsklig benvävnad och utgör upp till 65 viktprocent av benet26 och används därför i stor utsträckning för benersättning och regenerering27. Således är GAG och nHA attraktiva kompositer för att rekonstruera det primära neuroblastom-ECM:t och modellera de vanligaste metastaserna av neuroblastom, benmärg (70,5 %) och ben (55,7 %)28.

Ställningar som innehåller dessa ECM-komponenter utvecklades ursprungligen för benvävnadstekniska tillämpningar med omfattande analys av deras biokompatibilitet, toxicitet och osteoledande och osteoinduktiva egenskaper29,30. De är porösa, kollagenbaserade matriser som framställs med hjälp av frystorkningstekniker för att kontrollera deras fysikaliska och biologiska egenskaper. Kollagenställningarna kompletterade med antingen nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG) visade sig vara framgångsrika i att efterlikna primär TME vid bröstcancer31 och metastasering till skelettet vid prostatacancer15 samt neuroblastom17. Frystorkningstekniken som används för att tillverka dessa kompositställningar ger reproducerbar homogenitet i porstorlek och porositet inom ställningarna22,23,24. Kortfattat tillverkas en kollagenuppslamning (0,5 viktprocent) genom att blanda fibrillärt kollagen med 0,05 M ättiksyra. För Coll-I-GAG tillsätts 0,05 viktprocent chrondoitin-6-sulfat isolerat från hajbrosk till kollagenuppslamningen under blandningen. För de sammansatta Coll-I-nHA-ställningarna syntetiseras hydroxiapatitpartiklarna i nanostorlek enligt tidigare beskrivet27 och tillsätts kollagenuppslamningen i förhållandet 2:1 till kollagenets vikt under blandningsprocessen. Alla ställningar tvärbinds och steriliseras fysiskt med hjälp av en dehydrotermisk behandling vid 105 °C i 24 timmar25. Cylindriska ställningar (6 mm diameter, 4 mm höjd) erhålls med hjälp av en biopsistans och kan kemiskt tvärbindas med 3 mM N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimidhydroklorid och 5,5 mM N-hydroxisuccinimid (EDAC/NHS) i destillerat vatten (dH2O) för att förbättra konstruktionernas mekaniska egenskaper30. Denna väloptimerade tillverkningsprocess av två kollagenställningar skapar ställningar med reproducerbara mekaniska egenskaper, inklusive porstorlek, porositet och styvhet (kPa). Både Coll-I-GAG- och Coll-I-nHA-ställningar har olika fysiska egenskaper, vilket skapar olika miljöförhållanden. Egenskaperna för varje ställning visas i tabell 1.

Coll-I-GAG Coll-I-nHA
Ställningens storlek
(diameter [mm] x höjd [mm])		 6 × 4 17 6 × 4 17
Kollagenkoncentration (viktprocent) 0,5 17 0,5 17
Substratkoncentration (viktprocent)
[baserat på kollagenets vikt]		 0,05 15,17 200 17 Stockholm
Genomsnittlig porstorlek (mm) 96 22 Stockholm 96 – 120 29
Porositet (%) 99,5 23 98,9 – 99,4 27
Styvhet (kPa) 1,5 27 Stockholm 5,5 - 8,63 29

Tabell 1: Översikt över de mekaniska egenskaperna hos de två strukturer som används för att studera neuroblastombiologi.

Denna artikel beskriver ett protokoll för att sätta ihop ett 3D-ställningsbaserat system för att bättre efterlikna neuroblastommikromiljön med hjälp av neuroblastomcellinjer och tidigare beskrivna kollagenbaserade strukturer kompletterade med antingen nHA (Coll-I-nHA) eller kondroitin-6-sulfat (Coll-I-GAG). Protokollet inkluderar nedströmsmetoder för att analysera tillväxtmekanismerna hos neuroblastomcellerna i en mer fysiologiskt relevant miljö med hjälp av tidigare optimerade billiga metoder anpassade från 2D-monolagerodling Figur 1.

Figure 1
Bild 1: Övergripande protokollarbetsflöde. A) Cellerna odlas till tillräckligt antal, delas, räknas och återsuspenderas i en lämplig volym medium. (B) Detta cellmaterial genomgår sedan seriespädning för att framställa totalt 4 cellsuspensioner med olika densitet. (C) Kollagenbaserade ställningar pläteras sterilt i icke-vidhäftande 24-hålsplattor, och (D) 20 μL cellsuspension tillsätts i mitten av varje ställning och lämnas att inkubera vid 37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet i 3-5 timmar. (E) Komplett tillväxtmedium (1 ml) tillsätts sedan långsamt till varje ställning och plattorna placeras tillbaka i inkubatorn för att möjliggöra celltillväxt under önskad tidsram. (F) Vid varje förutbestämd tidpunkt hämtas flera strukturer för bedömning av cellviabilitet och tillväxt, analys av genuttryck och histologisk färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

1. Experimentell design

Antalet ställningar och celler som behövs för varje experiment beror på experimentets omfattning och kan beräknas med hjälp av verktygen i det här avsnittet om försöksplanering.

  1. Antal ställningar som krävs
    1. Bestäm den övergripande experimentella tidslinjen och bedömningsintervallen för förändringar i cellbiologi (t.ex. celltillväxt och metabolism).
      OBS: Till exempel är den experimentella tidsramen 14 dagar, med en bedömning av celltillväxt var 7:e dag. Således är de experimentella tidpunkterna dag 1, 7, 14 vilket ger totalt 3 tidpunkter.
    2. Bestäm sedan hur många experimentella tillämpningar som ska tillämpas vid varje tidpunkt. Försök att göra samma analyser vid varje tidpunkt för att övervaka förändringarna.
      OBS: Typiska analyser av celltillväxt på strukturer inkluderar cellviabilitetsanalyser, DNA-kvantifiering, histologisk färgning och avbildning och genuttrycksanalys. Dessa kommer att diskuteras vidare i avsnitt 5.
    3. Bestäm när samma ställning ska användas för flera nedströmstillämpningar, t.ex. efter bedömning av cellviabilitet med hjälp av en lämplig analys, återanvänd ställningen för DNA/RNA-isolering (diskuteras i 5.1.11).
    4. Behåll minst 3 biologiska replikat för varje applikation, t.ex. 3 ställningar för cellviabilitet och DNA-kvantifiering, 3 för histologi och 3 för genuttrycksanalys. Eftersom detta motsvarar 9 ställningar per tidpunkt, planera att använda 27 ställningar för 3 tidpunkter.
    5. Multiplicera slutligen detta tal med antalet experimentella parametrar eller förhållanden (t.ex. bedömning av flera cellinjer, initial såddtäthet, ställningskompositioner).
      OBS: I detta protokoll bedömdes 4 olika initiala såddtätheter för en cellinje, vilket resulterade i att 108 (27 ställningar x 4 villkor) ställningar krävdes. För att ta hänsyn till mänskliga fel och ge extra täckning, lägg till ~10 % till detta antal, t.ex. om 108 ställningar krävs, förbered 120 ställningar.
  2. Antal celler som krävs
    OBS: En volym på 20 μL cellsuspension rekommenderas för sådd av celler på en cylindrisk ställning (diameter 6 mm, höjd 4 mm) på dag 0. Antalet celler per denna 20 μl cellsuspension justeras i enlighet med försöksplanen, beräknad i avsnitt 1.1. En vanlig initial sådddensitet är 2 × 105 celler per 20 μL, som används som exempel för nedanstående protokoll.
    1. För att beräkna den totala mängden celler som krävs för experimentet, multiplicera de initiala 2 × 105 cellerna per 20 μL med det antal byggnadsställningar som krävs.
      OBS: Till exempel ger 30 ställningar multiplicerat med 20 μL en total volym på 600 μL. Om varje byggnadsställning kräver 2 × 10 5 celler, innehåller 600 μl suspension totalt 6 × 10 6 celler (2 × 105 × 30), vilket ger ett slutligt krav på 6 × 106 celler i 600 μL. Antalet experimentella parametrar kommer att diktera det totala antalet celler som krävs. Detta protokoll beskriver därför cellodling med hjälp av en flerskikts cellodlingskolv, som kan hantera samma antal celler som 10 traditionella 175 cm2-kolvar.

2. Beredning av kollagenbaserade strukturer

OBS: Coll-I-nHA och Coll-I-GAG cylindriska ställningar (diameter 6 mm, höjd 4 mm) bereds med etablerade metoder 15,21,27. När ställningarna har tvärbundits kemiskt enligt tidigare publicerade metoder17 måste de användas inom 1 vecka.

  1. Efter tillverkningen av ställningarna med önskade mekaniska egenskaper, se till att ställningarna är helt hydratiserade och noggrant tvättade i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    OBS: Detta tar i allmänhet ~12 timmar efter tvärbindningen av ställningarna och kan utföras i 100 ml behållare för vävnadsodlingsavfall vid 4 °C, med högst 50 ställningar per behållare och 2 ml PBS per ställning.
  2. Förvara ställningarna i PBS vid 4 °C tills de ska användas.

3. Propediera neuroblastomceller i en flerskiktad cellodlingskolv

OBS: Den optimala sådensiteten för flerskiktskolven varierar. För kolven som används i detta experiment är den optimala densiteten enligt tillverkarens anvisningar 1 × 107 celler. Före sådd av flerskiktskolven förökas cellerna till en densitet av 1 × 107 celler eller högre i en lämplig vävnadskolv (t.ex. en T175 cm2 vävnadskolv). För att så celler i flerskiktskolven (avsnitt 3.1), odla dem tills 70–80 % sammanflyter, skörda och räkna antalet celler per ml, se steg 3.2.16–3.2.20 för att utföra cellräkningen. När cellsuspensionen har räknats fortsätter du omedelbart med sådden av flerskiktskolven. Cellodlingsarbete måste utföras i en laminär flödeshuv för att bibehålla steriliteten.

  1. Sådd av flerskiktscellodlingskolven
    1. Förvärm 550 ml komplett odlingsmedium (varierar beroende på vilken cellinje som används) och 100 ml steril PBS i ett 37 °C vattenbad i 20 minuter.
    2. Beräkna med hjälp av den skördade cellsuspensionen den volym cellsuspension som krävs för att uppnå den optimala såddtätheten på 1 × 107 celler med hjälp av ekvation 1, där WANT avser det antal celler som krävs för sådd av flerskiktskolven och HAVE avser antalet celler/ml i cellsuspensionen:
      Equation 1Nej (1)
      t.ex. Equation 2
    3. Tillsätt erforderlig volym av cellsuspensionen till 100 ml av det förvärmda odlingsmediet.
    4. Ta en ny flerskiktskolv i huven, ta bort locket och håll kolven i 60° vinkel. Pipettera långsamt över alla 100 ml av cellsuspensionen i kolven, ner längs den vinklade sidan av halsen. Täck kolven och lägg den på sidan så att cellerna kan fördelas jämnt över lagren.
    5. Tillsätt 400 ml av det förvärmda odlingsmediet i flerskiktskolven i 60° vinkel genom att långsamt hälla eller pipettera längs den vinklade sidan av halsen. Om halsen blir full, sätt tillbaka kolven i upprätt läge eller täck kolven och lägg den på sidan innan du återgår till att hälla.
      OBS: Häll långsamt för att undvika överdriven bubbelbildning. Knacka försiktigt kolven i upprätt läge så att alla bubblor stiger till toppen och ta bort dem med en 10 ml pipett. Se till att kolven är fylld till halsens undergänga; Tillsätt mer medium, om det behövs, för att uppnå detta.
    6. Täck flerskiktskolven och inkubera den med den vinklade halsen nedåt vid 37 °C, 5 % CO 2 och 95 % luftfuktighet.
    7. Kontrollera tillväxten var 2-3:e dag för sammanflöde. För att kontrollera sammanflödet av de två nedre lagren i flerskiktskolven, view dem under en 4x objektivlins i ett inverterat mikroskop.
      OBS: När den sås med 1 × 107 neuroblastomceller, tar det vanligtvis en vecka för 10-lagerskolven att bli sammanflytande - även om detta kan variera beroende på vilken cellinje som används.
  2. Rutinunderhåll av celler i flerskiktskolven
    1. Förvärm 550 ml komplett odlingsmedium (varierar beroende på vilken cellinje som används), 50-100 ml trypsin och 300 ml steril PBS i ett 37 °C vattenbad i 20 minuter.
    2. Kontrollera att flerskiktskolven har 70-80 % sammanflöde.
    3. Placera flerskiktskolven i en huv med laminärt flöde och häll det förbrukade mediet från kolven. Luta först kolven så att mediet häller över luftdammen i en avfallsbehållare. Rotera kolven 180° medan du häller tills mediet rinner ner i kolvens vinklade hals. Rotera kolven fram och tillbaka längs denna axel för att eliminera eventuell kvarvarande vätska.
    4. Tvätta cellerna genom att tillsätta 100 ml förvärmd steril PBS långsamt ner i den vinklade halsen. Täck kolven, lägg den på sidan för att möjliggöra jämn fördelning av PBS och rotera kolven fram och tillbaka för att tvätta cellerna.
    5. Kassera PBS-tvätten på samma sätt som 3.2.3. Upprepa tvättstegen.
    6. Späd 50 ml av det förvärmda trypsinet i 50 ml förvärmt sterilt PBS. Tillsätt 100 ml utspädd trypsinlösning till flerskiktskolven, locket och placera kolven på sidan för att möjliggöra jämn fördelning av trypsinet. Om cellinjen är mycket vidhäftande, använd 100 ml outspätt trypsin.
    7. Inkubera kolven i 2–5 minuter vid 37 °C, 5 % CO 2 och 95 % luftfuktighet, övervaka cellavskiljningen under mikroskopet. Om det behövs, knacka fast kolven ordentligt för att underlätta lossning eller sätt tillbaka den i inkubatorn i ytterligare en minut.
    8. Placera flerskiktskolven i en huv med laminärt flöde och neutralisera trypsinet med 100 ml odlingsmedium. Täck kolven, lägg den på sidan och gunga fram och tillbaka för att säkerställa fullständig neutralisering.
    9. Häll av den neutraliserade cellsuspensionen i 4 x 50 ml koniska centrifugrör.
      OBS: Om fullständig cellskörd krävs, tvätta flerskiktskolven igen med 100 ml steril PBS och häll av den i 2 x 50 ml centrifugrör.
    10. Centrifugera cellsuspensionen i 50 ml centrifugrör vid 340 × g i 3-4 minuter för att pelletera cellerna.
    11. Sätt tillbaka centrifugrören i huven med laminärt flöde och kassera försiktigt så mycket supernatant som möjligt från varje pellet.
      OBS: Pelleten kommer att vara stor och relativt lös och kan därför lätt störas.
    12. Tillsätt 1-5 ml tillväxtmedium till varje pellet och återsuspendera den genom att pipettera upp och ner flera gånger.
    13. Slå ihop de 4 återsuspenderade pelletsen i ett 50 ml centrifugrör, blanda dem noggrant med pipetten och notera den totala volymen.
    14. Gör en lämplig utspädning av cellsuspensionen för cellräkning så att varje yttre kvadrat på hemocytometern innehåller 30-100 celler.
      Anmärkning: En lämplig startutspädning är 1:100; För detta, pipettera 10 μL av cellsuspensionen till ett nytt 15 ml koniskt centrifugrör och späd det med 990 μL steril PBS. Pipettera blandningen upp och ner flera gånger för att blanda ordentligt.
    15. Placera ett 50 ml centrifugrör som innehåller cellbeståndet i inkubatorn medan du räknar.
    16. Ta en ren hemocytometer och placera ett rent täckglas över gallret, som visas i figur 2.
    17. Överför 10 μl av den utspädda cellsuspensionen till hemocytometerkammaren. Om kammaren blir full innan alla 10 μL har dispenserats, sluta pipettera.
    18. Placera hemocytometern under 4x-objektivet på ett ljusmikroskop. Justera det grova och fina fokuset för att visualisera cellerna.
    19. Räkna antalet celler i kammarens fyra yttre hörnrutor enligt figur 2. Lägg till de fyra räkningarna och dividera med 4 för att beräkna medelvärdet av cellerna per kvadrat.

Figure 2
Figur 2: Cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Tio mikroliter cellsuspension tillsätts till hemocytometern under täckglaset. Kammaren placeras sedan under den 4x objektivlinsen på ett mikroskop och antalet celler i rutnätets fyra yttre hörn räknas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Multiplicera det genomsnittliga antalet med utspädningsfaktorn (t.ex. 100) och multiplicera detta tal med 10 000 för att få fram antalet celler per ml med hjälp av ekvation (2).
    Equation 3 Nej (2)
  2. Beräkna det totala antalet celler i stamlösningen genom att multiplicera med cellmaterialets totala volym (t.ex. om de 4 omsuspenderade pelletarna bildade en 20 ml lösning, multiplicera celler/ml med 20).
  3. För att underhålla flerskiktskolven används ekvation (1) som beskrivs i steg 3.1.2 för att beräkna den volym cellmaterial som behövs för att så 1 × 107 celler tillbaka i kolven och utför steg 3.1.3–3.1.6 för att återsådd av kolven. Om du är redo att seeda ställningarna, fortsätt till nästa avsnitt.

4. Frö neuroblastomceller på byggnadsställningar

  1. Förbered stamcellssuspension
    OBS: Detta protokoll kommer att beskriva stegen för att skapa fyra olika seedningstätheter av neuroblastomceller, med en multiplikationsfaktor på 2 mellan varje densitet. En seriell utspädning kommer därför att användas för att skapa ytterligare tre cellsuspensioner från stamsuspensionen. Cellodlingsarbete måste utföras i en laminär flödeshuv för att bibehålla steriliteten.
    1. Använd ekvation (3) för att beräkna den cellvolym som behövs utifrån det totala antalet celler i flerskiktskolven (räknat i punkt 3.2.19) för att bereda den första såddtätheten eller cellstamssuspensionen.
      Equation 4Nej (3)
      OBS: Till exempelample, om den högsta sådddensiteten är 6 × 10 5 celler per ställning som krävs för 30 ställningar, där varje ställning får 20 μL cellsuspension, skulle stamcellssuspensionen kräva 1,8 × 107 celler (6 × 105 celler × 30 ställningar) i en total volym på 600 μL (20 μL × 30 ställningar).
      Eftersom en seriespädning kommer att utföras från denna beredning måste dessa siffror fördubblas, dvs 3,6 × 107 celler i en total volym av 1200 μL. För att konvertera detta till WANT i celler per ml; dela 3,6 × 10 7 x 1200 μL och multiplicera med 1000 μL, vilket ger 3 × 107 celler per ml.
      ​Equation 5
    2. Tillsätt erforderlig volym cellmaterial till ett sterilt 2 ml eller 15 ml centrifugrör och bringa till en slutlig volym på 1200 μL med odlingsmedium. Märk detta rör som densitet 1 (figur 3).
  2. Utför seriell utspädning för att skapa cellsuspensioner med flera sådddensitetsceller.
    1. Från densitet 1 som bereddes i steg 4.1.1 bereds ytterligare tre densiteter av cellsuspension genom seriell utspädning enligt figur 3.
    2. Späd varje densitet med en faktor 2 i odlingsmediet. Tillsätt först erforderlig slutlig volym (600 μL från föregående exempel) av odlingsmediet till tre sterila 2 ml eller 15 ml centrifugrör.
    3. Överför hälften av densitet 1 (600 μL) till ett av rören, blanda cellsuspensionen noggrant med mediet för att späda ut. Märk detta rör som densitet 2.
    4. Överför hälften av densitet 2 (600 μL) till nästa rör, blanda cellsuspensionen noggrant med mediet för att späda ut. Märk detta rör som densitet 3.
    5. Överför hälften av densitet 3 (600 μL) till nästa rör, blanda cellsuspensionen noggrant med mediet för att späda ut. Märk detta rör som densitet 4.
    6. Kassera 600 μl från densitet 4 så att alla fyra beredningarna har en slutlig volym på 600 μl.
    7. Som en negativ kontroll, tillsätt endast 600 μL odlingsmedium till ett sterilt 2 ml centrifugrör. Se figur 3 för en schematisk bild av den seriella utspädningsprocessen.

Figure 3
Figur 3: Seriespädning av cellmaterial för att bereda 4 suspensioner för 4 olika såddtätheter av ställningar. (A) Siffrorna kan justeras för att passa önskad såddtäthet per ställning och (B) multipliceras med det totala antalet ställningar per densitet, där varje ställning får 20 μL cellsuspension. I det här exemplet kräver densitet 1 6 × 105 celler per ställning, vilket motsvarar 1,8 × 107 celler i 600 μL för 30 ställningar. Detta antal fördubblas för att påbörja seriespädningen, eftersom 600 μL sedan överförs och späds ut i 600 μL odlingsmedium i nästa rör. Denna process fortsätter tills det finns 4 cellsuspensioner med en faktor 2 mellan varje. En negativ kontroll görs genom att tillsätta 600 μL medium endast till ett rör. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Lägga till cellsuspensioner till ställningarna
    OBS: Ta bort ställningarna (förvaras i PBS) från kylskåpet och låt dem komma till rumstemperatur (RT) innan du lägger till cellerna.
    1. För in ställningarna i PBS in i huven med laminärt flöde.
    2. Använd en steril pincett och placera ställningarna i icke-vidhäftande 24-hålsplattor med en ställning per brunn (Figur 1C). Lyft försiktigt ställningarna i hörnen och tryck dem lätt mot sidan av behållaren för att ta bort överflödig PBS. Lägg ställningarna i mitten av brunnarna med skinnsidan nedåt (den blanka lagersidan av ställningen, vänd nedåt i plastplattorna med 24 brunnar).
    3. Märk plattorna med 24 brunnar med detaljer om cellinjen, relevanta parametrar (t.ex. såddtäthet) och tidpunkter. Arbeta med en cellsåddstäthet i taget och behåll de återstående densiteterna i 37 °C-inkubatorn tills den är klar att användas.
    4. I huven med laminärt flöde, använd en P20-pipett och sterila spetsar för att försiktigt tillsätta 20 μL av den relevanta cellsuspensionen till mitten av varje ställning (figur 1D). Håll cellerna ordentligt suspenderade genom att blanda väl medan du lägger till cellerna i ställningarna. Se till att upphängningen förblir ovanpå ställningen och inte glider av på brunnens botten, eftersom detta inte tillåter cellfäste på ställningen.
    5. När cellerna har tillsatts, inkubera plattorna i 3-5 timmar (37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet) så att de flesta cellerna kan fästa.
    6. Efter inkubationen, tillsätt långsamt och försiktigt 1 ml förvärmt odlingsmedium till varje brunn (Figur 1E). Använd en P1000-pipett för att tillsätta mediet för att möjliggöra en mer långsam och kontrollerad rörelse, vilket förhindrar att ställningarna förskjuts. Om du arbetar med ett mycket stort antal ställningar, använd en 10 ml pipett med pipettpistolen inställd på "släpp" och "låg".
    7. Inkubera plattorna med 24 brunnar över natten (37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet).
  2. Underhåll av celler på ställningarna
    1. Efter de första 24 timmarna av cellbindning (dag 1), överför de sådda ställningarna till nya icke-vidhäftande 24-brunnsplattor och tillsätt 1-2 ml färskt tillväxtmedium.
      OBS: Detta steg tar bort celler som har fallit till botten av plastplattorna med 24 brunnar i stället för att låta dem växa på ställningarna. Ställningsreplikat som betecknas som dag 1 kommer att tas ner efter 24 timmar, som diskuteras i avsnitt 5; Därför gäller inte underhåll för dessa ställningar.
    2. Övervaka ställningarna initialt var 2-3:e dag för en förändring i färgen på odlingsmediet. Allt eftersom tiden går och cellerna förökar sig i byggnadsställningarna, mata cellerna oftare.
    3. Använd en 10 ml pipettpistol, i långsamt läge, ta bort 1 ml av det förbrukade mediet och kassera. Om experiment som kräver konditionerat medium utförs, samlas det förbrukade mediet av biologiska replikat upp i ett 15 ml centrifugrör, centrifugeras vid 340 × g i 2 minuter för att pelletera det cellulära restet, överför supernatanten till ett nytt rör och förvaras vid -80 °C.
    4. Tillsätt försiktigt 2 ml förvärmt tillväxtmedium till ställningarna, använd droppfunktionen igen på pipetten och sätt tillbaka 24-hålsplattan i inkubatorn (37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet). Upprepa när mediet är förbrukat under den önskade tillväxtperioden.

5. Hämtning av ställningar och applikationer

OBS: Vid varje tidpunkt kan flera applikationer användas för att övervaka celltillväxt på ställningarna eller bedöma gen- och proteinuttrycksprofiler. Villkoren för hämtning av ställningar beror på vilken analys som ska utföras, med flera hämtningsmetoder som beskrivs i följande underavsnitt och demonstreras i figur 4.

  1. Bedömning av cellviabilitet inom stödstrukturer
    1. Sterilisera lämpligt reagens för cellviabilitetsanalys genom att filtrera genom ett 0,2 μm sterilt filter in i ett centrifugrör i huven för laminärt flöde. Förvärm denna sterila lösning tillsammans med komplett odlingsmedium och steril PBS i ett 37 °C vattenbad.
    2. I huven med laminärt flöde, använd steril pincett för att överföra ställningarna som ska analyseras till en ny 24-hålsplatta. Märk skylten med alla relevanta detaljer.
      OBS: Utför analysen i tre exemplar.
    3. Tillsätt 900 μl av det förvärmda odlingsmediet till varje brunn, följt av 100 μl av det sterila cellviabilitetsreagenset. Inkludera en negativ kontroll genom att tillsätta 900 μl medium och 100 μL av det sterila cellviabilitetsreagenset till en brunn utan byggnadsställning. Sätt tillbaka locket på plattan och gunga försiktigt plattan i ~3 minuter för att jämnt fördela det utspädda cellviabilitetsreagenset i hela brunnen. Inkubera plattan vid 37 °C, 5 % CO2 och 95 % luftfuktighet.
      OBS: Inkubationstiderna måste optimeras för varje cellinje; Se tillverkarens riktlinjer. För neuroblastomcellinjer verkar 4-6 timmars inkubation optimalt.
    4. Efter inkubationen, ta bort plattan från inkubatorn och gunga den försiktigt i några sekunder.
    5. Öppna en ny, genomskinlig 96-hålsplatta i huven med laminärt flöde. Från varje brunn i 24-hålsplattan överförs det inkuberade mediet och reagenset till tre brunnar på 96-hålsplattan med 100 μL per brunn, vilket ger tekniska trilikat.
      OBS: Denna överföring kommer att lämna 700 μL i brunnarna på 24-hålsplattan.
    6. Täck 96-hålsplattan med aluminiumfolie för att skydda cellviabilitetsreagenset från ljus.
    7. Ta bort och kassera de återstående 700 μL av brunnsinnehållet från varje ställning i plattan med 24 hål. Tvätta varje ställning två gånger med 1 ml steril PBS.
      OBS: All färg kommer inte att tas bort från ställningarna. Dessa ställningar kan sedan användas för ytterligare tillämpningar, t.ex. DNA-kvantifiering, genom att placera dem i 1 ml 1 % Triton X-100 i 0,1 M natriumbikarbonatlösning (NaHCO3) och lagra dem vid -80 °C (se avsnitt 5.2, figur 4B).
    8. Ta bort 96-hålsplattan från huven för laminärt flöde och mät absorbansen för varje brunn vid våglängderna 570 nm och 600 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Registrera absorbansvärdena vid båda våglängderna och följ tillverkarens instruktioner för att beräkna den procentuella minskningen av cellviabilitetsreagenset av cellerna.
    9. Grafera och statistiskt analysera cellviabilitetsresultaten med hjälp av lämplig programvara. Mata in biologiska tredubbla värden för att producera felstaplar och indikera analysvariabiliteten.
    10. För att undersöka förändringar i cellviabilitet under den experimentella tidsramen, utför ett envägsanalystest av varians (ANOVA) med flera jämförelser av medelvärdena med hjälp av lämplig biostatistisk programvara.
    11. Ange signifikanta skillnader mellan tidpunkterna i graferna som ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) och **** (P≤0,0001).

Figure 4
Figur 4: Hämtning av ställningar för olika analyser vid varje tidpunkt. (A) Tre scaffold-replikat tas fram för analys av cellviabiliteten. (B) Dessa ställningar kan sedan tvättas i PBS, placeras i 1 % Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3 och lagras vid -80 °C för DNA-kvantifiering. (C) Ytterligare tre replikat fixeras i 10 % PFA i 15 minuter, neutraliseras i PBS och lagras vid 4 °C för histologisk färgning och avbildning. D) Slutligen tillsätts 3 replikat till ett fenol-/guanidinbaserat celllysreagens och lagras vid -20 °C för analys av genuttryck. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning; PFA = paraformaldehyd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Kvantifiering av DNA från cellerna i stödstrukturerna
    OBS: Som nämnts i anmärkningen efter steg 5.1.7 innebär hämtningen av ställningarna för DNA-kvantifiering att ställningarna placeras i 2 ml centrifugrör som innehåller 1 ml 1 % Triton X-100 i 0,1 M NaHCO3-lösning följt av förvaring vid -80 °C. Innan DNA-analys kan utföras måste cellerna genomgå tre frys-upptiningscykler för att lysera neuroblastomcellerna på lämpligt sätt och frigöra DNA för kvantifiering.
    1. Ta bort proverna som tidigare förvarats i Triton X-100 från -80 °C. Låt proverna stå vid RT i 1-3 timmar eller tills de tinat.
    2. Vänd proverna i 10–20 sekunder och sätt tillbaka proverna vid -80 °C i 18–24 timmar eller tills de är helt frysta. Upprepa denna process i totalt tre frys-upptiningscykler.
    3. För att maximera DNA-utbytet, använd en vävnadslysare för att störa cellerna i ställningarna.
      1. Placera en metallpärla i 2 ml centrifugröret som innehåller en ställning i Triton X-100 och placera röret i adaptern för att skaka sample med 50 svängningar/sekund i 2-3 min.
        OBS: Använd centrifugrör med rund botten eftersom metallpärlan kan fastna i ett rör med avsmalnande botten.
    4. Kvantifiera DNA:t i Triton X-100-lösningen genom att applicera en fluorescerande dubbelsträngad DNA-färgning (dsDNA) och mät emissionen med hjälp av en mikroplattläsare. Se tillverkarens riktlinjer; späd proverna på lämpligt sätt i Tris-etylendiamintetraättiksyrabuffert (TE) för att bereda 8 dsDNA-standarder genom seriell utspädning i TE-buffert (figur 5).
    5. I svarta ogenomskinliga plattor med 96 brunnar, tillsätt 100 μl av varje standard eller prov till brunnarna i tekniska tre exemplar.
    6. Späd den fluorescerande dsDNA-fläcken 200 gånger i TE-buffert och tillsätt 100 μL till varje standard/prov med hjälp av en flerkanalspipett. Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera vid RT i 5 min.
    7. Mät och registrera fluorescensen i varje brunn vid 520 nm. Följ tillverkarens riktlinjer för att beräkna koncentrationen av DNA i varje sample.
      OBS: Om den genomsnittliga koncentrationen av DNA per cell är känd för den cellinje som används, kan DNA-koncentrationsvärden omvandlas till cellantal med hjälp av ekvation (4).
      Equation 6Nej (4)
    8. Rita upp och analysera DNA-kvantifieringsresultaten statistiskt med hjälp av lämplig programvara. Mata in biologiska tredubbla värden för att producera felstaplar och indikera analysvariabiliteten.
    9. För att undersöka förändringarna i DNA-koncentration/cellantal under den experimentella tidsramen, utför ett envägs ANOVA-test med flera jämförelser av medelvärdena med hjälp av lämplig biostatistisk programvara.
    10. Ange signifikanta skillnader mellan tidpunkter i grafer som ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) och **** (P≤0,0001).

Figure 5
Figur 5: Förberedelse av åtta DNA-standarder för generering av en standardkurva. En stamlösning av λDNA tillhandahålls vid 100 μg/ml. Detta späds ut 50 gånger i TE-buffert för att skapa standard A vid 2000 ng/ml; 400 μL A överförs sedan till rör B, som innehåller 400 μL TE-buffert. 400 μL B överförs sedan och späds 2-faldigt i C, och så vidare tills G. Standard H består endast av TE-buffert och har därför en DNA-koncentration på 0 ng/ml. Förkortning: TE = Tris-EDTA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Förberedelse av ställningar för histologisk färgning
    OBS: Ställningar kan fixeras och färgas för mikroskopi- och avbildningsändamål antingen som hela ställningar för immunofluorescens (IF) eller som formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) skivor för histologisk färgning eller immunhistokemi (IHC). Detta möjliggör en kvalitativ bedömning av cellpenetration och distribution inom strukturer och kan användas för att bedöma uttrycket av proteiner.
    1. Bered en 10% paraformaldehydlösning (PFA) i PBS. Se till att det finns tillräckligt med lösning för en slutlig volym på 500 μL per ställning.
    2. Förvärm denna lösning vid 37 °C och tillsätt 500 μl till märkta 2 ml centrifugrör för uppsamling av byggnadsställningar.
    3. Ta bort ställningarna från de icke-vidhäftande 24-hålsplattorna (steg 4.4.4) och placera dem i huven för laminärt flöde.
    4. Använd en steril pincett och överför ställningarna till de märkta centrifugrören som innehåller 10 % PFA. Låt ställningarna fixeras i PFA-lösningen i 15 min. Neutralisera PFA genom att tillsätta 500 μL PBS till varje rör och förvara vid 4 °C.
    5. För att förbereda ställningarna för den automatiska vävnadsprocessorn, ta bort dem från 4 °C och använd en pincett för att placera dem i plastkassetter märkta med alla relevanta detaljer med blyerts. Placera alla kassetter i metallbehållaren på vävnadsprocessorn.
    6. Börja 12-stegsprotokollet på vävnadsprocessorn för att fixera, torka, rensa ställningarna och infiltrera dem med paraffin över natten. Samla upp kassetterna som innehåller de bearbetade proverna.
    7. Bädda sedan in ställningarna i paraffinvaxblock för att tillåta mikrotomi av ställningarna i mycket tunna skivor för färgning.
      OBS: Det är särskilt viktigt att tänka på ställningarnas orientering när du tar bort dem från kassetterna och bäddar in dem i vax, eftersom detta kommer att påverka vinkeln i vilken bilderna tas. Detta är viktigt vid bedömning av cellinfiltration i byggnadsställningarna.
    8. Slå på vaxinbäddaren och den kalla plattan; Lyft på locket för att kontrollera nivån på vaxet. Fyll på vid behov.
    9. Arbeta med ett prov i taget, öppna kassetten, ta bort ställningen och centrera den i plastformen.
    10. Häll varmt vax på provet, se till att korrekt orientering bibehålls och justera vid behov med en varm pincett innan vaxet stelnar. Häll mer vax för att fylla formen.
    11. Placera det märkta kassettlocket ovanpå plastformen och tillsätt vax ovanpå. Placera formen på den kalla plattan för att stelna vaxet. Förvaras över natten vid 4 °C för att säkerställa att paraffinvaxet är helt stelnat före mikrotomi.
    12. För att förbereda dig för mikrotomi, sätt på ett 35 °C vattenbad, torkplattan och mikrotomen.
    13. Sätt i ett blad i hållaren och dra åt spaken för att säkra den.
    14. Ställ in lister och sektionstjocklek, vanligtvis 5 mm för ställningssektioner.
    15. Ta bort FFPE-ställningen från formen, fäst den i hållaren på framsidan av mikrotomen och trimma försiktigt överflödigt vax runt provets kanter innan du skär sektioner.
    16. Börja skära in i vaxblocket genom att vrida spaken på mikrotomen, vilket säkerställer en jämn rörelse.
    17. Samla bandliknande sektioner, cirka 3 ställningssektioner åt gången, och placera dem försiktigt i det 35 °C vattenbadet för att ta bort rynkor. Separera försiktigt sektionerna medan du är i vattenbadet med en pincett.
    18. Använd polysinusbelagda glasmikroskopglas och lyft varje sektion från vattenbadet så att sektionen sitter i mitten av objektglaset. Märk varje bild med en penna.
    19. Placera glasskivorna på torkplattan eller i en 60 °C torkugn. När de har torkat, förvara dem vid 4 °C och fortsätt med den histologiska färgning eller IHC-färgning som krävs.
  2. Hämtning av byggnadsställningar för analys av genuttryck
    1. Ta bort ställningarna från de icke-vidhäftande 24-hålsplattorna från inkubatorn (steg 4.4.4) och placera dem i huven för laminärt flöde.
    2. Använd en steril pincett och överför ställningarna till färskmärkta 2 ml centrifugrör.
    3. I ett dragskåp, tillsätt 1 ml av ett fenol-/guanidinbaserat celllyseringsreagens till varje rör för att lysera cellerna i byggnadsställningar och möjliggöra återvinning av högkvalitativt RNA.
    4. Förvara rören vid -20 °C tills de är redo att utföra RNA-extraktion med hjälp av ett lämpligt kit. Med hjälp av en kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR)17 med omvänd transkription kan du bedöma genuttrycket i cellerna i stödstrukturerna.

Representative Results

Den kollagenbaserade stödmodellen som beskrivs här har många tillämpningar, allt från att studera neuroblastombiologi till screening av anticancerterapier i en miljö som är mer fysiologiskt lik inhemska tumörer än konventionell 2D-cellodling. Innan man testar en given forskningsfråga är det avgörande att få en fullständig karakterisering av cellbindning, proliferation och infiltration inom den önskade experimentella tidsramen. Tillväxtförhållandena beror på biologin hos varje specifik cellinje. Det är viktigt att flera metoder för bedömning av celltillväxt måste implementeras för att fastställa optimala förhållanden och robust prestanda.

Här bedömdes viabiliteten hos neuroblastomceller odlade på byggnadsställningar med hjälp av en kolorimetrisk cellviabilitetsanalys. Denna analys kan utföras så ofta som önskas under hela den experimentella tidsramen. För det beskrivna experimentet utfördes bedömning av cellviabilitet på dag 1, 7 och 14 för två neuroblastomcellinjer, KellyLuc och IMR32, odlade på Coll-I-nHA-strukturer med 4 olika densiteter (Figur 6). Viabilitet på dag 1 sattes som en baslinje för att jämföra alla efterföljande mätningar. Reduktionshastigheten för cellviabilitetsreagenset återspeglar cellbiologin och tillväxtegenskaperna hos enskilda cellinjer, inklusive deras proliferationshastighet och metabolism. En korrelation mellan antalet celler som såddes på ställningarna och reduktionsnivån förväntades. I detta experiment ökade minskningen av cellviabilitetsreagenset i allmänhet med varje tidpunkt för båda cellinjerna vid alla densiteter, som förväntat.

Varje densitet bedömdes sedan individuellt för båda cellinjerna för att jämföra minskningen över tidpunkter. Envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest utfördes för att upptäcka signifikanta skillnader i reduktion mellan tidpunkter (Figur 7). För båda cellinjerna och alla seedningstätheter sågs en signifikant ökning (P<0,05) av reduktionen av cellviabilitetsreagenset vid jämförelse av dag 1 och dag 14. Detta indikerade en signifikant ökning av metaboliskt aktiva celler som fanns på byggnadsställningarna. Denna ökning var inte signifikant i alla fall när man bedömde 7-dagarsintervallen (dag 1 jämfört med dag 7, dag 7 jämfört med dag 14), vilket visar vikten av optimering av såddtätheten för att uppnå det önskade tillväxtfönstret.

För att stödja resultaten av cellviabilitetsanalysen kan celltillväxt på strukturer också mätas indirekt via kvantifiering av dsDNA extraherat från strukturer med hjälp av en fluorescerande dsDNA-färgning (figur 8A). Liksom cellviabilitet kan DNA-kvantifiering göras så ofta som önskas inom den experimentella tidslinjen. Denna analys kräver dock fullständig hämtning av byggnadsställningar och upphörande av celltillväxt och måste därför tas med i den experimentella planeringen som diskuteras i avsnitt 1. För detta experiment kvantifierades DNA på dag 1, 7 och 14 för två neuroblastomcellinjer, KellyLuc och IMR32, odlade på Coll-I-nHA-ställningar vid 4 olika densiteter. Eftersom den genomsnittliga koncentrationen av dsDNA per cell är känd för dessa cellinjer, var det möjligt att härleda antalet celler per prov från det kvantifierade DNA:t (Figur 8B).

DNA-kvantifiering gav upphov till högre variabilitet mellan biologiska replikat än bedömning av cellviabilitet men ökade generellt för varje tidpunkt, med de högsta nivåerna kvantifierade på dag 14. IMR32-celler verkar nå högre cellantal på Coll-I-nHA-ställningar, vilket indikeras av DNA-koncentration, än KellyLuc-celler. Varje densitet bedömdes sedan individuellt för de två cellinjerna för att jämföra minskningen över tidpunkter. Envägs ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest utfördes för att upptäcka signifikanta skillnader i reduktion mellan tidpunkter (Figur 8B).

För båda cellinjerna och alla seedningstätheter sågs en signifikant ökning (P<0,05) i cellantal vid jämförelse av dag 1 och dag 14, med undantag för KellyLuc vid seeding density 4 (1 × 105 celler/scaffold), som inte gav signifikanta ökningar över någon av tidpunkterna. I likhet med cellviabilitetsresultaten var ökningarna inte signifikanta i alla fall vid bedömning av 7-dagarsintervallen (dag 1 jämfört med dag 7, dag 7 jämfört med dag 14). När man jämförde tidstrenderna för cellviabilitet och DNA-kvantifiering fanns det några små skillnader mellan de två analyserna. Överlag observerades dock liknande trender, med medelvärden som ökade mellan 7-dagarsintervallen för de flesta tätheter. Detta visar hur viktigt det är att övervaka celltillväxten med hjälp av mer än en metod.

En visuell bedömning av celltillväxtens morfologi och fördelning på strukturerna implementerades därefter, omfattande traditionell hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) samt IHC. Det förväntas att de olika tillväxtmönstren för enskilda cellinjer kommer att leda till varierande rumsliga arrangemang på byggnadsställningar, inklusive olika grader av penetration i ställningen och cellkluster. Ställningarna var formalinfixerade, paraffininbäddade och skurna i 5 mm sektioner (figur 9A), vilket förberedde ställningarna för flera visualiseringstekniker, inklusive histologisk färgning och IHC.

Rutinmässig H&E-färgning applicerades på Kelly-, KellyCis83- och IMR32-celler odlade på kollagenbaserade strukturer dag 1, 7 och 14 (Figur 9B). Detta möjliggjorde visualisering av cellernas rumsliga orientering på två kollagenbaserade ställningar under en 14-dagarsperiod. Cisplatinkänsliga Kelly-celler och resistenta KellyCis83-celler odlades på både Coll-I-nHA-strukturer (Figur 9B, i) och Coll-I-GAG-strukturer (Figur 9B, ii). I överensstämmelse med tidigare publicerade data växte KellyCis83-celler i högre takt och infiltrerade djupare in i båda strukturkompositionerna än den mindre invasiva Kelly-cellinjen. H&E-färgningen av en annan neuroblastomcellinje, IMR32, odlad på Coll-I-nHA visar ett kontrasterande tillväxtmönster (Figur 9B, iii). Denna cellinje växte i stora, tätt packade kluster på kollagenställningarna under 14-dagarsperioden. Ljusfältskonfokalmikroskopi kan användas för att visualisera den porösa arkitekturen hos kollagenbaserade strukturer (Figur 9C) på grund av autofluorescensen hos kollagenfibrer.

Vi färgade celler med falloidin som riktar sig mot cytoskelettaktin och den nukleära motfärgen, 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), för att övervaka specifika cellegenskaper under hela den experimentella tidslinjen. Ett överflöd av aktin observerades i Kelly- och KellyCis83-celler på Coll-I-GAG-strukturer med denna teknik (Figur 9D). Dessa resultat visar hur flera avbildningstekniker kan användas för att härleda rumsligt upplöst information från neuroblastomceller som odlas på byggnadsställningar med hjälp av detta protokoll. Denna karakterisering av celltillväxtmönster på kollagenbaserade strukturer under en given period kommer att förbättra förståelsen och tolkningen av alla nedströms biokemiska analyser.

Proteinuttryck hos celler odlade på kollagenbaserade strukturer kan analyseras för att jämföra cellulär aktivitet med in vivo-scenarier . Tidigare publicerade data undersökte uttrycket av kromogranin A (CgA) som en surrogatutsöndrad markör för neuroblastom av KellyLuc- och KellyCis83Luc-celler odlade i cellmonolager samt på Coll-I-nHA- och Coll-I-GAG-strukturer (Figur 10). CgA bedömdes i det konditionerade mediet med hjälp av en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) (Figur 10A). CgA utsöndras i högre grad i den mer aggressiva kemoresistenta KellyCis83-cellinjen än i Kelly (Figur 10B,C). Detta var signifikant på dag 7 på både Coll-I-GAG och Coll-I-nHA scaffolds (P<0.05), medan det inte fanns någon signifikant skillnad vid denna tidpunkt för celler odlade som ett monolager med konventionell 2D-odling.

Dessa resultat belyser också den begränsade experimentella tidslinjen när man odlar celler i ett monolager, med endast 7 dagars tillväxt som visar sig vara möjlig innan celler når sammanflöde. Tillväxten av celler på byggnadsställningar övervinner denna begränsning eftersom de kan bibehållas under en längre period under mer fysiologiskt relevanta förhållanden. Ovanstående kombination av tekniker för att samla in information om cellviabilitet, DNA-innehåll, cellulär morfologi och rumslig placering och uttrycksprofiler underlättar bedömningen av tillväxten av neuroblastomceller på en rad kollagenbaserade byggnadsställningar. Detta protokoll kan också enkelt anpassas för att uppfylla specifika experimentella krav och önskade applikationer.

Figure 6
Figur 6: Analys av cellviabilitet. A) Allmän procedur för att mäta viaabiliteten hos neuroblastomceller på kollagenbaserade strukturer med hjälp av en kolorimetrisk cellviabilitetsanalys. Inkubationstiden måste optimeras för varje ny cellinje, med hänvisning till tillverkarens riktlinjer. (B) Procentuell minskning av cellviabilitetsreagens av KellyLuc- och IMR32-celler odlade på Coll-I-nHA-strukturer vid fyra olika initiala såddtätheter, mätt på dag 1, 7 och 14. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar med felstaplar som representerade standardavvikelsen. Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Cellviabilitet efter såddtäthet för celler som odlats på Coll-I-nHA under en 14-dagarsperiod . a) KellyLuc. (B) IMR32. Namngivna cellnummer hänvisar till den initiala cellsåddstätheten på ställningarna på dag 0. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar, vilket indikerades med tre punkter, med staplar som representerar medelvärdet. Envägs ANOVA med multipla jämförelser användes för att detektera signifikanta skillnader i % cellviabilitetsreagensreduktion över de tre tidpunkterna, noterade på graferna (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; ANOVA = variansanalys; ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Kvantifiering av DNA extraherat från celler i byggnadsställningar . (A) Process för kvantifiering av dsDNA från celler odlade på kollagenbaserade strukturer med hjälp av en fluorescerande dsDNA-färgning. (B) Cellantal från DNA-kvantifieringsanalys efter såddtäthet för KellyLuc- och IMR32-celler odlade på Coll-I-nHA under en 14-dagarsperiod. Namngivna cellnummer hänvisar till den initiala cellsåddstätheten på ställningar på dag 0. Proverna bedömdes i biologiskt tre exemplar, vilket indikerades med tre punkter, med staplar som representerar medelvärdet. Envägs ANOVA med multipla jämförelser användes för att detektera signifikanta skillnader i cellantal över de tre tidpunkterna, noterade på graferna (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; dsDNA = dubbelsträngat DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variansanalys; ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Vävnadsbearbetningssteg för immunhistokemisk analys av stödstrukturer . (A) Schematisk framställning av protokollet för bearbetning av ställningar för bildanalys. Denna process möjliggör rutinmässig histologisk färgning och specifik antikroppssondering med hjälp av primära antikroppar och fluorescerande märkta sekundära antikroppar. (B) Representativa bilder av tre neuroblastomcellinjer som utsatts för H&E-färgning. H&E-bilder tas dag 1, 7, 14 för att övervaka tillväxtmönster under experimentets tidsförlopp. Skalstapel = 200 μm. Streckade fyrkanter representerar det område som valdes för inzoomade 20x-bilder i den nedre vänstra kanten. Skalstapel = 20 μm. (i och ii) H&E av Kelly och KellyCis83 neuroblastomcellinjer (övre respektive nedre paneler) på två typer av kollagenbaserade ställningar. (iii) H&E av IMR32-cellinje, som representerar klustrad cellulär tillväxt på Coll-I-nHA-ställningen. (C) Representativ bild av Kelly-cellinjen, utsatt för ljusfältskonfokalmikroskopi. Kollagenautofluorescensen möjliggör visualisering av den porösa ställningen. 10x skalstapel = 200 μm, 20x skalstapel = 20 μm. (D) Representativ bild av inbäddade ställningar följt av analys av IHC med falloidin och DAPI vid 10x förstoring, skalstapel = 200 μm. Mindre inre rutor representerar inzoomade bilder (20x), skalstreck = 20 μm. Förkortningar: nHA = nanohydroxiapatit; Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagenställningar kompletterade med kondroitin-6-sulfat; H&E = hematoxylin och eosin; IHC = immunhistokemi; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Proteinuttryck av neuroblastomceller odlade på 3D-kollagenbaserade strukturer jämfört med 2D-plast. (A) En schematisk bild av hur CgA ELISA utfördes på betingade medier av celler odlade på 2D-plast eller 3D-kollagenbaserade byggnadsställningar. (B) CgA-proteinuttrycksnivåer tagna från konditionerade medier i celler som odlats på ett 2D-plastmonolager. Eftersom cellerna nådde sammanflöde efter 7 dagar var 14-dagarstidpunkten inte läsbar. Vid dag 7 på plast fanns det ingen signifikant skillnad i CgA-nivåer mellan Kelly- och KellyCis83-cellinjer. CgA ELISA utförs med konditionerade medier av celler som odlats på kollagenbaserade strukturer under 14 dagar i följd. På dag 7, på båda kollagenställningarna, är CgA-nivåerna högre i den mer aggressiva KellyCis83-cellinjen, vilket belyser mer fysiologiskt relevanta nivåer av CgA i 3D-matris jämfört med 2D-monolager. Denna siffra har modifierats från Curtin et al.17. Förkortningar: 3D = tredimensionell; 2D = tvådimensionell; CgA = kromogranin A; ELISA = enzymkopplad immunadsorberande analys; nHA = nanohydroxiapatit, Coll-I-nHA = kollagenställningar kompletterade med nHA; GAG = glykosaminoglykan; Coll-I-GAG = kollagenställningar kompletterade med kondroitin-6-sulfat; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbensidin, HRP = pepparrotsperoxidas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

3D-modellen av scaffold-cancerceller har visat sig vara ett värdefullt och mångsidigt verktyg för att få mekanistisk insikt i neuroblastomcellers tillväxt, livsduglighet och infiltration av celler i en förenklad TME32. Den 3D-neuroblastommodell som beskrivs här efterliknar den minimala TME-metoden och ger mer fysiologiskt relevanta data än en 2D-monolagerodling. En stor nackdel med 3D-cellodling är ökad experimentell komplexitet och längre tidsramar. Här beskrivs ett optimerat protokoll för sådd, tillväxt och underhåll av neuroblastomceller på kollagenbaserade strukturer följt av nedströmsanalyser och applikationer, vilket ger robust karakterisering av celltillväxt. Vi strävade efter att få insikter om den optimala cellsåddstätheten för strukturerna för att skapa en förutsägbar och kontrollerbar miljö för att utvärdera läkemedelsbehandlingar mot cancer i ett snabbt 14-dagars experimentellt fönster. Kombinationen av alla dessa beskrivna enkla protokoll ger en väl avrundad bedömning av neuroblastomcelltillväxt i det ställningsbaserade in vitro-odlingssystemet.

De kritiska punkterna i protokolluppsättningen har betonats för att göra det möjligt för forskare att snabbt fastställa detsamma i sina laboratorier. Till exempel tillåter de angivna inkubationstiderna för bättre prestanda för den kolorimetriska cellviabilitetsanalysen djupare penetration av reagenset i ställningens porer för att nå alla celler. Dessutom är den fluorescerande dsDNA-färgningstekniken robust och okomplicerad; DNA-frisättning från byggnadsställningarna kräver dock kraftig celllys eftersom cellerna är "fångade" i kollagenfibrerna.

Med hjälp av den enkla DNA-kvantifieringsanalysen som beskrivs kan vi identifiera den logaritmiska tillväxtfasen på kollagenbaserade strukturer för screening av cancerläkemedel med hjälp av denna modell. I den beskrivna experimentella miljön användes 4 initiala cellsåddstätheter med en total 14-dagarsperiod och analystidpunkter på dag 1, 7 och 14. Vi identifierade att KellyLuc-celler sådda vid 4 × 105 celler/byggnadsställning har det mest signifikant aktiva proliferationsfönstret mellan dag 7 och 14. Dessa tillväxtdata i logfasen kommer att möjliggöra en tillförlitlig tolkning av olika cellcytotoxicitetsexperiment. Det eliminerar spekulationer om eventuell nedgång i tillväxt eller celldöd till följd av undertryckt tillväxt på den 3D-porösa plattformen snarare än från läkemedelstoxicitet. Cellviabilitet är också en allmänt använd bedömning av lämpligheten hos 3D-plattformar för att stödja tillväxten av olika celltyper33,34. Även om det finns många analyser för att mäta cellviabilitet, inklusive levande/död färgning, ATP-mätning, proliferationsanalyser, fann vi att användningen av Alamar Blue-kolorimetrisk cellviabilitetsanalys var en enkel och effektiv teknik för att stödja DNA-kvantifieringsdata.

Den kombinerade användningen av DNA-kvantifiering och cellviabilitet gav kompletterande bevis för att den optimala densiteten för fröceller på ställningen i genomsnitt är 2-4 × 105 celler/byggnadsställning. Detta protokoll kan dock enkelt anpassas för att uppfylla olika experimentella tidsramar, analystidpunkter och nedströmsapplikationer. Även om detta protokoll beskriver utvärderingen av monokulturcelltillväxt av neuroblastomceller på byggnadsställningar, är ställningarna lätt att ändra för användning som en plattform för samodling, beskriven av do Amaral et al., som använde kollagen-GAG-ställningar för att samodla keratinocyter och fibroblaster i en undersökning av sårläkning35.

Den beskrivna 3D-modellen möjliggör visualisering av celltillväxt och infiltration med hjälp av olika välkända tekniker, såsom immunofluorescens och standard H&E. Det är viktigt att visualisera cellerna tillsammans med karakteriseringen av tillväxt med hjälp av biokemiska analyser på grund av mångfalden av cellmorfologi och tillväxtmönster på byggnadsställningar. Att förstå tillväxtmönstret kan ge insikter om tillväxtbeteende och framtida respons på cancerläkemedel. Till exempel ger IMR32-tillväxt med hjälp av DNA-kvantifiering liknande mönster som Kelly, även om IMR32 vid visualisering med H&E växer i större kluster än Kelly, som uppvisade mer spridd tillväxt (figur 9). Dessa varierande tillväxtmönster för cellinjer i scaffolds återspeglar det kliniska scenariot för tumörheterogenitet. Att undersöka läkemedelssvar mot cancer med hjälp av en panel av cellinjer med olika morfologier i 3D-strukturer kommer att öka det prediktiva värdet för patientsvar på samma läkemedel.

Detektion av gen- eller proteinuttryck kan också utföras med andra metoder som RT-qPCR eller ELISA om proteinet av intresse utsöndras. En surrogatmarkör för neuroblastomprogression, kromogranin A (CgA)36, användes för att ytterligare karakterisera neuroblastomcelltillväxt i 3D. Som beskrivits i tidigare arbete17 ökade CgA-utsöndringen när cellerna förökade sig (Figur 10). Även om cellodling i monolager inte kunde fånga denna ökning, eftersom proliferation innebar att cellerna nådde fullt sammanflöde i odlingsskålarna, möjliggjorde användningen av 3D-kollagenställningarna långvarig bedömning av CgA-sekretionen.

Denna 3D in vitro-modell kanske inte är lämplig för alla forskningsfrågor för att studera neuroblastombiologi och svar på terapier. En av begränsningarna är ojämn cellpenetration i byggnadsställningar och bildandet av cellkluster av varierande storlek, vilket beror på en given cellinje och kan leda till okontrollerbar diffusion av näringsämnen och testläkemedel. Denna egenskap påverkar robustheten i terapeutisk screening. Men trots denna begränsning är det viktigt att tänka på att inhemska tumörer också är heterogena i storlek och cancercellsfördelning och innehåller många andra celltyper i tumörvävnaden. För att övervinna denna begränsning föreslår vi att man använder varje cellbefolkad struktur som en enda mikrovävnad för vilken följande parametrar kommer att optimeras: (a) inkubationstider för cellviabilitetsreagenset att nå cellerna och cellklustren, och (b) lysering av cellerna i Triton X-100-buffert genom förbehandling av celler på strukturer med en vävnadslysare för att frigöra DNA från cellerna som finns djupt i ställningen.

En annan teknisk begränsning med detta protokoll är bristen på mekanisk testning av varje parti av nytillverkade ställningar för denna modell. Men genom att använda den robusta tillverkningsprocessen för ställningarna, som har karakteriserats utförligt i förhållande till fysikaliska och kemiska egenskaper hos ställningarna, såsom tryck- och dragmodul, porositet och visuell porstruktur och homogenitet, säkerställs att ställningens kvaliteter bibehålls genom batcher 21,24,27,30,37.

Sammanfattningsvis presenterar denna artikel en serie enkla metoder för analys av cellulär tillväxt på kollagenbaserade byggnadsställningar. Både den experimentella tidslinjen och analyspunkterna kan bytas ut beroende på de specifika forskningsfrågorna. Detta protokoll är också anpassningsbart till andra celltyper. Resultaten som visas ovan ger belägg för hur denna sammanställning av metoder gav insikt i den optimala såddtätheten för olika neuroblastomcellinjer för att skapa kontinuerlig tillväxt under 14 dagar. Sammanslagningen av resultat som erhållits från alla metoder i detta protokoll ger en överlägsen förståelse för celltillväxt inom 3D-kollagenmatrisen. Framtida användning av denna modell kommer sannolikt att involvera samodlingssystem som är specifika för neuroblastomet TME och testning av olika nya läkemedel mot cancer.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) och Neuroblastoma UK. Illustrationerna är skapade med hjälp av BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
IMR-32 ATCC CCL-127
Kelly ECACC 82110411
KellyCis83 Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) - Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired
SH-SY5Y ATCC CRL-2266
Disposable
0.22 µm syringe filter Millex SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 120.086
100 mL sterile Pot Starstedt -
10 mL plastic pipette Cellstar 607 180
15 mL Falcon tube Starstedt 62.554.502
25 mL plastic pipette Cellstar 760 180
50 mL Falcon tube Starstedt 62.547.254
5 mL plastic pipette Cellstar 606 180
6 mm Biopsy punches Kai Medical BP-60F
Aluminium foil - -
Cover Slip Menzel-Glaser -
HYPERflask Corning CLS10030
Microscope slides Thermo Scientific J1840AMNT
Opaque black 96-well plate Costar 3915
Sterile P10 tips Starlab S1121-3810
Sterile P1000 tips Starlab S1122-1830
Sterile P20 tips Starlab S1123-1810
Sterile P200 tips Starlab S1120-8810
T-175 (175 cm2 flask) Sarstedt 83.3912
T-75 (75 cm2 flask) Sarstedt 83.3911.302
Translucent clear 96 well plate Cellstar 655180
Translucent non-adherent 24 well plates Cellstar 83.3922.500
Equipment
Autoclave Astell -
Automatic tissue processor Leica TP1020
Centrifuge 5804 Eppendorf -
Hemocytometer Hausser  Scientific -
Incubator ThermoScientific -
Microtome Leica RM2255
Oven Memmert Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P10 pipette Gilson
P100 pipette Gilson
P1000 pipette Gilson
P20 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P200 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Paraffin section flotation bath Electrothermal MH8517 Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Pipette electronic dispenser Corning StripipetterUltra Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Plate cooler Leica EG1140C Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Refrigerator -20 °C Liebherr -
Refrigerator -80 °C Liebherr -
Refrigerator 4 °C Liebherr -
Seesaw Rocker DLAb SK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V Platereader PerkinElmer 1420
Tissue culture hood/Laminar flow hood GMI 8038-30-1044
Tissue Lyser Qiagen TissueLyser LT
Tweezers - -
Water bath Grant -
Wax embedder Leica EG1140H
Materials
1 L Water Adrona - Biosciences 568
1% Triton-X Sigma Aldrich 9002-93-1
10x PBS tablets Sigma Aldrich P4417-100TAB
37% paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Alamar Blue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1100
Collagen- glycosaminoglycan scaffold Tissue engineering research group (TERG)
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold Tissue engineering research group (TERG)
dH20 Adrona - Biosciences 568
Eosin Sigma-Aldrich E4009 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOH Sigma-Aldrich 1.00983.2500 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12 Gibco 21765-029
FBS Gibco 10270-106
Hemaytoxylin Sigma-Aldrich HHS32-1L
L-Glutamine Gibco 25030-024
MEM Gibco 21090-022
miRNA easy Kit Qiagen 217004
MNEAA’s Gibco 11140-035
Penicillin/streptomycin Gibco 015140-122
Qiazol Qiagen 79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
RPMI Gibco 21875-034
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S7795-500G
Tissue embedding Medium Sigma A6330-4LB
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Software
Excel - Excel 2016
ImageJ - -
Prism - Version 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11 (2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38 (2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Tags

Tredimensionell In vitro biomimetisk modell neuroblastom kollagenbaserade byggnadsställningar barncancer tumörvävnad extracellulär matris (ECM) sjukdomsprogression patientprognos terapeutiskt svar neuroblastomcellinjer nanohydroxiapatit (nHA) glykosaminoglykaner (GAG) ben och benmärg metastaserande platser porös struktur cellfäste proliferation migration cellkluster terapier in vivo-situation ställningsbaserat odlingssystem tvådimensionell (2D) cell Odling DNA-kvantifiering cellviabilitet

Erratum

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Tredimensionell <em>in vitro</em> biomimetisk modell av neuroblastom med hjälp av kollagenbaserade strukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly,… More

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly, G., O’Brien, F. J., Piskareva, O. Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds. J. Vis. Exp. (173), e62627, doi:10.3791/62627 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter