Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62627
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 4, 3,5,6, 1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 7Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen's Green, Dublin 2, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland, 7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit artikel somt de stappen op die nodig zijn om neuroblastoomcellijnen te zaaien op eerder beschreven driedimensionale op collageen gebaseerde steigers, de celgroei gedurende een vooraf bepaald tijdsbestek te behouden en steigers op te halen voor verschillende celgroei- en celgedragsanalyses en stroomafwaartse toepassingen, aanpasbaar om te voldoen aan een reeks experimentele doelen.

Abstract

Neuroblastoom is de meest voorkomende extracraniële solide tumor bij kinderen, goed voor 15% van de totale sterfgevallen door kinderkanker. Het oorspronkelijke tumorweefsel is een complexe driedimensionale (3D) micro-omgeving met lagen kankercellen en niet-kankercellen omgeven door een extracellulaire matrix (ECM). De ECM biedt fysieke en biologische ondersteuning en draagt bij aan ziekteprogressie, prognose van de patiënt en therapeutische respons.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenstellen van een op 3D-steigers gebaseerd systeem om de micro-omgeving van neuroblastoom na te bootsen met behulp van neuroblastoomcellijnen en op collageen gebaseerde steigers. De steigers worden aangevuld met nanohydroxyapatiet (nHA) of glycosaminoglycanen (GAG's), die van nature in hoge concentraties worden aangetroffen in het bot en het beenmerg, de meest voorkomende metastatische plaatsen van neuroblastoom. De 3D poreuze structuur van deze steigers maakt de hechting, proliferatie en migratie van neuroblastoomcellen en de vorming van celclusters mogelijk. In deze 3D-matrix is de celrespons op therapieën meer een afspiegeling van de in vivo situatie.

Het op steigers gebaseerde kweeksysteem kan hogere celdichtheden handhaven dan conventionele tweedimensionale (2D) celkweek. Daarom zijn optimalisatieprotocollen voor het initiële zaaien van celaantallen afhankelijk van de gewenste experimentele tijdschema's. Het model wordt gemonitord door celgroei te beoordelen via DNA-kwantificering, cellevensvatbaarheid via metabole assays en celdistributie binnen de steigers via histologische kleuring.

De toepassingen van dit model omvatten de beoordeling van gen- en eiwitexpressieprofielen en cytotoxiciteitstesten met behulp van conventionele geneesmiddelen en miRNA's. Het 3D-kweeksysteem maakt de nauwkeurige manipulatie van cel- en ECM-componenten mogelijk, waardoor een omgeving wordt gecreëerd die fysiologisch meer lijkt op het oorspronkelijke tumorweefsel. Daarom zal dit 3D in vitro model het begrip van de pathogenese van de ziekte vergroten en de correlatie verbeteren tussen resultaten verkregen in vitro, in vivo in diermodellen en menselijke proefpersonen.

Introduction

Neuroblastoom is een pediatrische kanker van het sympathische zenuwstelsel die ontstaat tijdens de embryonale ontwikkeling of het vroege postnatale leven als gevolg van de transformatie van neurale topcellen1. Het is de meest voorkomende solide extracraniale tumor bij kinderen, die 8% van de maligniteiten vertegenwoordigt die worden gediagnosticeerd bij patiënten jonger dan 15 jaar en is verantwoordelijk voor 15% van alle sterfgevallen door kanker bij kinderen. De ziekte vertoont zeer heterogeen klinisch gedrag als gevolg van specifieke chromosomale, genetische en epigenetische veranderingen, en histopathologische kenmerken.

Deze veranderingen dragen bij aan de agressiviteit van neuroblastoom en slechte resultaten bij pediatrische patiënten. Vandaar dat de huidige therapieën op de lange termijn niet effectief blijken te zijn voor bijna 80% van de patiënten met de klinisch agressieve ziekte2, wat benadrukt dat de behandeling voor deze groep patiënten een uitdaging blijft. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de mechanismen van neuroblastoomheterogeniteit en metastasen nog steeds niet volledig worden begrepen. Er wordt nu echter algemeen aangenomen dat de tumormicro-omgeving (TME) een rol speelt bij de progressie van veel kankers; Toch blijft het onderbelicht in neuroblastoom 3,4.

De natuurlijke TME is een complexe 3D-micro-omgeving met kankercellen en niet-kankercellen omgeven door een ECM. De ECM verwijst naar de acellulaire component van een weefsel die structurele en biochemische ondersteuning biedt aan de cellulaire bewoners en bijdraagt aan ziekteprogressie, prognose van de patiënt en therapeutische respons5. Deze bevordering van ziekteprogressie is te wijten aan "dynamische wederkerigheid" of voortdurende bidirectionele communicatie tussen cellen en de ECM 6,7,8. Naarmate kanker vordert, wordt stromaal collageen gereorganiseerd, vaak in lineaire patronen loodrecht op de stroma-kankerinterface, die kankercellen gebruiken als een migratieroute naar metastase 9,10,11.

De belangrijkste componenten van deze natuurlijke functionele biologische steiger zijn een vezelig netwerk van collagenen type I en II en andere eiwitten, waaronder elastine, glycoproteïnen zoals laminine, evenals een reeks proteoglycanen en andere oplosbare componenten12,13. Deze eiwitten van het natuurlijke ECM zijn nu aantrekkelijke natuurlijke biomoleculen geworden voor het ontwikkelen van 3D in vitro modellen3. De toepassing van 3D-steigers voor in vitro celkweek wordt steeds populairder vanwege de grotere fysiologische weergave van de TME in vergelijking met traditionele 2D-monolaagcultuur. De gefabriceerde 3D-steigers helpen bij celhechting, proliferatie, migratie, metabolisme en reactie op stimuli die worden gezien in in vivo biologische systemen.

Het hoofdbestanddeel van deze 3D-steigers is collageen, dat een belangrijke speler is in veel normale biologische processen, waaronder weefselherstel, angiogenese, weefselmorfogenese, celadhesie enmigratie11. Op collageen gebaseerde 3D-matrices hebben hun robuuste functionaliteit getoond om ECM te modelleren, en dienen als een in vitro biomimetische micro-omgeving en tegelijkertijd cel-ECM-interacties mogelijk maken, evenals celmigratie en -invasie. Deze 3D-matrices bieden ook een nauwkeurigere analyse van de celrespons op chemotherapeutische geneesmiddelen dan traditionele 2D- of "platte" cultuur in veel kankermodellen 14,15,16, waaronder neuroblastoom 17,18. Genetische analyse van 3D-celculturen heeft een hogere correlatie met het menselijke weefselprofiel gerapporteerd, zelfs in vergelijking met diermodellen19. Over het algemeen is de hoeksteen van deze 3D-steigers om cellen een geschikte in vitro-omgeving te bieden, die de oorspronkelijke weefselarchitectuur recapituleert en bidirectionele moleculaire overspraak vergemakkelijkt8.

Om de complexiteit van op collageen gebaseerde modellen te vergroten, worden andere gemeenschappelijke ECM-componenten opgenomen in het weefselmanipulatieproces, waardoor meer fysiologisch relevante modellen worden gecreëerd om niche-TME's van verschillende weefsels weer te geven. GAG's, negatief geladen polysacchariden die aanwezig zijn in alle zoogdierweefsels20, vergemakkelijken bijvoorbeeld celhechting, migratie, proliferatie en differentiatie. Chondroïtinesulfaat is een specifiek type GAG dat wordt aangetroffen in het bot en kraakbeen, dat eerder is gebruikt in weefselmanipulatietoepassingen voor botherstel 21,22,23,24,25. Nanohydroxyapatiet (nHA) is het belangrijkste anorganische bestanddeel van de minerale samenstelling van menselijk botweefsel, dat tot 65 gewichtsprocent van het bot uitmaakt26 en wordt daarom veel gebruikt voor botvervanging en -regeneratie27. GAG's en nHA zijn dus aantrekkelijke composieten voor het reconstrueren van de primaire neuroblastoom-ECM en het modelleren van de meest voorkomende metastatische plaatsen van neuroblastoom, beenmerg (70,5%) en bot (55,7%)28.

Scaffolds waarin deze ECM-componenten zijn verwerkt, zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor toepassingen op het gebied van botweefselengineering met uitgebreide analyse van hun biocompatibiliteit, toxiciteit en osteoconductieve en osteoinductieve eigenschappen29,30. Het zijn poreuze, op collageen gebaseerde matrices die worden geproduceerd met behulp van vriesdroogtechnieken om hun fysische en biologische eigenschappen te controleren. De collageensteigers aangevuld met nHA (Coll-I-nHA) of chondroïtine-6-sulfaat (Coll-I-GAG) toonden succes aan bij het nabootsen van de primaire TME bij borstkanker31 en metastase naar bot bij prostaatkanker15 en neuroblastoom17. De vriesdroogtechniek die wordt gebruikt om deze composietsteigers te vervaardigen, levert reproduceerbare homogeniteit in poriegrootte en porositeit op binnen de steigers22,23,24. In het kort wordt een collageenslurry (0,5 gew.%) vervaardigd door fibrillair collageen te mengen met 0,05 M azijnzuur. Voor Coll-I-GAG wordt tijdens het mengen 0,05 gew.% chrondoitine-6-sulfaat geïsoleerd uit haaienkraakbeen toegevoegd aan de collageensuspensie. Voor de composiet Coll-I-nHA-steigers worden hydroxyapatietdeeltjes van nanoformaat gesynthetiseerd zoals eerder beschreven27 en toegevoegd aan de collageensuspensie in een verhouding van 2:1 tot het gewicht van het collageen tijdens het mengproces. Alle steigers worden fysiek verknoopt en gesteriliseerd met behulp van een dehydrothermale behandeling bij 105 °C gedurende 24 uuren 25 minuten. Cilindrische steigers (6 mm diameter, 4 mm hoogte) worden verkregen met behulp van een biopsiepons en kunnen chemisch worden verknoopt met 3 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidehydrochloride en 5,5 mM N-hydroxysuccinimide (EDAC/NHS) in gedestilleerd water (dH2O) om de mechanische eigenschappen van de constructies te verbeteren30. Dit goed geoptimaliseerde productieproces van twee collageensteigers creëert steigers met reproduceerbare mechanische eigenschappen, waaronder poriegrootte, porositeit en stijfheid (kPa). Zowel Coll-I-GAG- als Coll-I-nHA-steigers hebben verschillende fysische eigenschappen, waardoor verschillende omgevingsomstandigheden ontstaan. De eigenschappen van elke steiger worden weergegeven in tabel 1.

Coll-I-GAG Coll-I-nHA
Steiger Grootte
(diameter [mm] x hoogte [mm])		 6 x 4 17 6 x 4 17
Collageenconcentratie (gew. %) 0,5 17 0,5 17
Substraatconcentratie (gew. %)
[op basis van het gewicht van collageen]		 0,05 15,17 200 17
Gemiddelde poriegrootte (mm) 96 22 96 – 120 29
Porositeit (%) 99,5 23 98,9 – 99,4 27
Stijfheid (kPa) 1.5 27 5,5 - 8,63 29

Tabel 1: Overzicht van de mechanische eigenschappen van de twee steigers die zijn gebruikt voor het bestuderen van de biologie van neuroblastoom.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenstellen van een op 3D-steigers gebaseerd systeem om de micro-omgeving van neuroblastoom beter na te bootsen met behulp van neuroblastoomcellijnen en eerder beschreven op collageen gebaseerde steigers aangevuld met nHA (Coll-I-nHA) of chondroïtine-6-sulfaat (Coll-I-GAG). Het protocol omvat stroomafwaartse methoden om de groeimechanismen van de neuroblastoomcellen in een meer fysiologisch relevante omgeving te analyseren met behulp van eerder geoptimaliseerde goedkope methoden die zijn aangepast aan 2D-monolaagkweek Figuur 1.

Figure 1
Figuur 1: Algemene protocolworkflow. (A) Cellen worden tot voldoende aantallen gekweekt, gesplitst, geteld en opnieuw gesuspendeerd in een geschikte hoeveelheid medium. (B) Dit celmateriaal ondergaat vervolgens seriële verdunning om in totaal 4 celsuspensies van verschillende dichtheden te bereiden. (C) Op collageen gebaseerde steigers worden steriel geplateerd in niet-klevende platen met 24 putjes, en (D) 20 μL celsuspensie wordt toegevoegd aan het midden van elke steiger en gedurende 3-5 uur laten incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid. (E) Volledig groeimedium (1 ml) wordt vervolgens langzaam aan elke steiger toegevoegd en de platen worden teruggeplaatst in de incubator om celgroei gedurende het gewenste tijdsbestek mogelijk te maken. (F) Op elk vooraf bepaald tijdstip worden verschillende steigers opgehaald voor beoordeling van de levensvatbaarheid en groei van cellen, analyse van genexpressie en histologische kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Experimenteel ontwerp

OPMERKING: Het aantal steigers en cellen dat nodig is voor elk experiment is afhankelijk van de schaal van het experiment en kan worden berekend met behulp van de tools in deze sectie over experimenteel ontwerp.

  1. Aantal benodigde steigers
    1. Bepaal de algemene experimentele tijdlijn en beoordelingsintervallen voor veranderingen in de celbiologie (bijv. celgroei en metabolisme).
      OPMERKING: Het experimentele tijdsbestek is bijvoorbeeld 14 dagen, met elke 7 dagen een beoordeling van de celgroei. De experimentele tijdstippen zijn dus dag 1, 7 en 14, wat een totaal van 3 tijdstippen oplevert.
    2. Bepaal vervolgens het aantal experimentele toepassingen dat op elk tijdstip moet worden toegepast. Probeer op elk moment dezelfde analyses uit te voeren om de veranderingen te monitoren.
      OPMERKING: Typische analyses van celgroei op steigers omvatten cellevensvatbaarheidstests, DNA-kwantificering, histologische kleuring en beeldvorming, en genexpressieanalyse. Deze zullen in hoofdstuk 5 verder worden besproken.
    3. Beslis wanneer dezelfde steiger moet worden gebruikt voor meerdere stroomafwaartse toepassingen, bijv. na beoordeling van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een geschikte test, de steiger hergebruiken voor DNA/RNA-isolatie (besproken in 5.1.11).
    4. Houd minimaal 3 biologische replicaten voor elke toepassing, bijv. 3 steigers voor cellevensvatbaarheid en DNA-kwantificering, 3 voor histologie en 3 voor genexpressie-analyse. Aangezien dit gelijk is aan 9 steigers per tijdstip, moet u 27 steigers gebruiken voor 3 tijdstippen.
    5. Vermenigvuldig ten slotte dit aantal met het aantal experimentele parameters of omstandigheden (bijv. beoordeling van meerdere cellijnen, initiële zaaidichtheden, steigersamenstellingen).
      OPMERKING: In dit protocol werden 4 verschillende initiële zaaidichtheden beoordeeld voor één cellijn, wat resulteerde in 108 (27 steigers x 4 voorwaarden) steigers die nodig waren. Om rekening te houden met menselijke fouten en extra dekking te geven, voegt u ~10% toe aan dit aantal, bijv. als er 108 steigers nodig zijn, bereid dan 120 steigers voor.
  2. Aantal benodigde cellen
    OPMERKING: Een volume van 20 μL celsuspensie wordt aanbevolen voor het zaaien van cellen op een cilindrische steiger (diameter 6 mm, hoogte 4 mm) op dag 0. Het aantal cellen per deze 20 μL celsuspensie wordt aangepast volgens de experimentele opzet, berekend in punt 1.1. Een gebruikelijke initiële zaaidichtheid is 2 × 105 cellen per 20 μL, gebruikt als voorbeeld voor het onderstaande protocol.
    1. Om de totale hoeveelheid cellen te berekenen die nodig is voor het experiment, vermenigvuldigt u de eerste 2 × 105 cellen per 20 μL met het aantal benodigde steigers.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, 30 steigers vermenigvuldigd met 20 μL geeft een totaal volume van 600 μL. Als elke steiger 2 × 10 5 cellen nodig heeft, bevat 600 μL suspensie in totaal 6 × 10 6 cellen (2 × 105 × 30), wat een eindbehoefte van 6 × 106 cellen in 600 μL oplevert. Het aantal experimentele parameters bepaalt het totale aantal benodigde cellen. Dit protocol schetst daarom de celkweek met behulp van een meerlagige celkweekkolf, die hetzelfde aantal cellen aankan als 10 traditionele kolven van 175cm2.

2. Voorbereiding van steigers op basis van collageen

OPMERKING: Coll-I-nHA en Coll-I-GAG cilindrische steigers (diameter 6 mm, hoogte 4 mm) worden bereid met behulp van vastgestelde methoden 15,21,27. Eenmaal chemisch verknoopt volgens eerder gepubliceerde methoden17, moeten de steigers binnen 1 week worden gebruikt.

  1. Zorg er na de fabricage van de steigers met de gewenste mechanische eigenschappen voor dat de steigers volledig gehydrateerd zijn en grondig worden gewassen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: Dit duurt over het algemeen ~12 uur na het vernetten van de steigers en kan worden uitgevoerd in weefselkweekafvalcontainers van 100 ml bij 4 °C, met een maximum van 50 steigers per container en 2 ml PBS per steiger.
  2. Bewaar de steigers in PBS bij 4 °C tot gebruik.

3. Vermeerder neuroblastoomcellen in een meerlagige celkweekkolf

OPMERKING: De optimale zaaidichtheid voor de meerlagenkolf zal variëren. Voor de kolf die in dit experiment wordt gebruikt, is de optimale dichtheid volgens de instructies van de fabrikant 1 × 107 cellen. Alvorens de meerlagenkolf te zaaien, vermeerdert u de cellen tot een dichtheid van 1 × 107 cellen of hoger in een geschikte weefselkweekkolf (bv. een weefselkweekkolf T175 cm2 ). Om cellen in de meerlagige kolf te zaaien (sectie 3.1), kweekt u ze tot 70-80% samenvloeit, oogst en telt u het aantal cellen per ml, verwijzend naar de stappen 3.2.16-3.2.20 voor het uitvoeren van het celgetal. Zodra de celsuspensie is geteld, gaat u onmiddellijk over tot het zaaien van de meerlagenkolf. Celkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om de steriliteit te behouden.

  1. Zaaien van de meerlagige celkweekkolf
    1. Verwarm 550 ml volledig groeimedium (varieert afhankelijk van de gebruikte cellijn) en 100 ml steriele PBS gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C.
    2. Bereken met behulp van de geoogste celsuspensie het vereiste volume van de celsuspensie dat nodig is om de optimale zaaidichtheid van 1 × 107 cellen te bereiken met behulp van vergelijking (1), waarbij WANT verwijst naar het aantal cellen dat nodig is voor het zaaien van de meerlagige kolf, en HAVE verwijst naar het aantal cellen/ml in de celsuspensie:
      Equation 1(1)
      bijvoorbeeld. Equation 2
    3. Voeg het benodigde volume van de celsuspensie toe aan 100 ml van het voorverwarmde groeimedium.
    4. Neem een nieuwe meerlagige kolf in de kap, verwijder de dop en houd de kolf in een hoek van 60°. Pipetteer langzaam alle 100 ml van de celsuspensie in de kolf, langs de schuine kant van de hals. Sluit de kolf af en leg hem op zijn kant zodat de cellen gelijkmatig over de lagen kunnen worden verdeeld.
    5. Voeg onder een hoek van 60° 400 ml van het voorverwarmde groeimedium toe aan de meerlagenkolf door langzaam langs de schuine kant van de hals te gieten of te pipetteren. Als de hals vol raakt, zet u de kolf weer rechtop, of sluit u de kolf af en legt u deze op zijn kant voordat u weer gaat schenken.
      NOTITIE: Giet langzaam om overmatige luchtbelvorming te voorkomen. Tik zachtjes rechtop op de kolf om alle belletjes naar boven te laten komen en verwijder ze met een pipet van 10 ml. Zorg ervoor dat de kolf tot aan de onderste draad van de hals is gevuld; Voeg indien nodig meer medium toe om dit te bereiken.
    6. Sluit de meerlagenkolf af en broed deze uit met de schuine hals naar beneden gericht bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    7. Controleer de groei elke 2-3 dagen op samenvloeiing. Om de samenvloeiing van de onderste twee lagen van de meerlagige kolf te controleren, bekijkt u ze onder een 4x objectieflens van een omgekeerde microscoop.
      OPMERKING: Wanneer de 10-laagse kolf is bezaaid met 1 × 107 neuroblastoomcellen, duurt het doorgaans een week voordat de 10-laagse kolf samenvloeit, hoewel dit kan variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn.
  2. Routineonderhoud van de cellen in de meerlagenkolf
    1. Verwarm 550 ml volledig groeimedium (varieert afhankelijk van de gebruikte cellijn), 50-100 ml trypsine en 300 ml steriele PBS voor in een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten.
    2. Controleer de meerlagige kolf op 70-80% samenvloeiing.
    3. Plaats de meerlaagse kolf in een laminaire stroomkap en gooi het verbruikte medium uit de kolf door te gieten. Kantel de kolf in eerste instantie zodat het medium over de luchtdam in een afvalcontainer stroomt. Draai tijdens het schenken de kolf 180° totdat het medium langs de schuine hals van de kolf stroomt. Draai de kolf heen en weer langs deze as om eventuele resterende vloeistof te verwijderen.
    4. Was de cellen door 100 ml voorverwarmde steriele PBS langzaam in de schuine hals toe te voegen. Sluit de kolf af, leg hem op zijn kant om een gelijkmatige verdeling van PBS mogelijk te maken en draai de kolf heen en weer om de cellen te wassen.
    5. Gooi de PBS-was op dezelfde manier weg als 3.2.3. Herhaal de wasstappen.
    6. Verdun 50 ml van de voorverwarmde trypsine in 50 ml voorverwarmde steriele PBS. Voeg 100 ml verdunde trypsineoplossing toe aan de meerlagige kolf, dop en plaats de kolf op zijn kant om een gelijkmatige verdeling van de trypsine mogelijk te maken. Als de cellijn sterk hecht is, gebruik dan 100 ml onverdunde trypsine.
    7. Incubeer de kolf gedurende 2-5 minuten bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid, waarbij u de celloslating onder de microscoop controleert. Tik indien nodig stevig op de kolf om het losmaken te vergemakkelijken of plaats hem nog een minuut terug in de couveuse.
    8. Plaats de meerlagenkolf in een laminaire stroomkap en neutraliseer de trypsine met 100 ml groeimedium. Sluit de kolf af, leg hem op zijn kant en schommel heen en weer om volledige neutralisatie te garanderen.
    9. Giet de geneutraliseerde celsuspensie af in 4 x 50 ml conische centrifugebuisjes.
      OPMERKING: Als een volledige celoogst vereist is, was de meerlagige kolf dan opnieuw met 100 ml steriele PBS en giet deze af in 2 centrifugebuisjes van 50 ml.
    10. Centrifugeer de celsuspensie in centrifugebuisjes van 50 ml bij 340 × g gedurende 3-4 minuten om de cellen te pelleteren.
    11. Plaats de centrifugebuisjes terug in de laminaire stromingskap en gooi voorzichtig zoveel mogelijk supernatant van elke pellet weg.
      NOTITIE: De pellet zal groot en relatief los zijn en kan daarom gemakkelijk worden verstoord.
    12. Voeg 1-5 ml groeimedium toe aan elke pellet en resuspendeer deze door meerdere keren op en neer te pipetteren.
    13. Doe de 4 geresuspendeerde pellets samen in een centrifugebuis van 50 ml, meng ze grondig met de pipet en noteer het totale volume.
    14. Maak een geschikte verdunning van de celsuspensie voor het tellen van cellen, zodat elk buitenste vierkant op de hemocytometer 30-100 cellen bevat.
      OPMERKING: Een geschikte startverdunning is 1:100; pipetteer hiervoor 10 μL van de celsuspensie in een verse conische centrifugebuis van 15 ml en verdun deze met 990 μL steriele PBS. Pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer om goed te mengen.
    15. Plaats tijdens het tellen een centrifugebuisje van 50 ml met daarin de celvoorraad in de incubator.
    16. Neem een schone hemocytometer en plaats een schoon dekglaasje over het rooster, zoals weergegeven in figuur 2.
    17. Pipetteer 10 μl van de verdunde celsuspensie in de hemocytometerkamer. Als de kamer vol raakt voordat alle 10 μL is afgegeven, stop dan met pipetteren.
    18. Plaats de hemocytometer onder het 4x objectief van een lichtmicroscoop. Pas de grove en fijne focus aan om de cellen te visualiseren.
    19. Tel het aantal cellen in de vier buitenste hoekvierkanten van de kamer, zoals gemarkeerd in figuur 2. Tel de vier tellingen bij elkaar op en deel door 4 om het gemiddelde aantal cellen per vierkant te berekenen.

Figure 2
Figuur 2: Celtelling met behulp van een hemocytometer. Tien microliter celsuspensie wordt toegevoegd aan de hemocytometer onder het dekglaasje. De kamer wordt vervolgens onder de 4x objectieflens van een microscoop geplaatst en het aantal cellen in de vier buitenste hoeken van het raster wordt geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal met de verdunningsfactor (bijv. 100) en vermenigvuldig dit aantal met 10.000 om het aantal cellen per ml te verkrijgen met behulp van vergelijking (2).
    Equation 3 (2)
  2. Bereken het totale aantal cellen in de stockoplossing door te vermenigvuldigen met het totale volume van de celstock (bijv. als de 4 geresuspendeerde pellets een oplossing van 20 ml hebben gemaakt, vermenigvuldig dan de cellen/ml met 20).
  3. Om de meerlagenkolf in stand te houden, berekent u aan de hand van vergelijking (1) in stap 3.1.2 het volume van de celvoorraad dat nodig is om 1 × 107 cellen terug in de kolf te zaaien en voert u de stappen 3.1.3-3.1.6 uit om de kolf opnieuw in te zaaien. Als u klaar bent om de steigers te zaaien, gaat u verder met het volgende gedeelte.

4. Zaad neuroblastoomcellen op steigers

  1. Bereid de suspensie van de voorraadcellen voor
    OPMERKING: Dit protocol schetst de stappen voor het creëren van vier verschillende zaaidichtheden van neuroblastoomcellen, met een vermenigvuldigingsfactor van 2 tussen elke dichtheid. Een seriële verdunning zal daarom worden gebruikt om nog drie celsuspensies uit de stocksuspensie te maken. Celkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om de steriliteit te behouden.
    1. Gebruik vergelijking (3) om het volume van de cellen te berekenen dat nodig is op basis van het totale aantal cellen in de meerlagenkolf (geteld in punt 3.2.19) om de eerste zaaidichtheid of de suspensie van de celvoorraad voor te bereiden.
      Equation 4(3)
      OPMERKING: Als de hoogste zaaidichtheid bijvoorbeeld 6 × 10 5 cellen per steiger is die nodig is voor 30 steigers, waarbij elke steiger 20 μL celsuspensie krijgt, zou de standaardcelsuspensie 1,8 × 107 cellen (6 × 105 cellen × 30 steigers) nodig hebben in een totaal volume van 600 μL (20 μL × 30 steigers).
      Aangezien met dit preparaat een seriële verdunning zal worden uitgevoerd, moeten deze aantallen worden verdubbeld, d.w.z. 3,6 × 107 cellen in een totaal volume van 1200 μL. Om dit om te zetten naar WANT in cellen per ml; deel 3,6 × 10 7 door 1200 μL en vermenigvuldig met 1000 μL, wat 3 × 107 cellen per ml oplevert.
      ​Equation 5
    2. Voeg het benodigde volume celvoorraad toe aan een steriele centrifugebuis van 2 ml of 15 ml en breng tot een eindvolume van 1200 μl met groeimedium. Label deze buis als Dichtheid 1 (Figuur 3).
  2. Voer seriële verdunning uit om celsuspensies met meerdere zaaddichtheid te creëren.
    1. Bereid vanaf dichtheid 1 die in stap 4.1.1 is voorbereid, nog drie dichtheden van celsuspensie door middel van seriële verdunning zoals beschreven in figuur 3.
    2. Verdun elke dichtheid met een factor 2 in het groeimedium. Voeg eerst het benodigde eindvolume (600 μL uit het vorige voorbeeld) groeimedium toe aan drie steriele centrifugebuisjes van 2 ml of 15 ml.
    3. Breng de helft van dichtheid 1 (600 μL) over naar een van de buizen en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 2.
    4. Breng de helft van Density 2 (600 μL) over naar de volgende buis en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 3.
    5. Breng de helft van dichtheid 3 (600 μL) over naar de volgende buis en meng de celsuspensie grondig met het medium om te verdunnen. Label deze buis als Density 4.
    6. Gooi 600 μL van dichtheid 4 weg, zodat alle vier de preparaten een eindvolume van 600 μl hebben.
    7. Voeg als negatieve controle 600 μL groeimedium toe aan een steriele centrifugebuis van 2 ml. Zie figuur 3 voor een schema van het seriële verdunningsproces.

Figure 3
Figuur 3: Seriële verdunning van celmateriaal om 4 suspensies te bereiden voor 4 verschillende scaffold seeding-dichtheden. (A) Aantallen kunnen worden aangepast aan de gewenste zaaidichtheid per steiger en (B) vermenigvuldigd voor het totale aantal steigers per dichtheid, waarbij elke steiger 20 μL celsuspensie krijgt. In dit voorbeeld vereist dichtheid 1 6 × 105 cellen per steiger, wat overeenkomt met 1,8 × 107 cellen in 600 μL voor 30 steigers. Dit aantal wordt verdubbeld om de seriële verdunning te starten, aangezien 600 μL vervolgens wordt overgebracht en verdund in 600 μL groeimedium in de volgende buis. Dit proces gaat door totdat er 4 celsuspensies zijn met een factor 2 ertussen. Een negatieve controle wordt uitgevoerd door slechts 600 μL medium aan een buis toe te voegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Toevoegen van celsuspensies aan de steigers
    NOTITIE: Haal de steigers (bewaard in PBS) uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen (RT) voordat u de cellen toevoegt.
    1. Breng de steigers in PBS in de laminaire stroomkap.
    2. Plaats de steigers met een steriel pincet in niet-klevende platen met 24 putjes en één steiger per putje (Figuur 1C). Til de steigers voorzichtig aan de hoeken op en druk ze lichtjes tegen de zijkant van de container om overtollig PBS te verwijderen. Voeg de steigers toe aan het midden van de putten met de huid naar beneden (de glanzende laagzijde van de steiger, naar beneden gericht in de plastic platen met 24 putjes).
    3. Label de platen met 24 putjes met details van de cellijn, relevante parameters (bijv. zaaidichtheid) en tijdstippen. Werk met één celzaaidichtheid per keer en bewaar de resterende dichtheden in de incubator van 37 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
    4. Gebruik in de laminaire stromingskap een P20-pipet en steriele tips om voorzichtig 20 μL van de relevante celsuspensie toe te voegen aan het midden van elke steiger (Figuur 1D). Houd de cellen goed in suspensie door goed te mengen terwijl je de cellen aan de steigers toevoegt. Zorg ervoor dat de ophanging bovenop de steiger blijft en niet op de basis van de put glijdt, omdat hierdoor geen celbevestiging aan de steiger mogelijk is.
    5. Nadat de cellen zijn toegevoegd, incubeert u de platen gedurende 3-5 uur (37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) zodat de meeste cellen zich kunnen hechten.
    6. Voeg na de incubatie langzaam en voorzichtig 1 ml voorverwarmd groeimedium toe aan elk putje (Figuur 1E). Gebruik een P1000-pipet om het medium toe te voegen om een langzamere en gecontroleerde beweging mogelijk te maken, waardoor verplaatsing van de steigers wordt voorkomen. Als u met een zeer groot aantal steigers werkt, gebruik dan een pipet van 10 ml met het pipetpistool ingesteld op 'drop' en 'low'.
    7. Incubeer de platen met 24 putjes een nacht (37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid).
  2. Onderhoud van cellen op de steigers
    1. Breng na de eerste 24 uur van celhechting (dag 1) de gezaaide steigers over naar nieuwe niet-klevende platen met 24 putjes en voeg 1-2 ml vers groeimedium toe.
      OPMERKING: Deze stap verwijdert cellen die naar de bodem van de plastic platen met 24 putjes zijn gevallen in plaats van ze op de steigers te laten groeien. Replica's van steigers die zijn aangewezen als dag 1 worden na 24 uur afgebroken, zoals besproken in sectie 5; Onderhoud is dus niet van toepassing op deze steigers.
    2. Controleer de steigers in eerste instantie om de 2-3 dagen op een verandering in kleur van het groeimedium. Naarmate de tijd vordert en cellen zich in de steigers vermenigvuldigen, voedt u de cellen vaker.
    3. Gebruik een pipetpistool van 10 ml, in de langzame modus, verwijder de 1 ml van het verbruikte medium en gooi het weg. Als u experimenten uitvoert waarvoor geconditioneerd medium nodig is, verzamel dan het gebruikte medium van biologische replicaten in een centrifugebuis van 15 ml, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 340 × g om het celafval te pelleteren, breng het supernatans over in een nieuwe buis en bewaar het bij -80 °C.
    4. Voeg voorzichtig 2 ml voorverwarmd groeimedium toe aan de steigers, gebruik opnieuw de druppelfunctie op de pipet en plaats de plaat met 24 putjes terug in de incubator (37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid). Herhaal dit wanneer het medium wordt gebruikt voor de duur van de gewenste groeiperiode.

5. Ophalen en toepassingen van steigers

OPMERKING: Op elk tijdstip kunnen verschillende toepassingen worden gebruikt om de celgroei op de steigers te volgen of gen- en eiwitexpressieprofielen te beoordelen. De omstandigheden voor het ophalen van steigers zijn afhankelijk van de uit te voeren analyse, waarbij meerdere ophaalmethoden worden beschreven in de volgende subparagrafen en worden gedemonstreerd in figuur 4.

  1. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen in steigers
    1. Steriliseer het juiste reagens voor de cellevensvatbaarheidstest door door een steriel filter van 0,2 μm in een centrifugebuis in de laminaire stroomkap te filteren. Verwarm deze steriele oplossing samen met het volledige groeimedium en de steriele PBS voor in een waterbad van 37 °C.
    2. Gebruik in de laminaire stroomkap een steriel pincet om de te analyseren steigers over te brengen naar een verse plaat met 24 putjes. Label het bord met alle relevante details.
      OPMERKING: Voer de analyse in drievoud uit.
    3. Voeg 900 μL van het voorverwarmde groeimedium toe aan elk putje, gevolgd door 100 μL van het steriele cellevensvatbaarheidsreagens. Voer een negatieve controle uit door 900 μl medium en 100 μl van het reagens voor de levensvatbaarheid van steriele cellen toe te voegen aan een putje zonder steiger. Plaats het deksel terug op de plaat en schud de plaat voorzichtig gedurende ~3 minuten om het verdunde reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen gelijkmatig over het putje te verdelen. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.
      OPMERKING: De incubatietijd moet voor elke cellijn worden geoptimaliseerd; Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant. Voor neuroblastoomcellijnen lijkt een incubatietijd van 4-6 uur optimaal.
    4. Haal na het broeden de plaat uit de couveuse en schud hem een paar seconden voorzichtig.
    5. Open in de laminaire stroomkap een nieuwe, doorschijnende plaat met 96 putjes. Breng van elk putje in de plaat met 24 putjes het geïncubeerde medium en het reagens over naar drie putjes van de plaat met 96 putjes met 100 μl per putje, wat technische drievoud oplevert.
      OPMERKING: Deze overdracht laat 700 μL achter in de putjes van de plaat met 24 putjes.
    6. Bedek de plaat met 96 putjes met aluminiumfolie om het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel tegen licht te beschermen.
    7. Verwijder de resterende 700 μL van de putinhoud van elke steiger in de plaat met 24 putjes en gooi deze weg. Was elke steiger twee keer met 1 ml steriele PBS.
      OPMERKING: Alle kleur wordt niet van de steigers verwijderd. Deze steigers kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere toepassingen, bijvoorbeeld DNA-kwantificering, door ze in 1 ml 1% Triton X-100 in 0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3)-oplossing te plaatsen en ze op te slaan bij -80 °C (zie rubriek 5.2, figuur 4B).
    8. Verwijder de plaat met 96 putjes van de laminaire stromingskap en meet de absorptie van elk putje op golflengten van 570 nm en 600 nm met behulp van een microplaatlezer. Noteer de absorptiewaarden op beide golflengten en volg de instructies van de fabrikant om de procentuele vermindering van het cellevensvatbaarheidsreagens door de cellen te berekenen.
    9. Maak een grafiek en analyseer statistisch de resultaten van de levensvatbaarheid van de cel met behulp van geschikte software. Voer biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven.
    10. Om veranderingen in de levensvatbaarheid van cellen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken, voert u een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA)-test uit met meerdere vergelijkingen van de gemiddelden met behulp van geschikte biostatistische software.
    11. Geef significante verschillen aan tussen de tijdstippen op grafieken als ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) en **** (P≤0,0001).

Figure 4
Figuur 4: Ophalen van steigers voor verschillende analyses op elk tijdstip. (A) Er worden drie replicaten van de steiger opgehaald voor analyse van de levensvatbaarheid van de cel. (B) Deze steigers kunnen vervolgens worden gewassen in PBS, in 1% Triton X-100 in 0,1 M NaHCO3 worden geplaatst en bij -80 °C worden bewaard voor DNA-kwantificering. (C) Nog drie replicaten worden gedurende 15 minuten gefixeerd in 10% PFA, geneutraliseerd in PBS en opgeslagen bij 4 °C voor histologische kleuring en beeldvorming. (D) Ten slotte worden 3 replicaten toegevoegd aan een cellysereagens op basis van fenol/guanidine en opgeslagen bij -20 °C voor analyse van genexpressie. Afkortingen: PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; PFA = paraformaldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Kwantificering van DNA uit de cellen in de steigers
    OPMERKING: Zoals vermeld in de opmerking na stap 5.1.7, omvat het ophalen van de steigers voor DNA-kwantificering het plaatsen van de steigers in centrifugebuisjes van 2 ml met 1 ml 1% Triton X-100 in 0,1 M NaHCO3-oplossing , gevolgd door opslag bij -80 °C. Voordat DNA-analyse kan worden uitgevoerd, moeten de cellen drie vries-dooicycli ondergaan om de neuroblastoomcellen op de juiste manier te lyseren en DNA vrij te geven voor kwantificering.
    1. Verwijder de monsters die eerder in Triton X-100 zijn opgeslagen bij -80 °C. Laat de monsters 1-3 uur bij RT staan of tot ze ontdooid zijn.
    2. Draai de monsters gedurende 10-20 s en plaats de monsters terug bij -80 °C gedurende 18-24 uur of totdat ze volledig bevroren zijn. Herhaal dit proces voor in totaal drie vries-dooicycli.
    3. Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, gebruikt u een weefsellyser om de cellen in de steigers te verstoren.
      1. Plaats een metalen kraal in de centrifugebuis van 2 ml met daarin een steiger in Triton X-100 en plaats de buis in de adapter om het monster gedurende 2-3 minuten met 50 oscillaties/seconde te schudden.
        NOTITIE: Gebruik centrifugebuisjes met ronde bodem, aangezien de metalen hiel vast kan komen te zitten in een buis met taps toelopende bodem.
    4. Kwantificeer het DNA in de Triton X-100-oplossing door een fluorescerende dubbelstrengs DNA-kleuring (dsDNA) aan te brengen en meet de emissie met behulp van een microplaatlezer. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant; verdun de monsters op de juiste manier in Tris-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (TE)-buffer om 8 dsDNA-standaarden te bereiden door seriële verdunning in TE-buffer (figuur 5).
    5. Voeg in zwarte ondoorzichtige platen met 96 putjes 100 μl van elke standaard of elk monster in technisch drievoud toe aan de putjes.
    6. Verdun de fluorescerende dsDNA-kleuring 200-voudig in TE-buffer en voeg 100 μL toe aan elke standaard/monster met behulp van een meerkanaalspipet. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer 5 minuten bij RT.
    7. Meet en registreer de fluorescentie van elk putje bij 520 nm. Volg de richtlijnen van de fabrikant om de DNA-concentratie in elk monster te berekenen.
      OPMERKING: Als de gemiddelde concentratie DNA per cel bekend is voor de cellijn die wordt gebruikt, kunnen DNA-concentratiewaarden worden omgezet in celnummers met behulp van vergelijking (4).
      Equation 6(4)
    8. Maak een grafiek en analyseer de resultaten van de DNA-kwantificering statistisch met behulp van geschikte software. Voer biologische drievoudige waarden in om foutbalken te produceren en de variabiliteit van de test aan te geven.
    9. Om de veranderingen in DNA-concentratie/celaantallen gedurende het experimentele tijdsbestek te onderzoeken, voert u een eenrichtings-ANOVA-test uit met meerdere vergelijkingen van de gemiddelden met behulp van geschikte biostatistische software.
    10. Geef significante verschillen aan tussen tijdstippen in grafieken als ns (P>0,05), * (P≤0,05), ** (P≤0,01), *** (P≤0,001) en **** (P≤0,0001).

Figure 5
Figuur 5: Opstellen van acht DNA-standaarden voor het genereren van een standaardcurve. Er wordt een stockoplossing van λDNA geleverd in een dosis van 100 μg/ml. Dit wordt 50-voudig verdund in TE-buffer om standaard A te creëren bij 2000 ng/ml; 400 μL A wordt vervolgens overgebracht naar buis B, die 400 μL TE-buffer bevat; 400 μL B wordt vervolgens overgebracht en 2-voudig verdund in C, enzovoort tot G. Standaard H bestaat alleen uit TE-buffer en heeft daarom een DNA-concentratie van 0 ng/ml. Afkorting: TE = Tris-EDTA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voorbereiding van steigers voor histologische kleuring
    OPMERKING: Scaffolds kunnen worden gefixeerd en gekleurd voor microscopie- en beeldvormingsdoeleinden, hetzij als hele steigers voor immunofluorescentie (IF) of als in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) plakjes voor histologische kleuring of immunohistochemie (IHC). Dit maakt de kwalitatieve beoordeling van celpenetratie en -distributie binnen steigers mogelijk en kan worden gebruikt om de expressie van eiwitten te beoordelen.
    1. Bereid een 10% paraformaldehyde (PFA)-oplossing in PBS. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing is voor een eindvolume van 500 μL per steiger.
    2. Verwarm deze oplossing voor op 37 °C en voeg 500 μl toe aan de gelabelde centrifugebuisjes van 2 ml voor het ophalen van de steiger.
    3. Verwijder de steigers van de niet-klevende platen met 24 putjes (stap 4.4.4) en plaats ze in de laminaire doorstromingskap.
    4. Breng de steigers met een steriel pincet over naar de gelabelde centrifugebuisjes met 10% PFA. Laat de steigers 15 minuten fixeren in de PFA-oplossing. Neutraliseer de PFA door 500 μL PBS aan elk buisje toe te voegen en bewaar bij 4 °C.
    5. Om de steigers voor te bereiden op de automatische weefselverwerker, verwijdert u ze van 4 °C en plaatst u ze met een pincet in plastic cassettes die met potlood zijn gelabeld met alle relevante details. Plaats alle cassettes in de metalen container van de Tissue Processor.
    6. Begin met het 12-fasenprotocol op de weefselprocessor om de steigers te repareren, uit te drogen, vrij te maken en ze 's nachts met paraffine te infiltreren. Verzamel de cassettes met de verwerkte monsters.
    7. Veranker vervolgens de steigers in paraffinewasblokken om microtomie van de steigers in zeer dunne plakjes mogelijk te maken om te kleuren.
      OPMERKING: Het is vooral belangrijk om rekening te houden met de oriëntatie van de steigers wanneer u ze uit de cassettes haalt en in was inbedt, omdat dit van invloed is op de hoek waaronder de foto's worden gemaakt. Dit is belangrijk bij het beoordelen van celinfiltratie in de steigers.
    8. Zet de wax embedder en de koude plaat aan; Til het deksel op om het niveau van de was te controleren. Vul indien nodig bij.
    9. Werk met één monster tegelijk, open de cassette, verwijder de steiger en centreer deze in de plastic mal.
    10. Giet hete was op het monster, zorg ervoor dat de juiste oriëntatie wordt gehandhaafd en pas indien nodig aan met een warm pincet voordat de was stolt. Giet meer was om de mal te vullen.
    11. Plaats het gelabelde cassettedeksel op de plastic mal en voeg er was aan toe. Plaats de mal op de koude plaat om de was te laten stollen. Bewaar een nacht bij 4 °C om ervoor te zorgen dat de paraffinewas volledig gestold is vóór de microtomie.
    12. Om u voor te bereiden op microtomie, zet u een waterbad van 35 °C, de droogplaat en de microtoom aan.
    13. Steek een mes in de houder en draai de hendel vast om het vast te zetten.
    14. Stel de trim- en sectiedikte in, meestal 5 mm voor steigersecties.
    15. Haal de FFPE-steiger uit de mal, zet deze vast in de houder aan de voorkant van de microtoom en snijd de overtollige was voorzichtig rond de randen van het monster af voordat u secties snijdt.
    16. Begin met snijden in het wasblok door aan de hendel van de microtoom te draaien, zodat u een soepele beweging krijgt.
    17. Verzamel lintachtige secties, ongeveer 3 steigersecties tegelijk, en plaats ze voorzichtig in het waterbad van 35 °C om kreukels te verwijderen. Scheid de secties voorzichtig terwijl ze in het waterbad zijn met een pincet.
    18. Gebruik microscoopglaasjes van glas met polysininecoating om elke sectie uit het waterbad te tillen zodat de sectie in het midden van het objectglaasje zit. Label elk glaasje met een potlood.
    19. Plaats de glasplaatjes op de droogplaat of in een droogoven van 60 °C. Eenmaal gedroogd, bewaar ze bij 4 °C en ga verder met de vereiste histologische of IHC-kleuring.
  2. Ophalen van steigers voor genexpressie-analyse
    1. Verwijder de steigers van de niet-hechtende platen met 24 putjes uit de incubator (stap 4.4.4) en plaats ze in de laminaire stromingskap.
    2. Breng de steigers met een steriel pincet over naar vers geëtiketteerde centrifugebuisjes van 2 ml.
    3. Voeg in een zuurkast 1 ml van een op fenol/guanidine gebaseerde cellyse-reagens toe aan elke buis om de cellen in steigers te lyseren en herstel van hoogwaardig RNA mogelijk te maken.
    4. Bewaar buisjes bij -20 °C totdat ze klaar zijn om RNA-extractie uit te voeren met behulp van een geschikte kit. Beoordeel met behulp van een standaard reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)17 de genexpressie in de cellen in de steigers.

Representative Results

Het op collageen gebaseerde steigermodel dat hier wordt beschreven, heeft vele toepassingen, variërend van het bestuderen van de biologie van neuroblastoom tot het screenen van antikankertherapieën in een omgeving die fysiologisch meer lijkt op inheemse tumoren dan conventionele 2D-celkweek. Alvorens een bepaalde onderzoeksvraag te testen, is het van cruciaal belang om een volledige karakterisering van celhechting, proliferatie en infiltratie te verkrijgen binnen het gewenste experimentele tijdsbestek. De groeiomstandigheden zijn afhankelijk van de biologie van elke specifieke cellijn. Belangrijk is dat verschillende methoden voor het beoordelen van celgroei moeten worden geïmplementeerd om optimale omstandigheden en robuuste prestaties te bepalen.

Hier werd de levensvatbaarheid van neuroblastoomcellen die op steigers werden gekweekt, beoordeeld met behulp van een colorimetrische cellevensvatbaarheidstest. Deze test kan zo vaak als gewenst worden uitgevoerd gedurende het experimentele tijdsbestek. Voor het beschreven experiment werd op dag 1, 7 en 14 een beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen uitgevoerd voor twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA-steigers met 4 verschillende dichtheden (Figuur 6). De levensvatbaarheid op dag 1 werd als basislijn vastgesteld om alle volgende metingen te vergelijken. De mate van reductie van het reagens voor de levensvatbaarheid van cellen weerspiegelt de celbiologie en groeikenmerken van individuele cellijnen, met inbegrip van hun proliferatiesnelheid en metabolisme. Er werd een correlatie verwacht tussen het aantal cellen dat op de steigers werd gezaaid en de mate van reductie. In dit experiment nam de vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cellen over het algemeen toe met elk tijdstip voor beide cellijnen bij alle dichtheden, zoals verwacht.

Elke dichtheid werd vervolgens afzonderlijk beoordeeld voor beide cellijnen om de reductie over tijdstippen te vergelijken. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd om significante verschillen in reductie tussen tijdstippen te detecteren (Figuur 7). Voor beide cellijnen en alle zaaidichtheden was er een significante toename (P<0,05) in de vermindering van het cellevensvatbaarheidsreagens bij vergelijking van dag 1 en dag 14. Dit duidde op een significante toename van metabolisch actieve cellen die op de steigers aanwezig waren. Deze toename was niet in alle gevallen significant bij het beoordelen van de intervallen van 7 dagen (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14), wat het belang aantoont van de optimalisatie van de zaaidichtheid om het gewenste groeivenster te bereiken.

Om de resultaten van de cellevensvatbaarheidstest te ondersteunen, kan celgroei op steigers ook indirect worden gemeten via de kwantificering van dsDNA dat uit steigers wordt geëxtraheerd met behulp van een fluorescerende dsDNA-kleuring (Figuur 8A). Net als de levensvatbaarheid van cellen kan DNA-kwantificering zo vaak als gewenst worden gedaan binnen de experimentele tijdlijn. Deze analyse vereist echter het volledig ophalen van steigers en het beëindigen van de celgroei en moet dus worden meegenomen in de experimentele planning, zoals besproken in sectie 1. Voor dit experiment werd DNA gekwantificeerd op dag 1, 7 en 14 voor twee neuroblastoomcellijnen, KellyLuc en IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA-steigers met 4 verschillende dichtheden. Omdat voor deze cellijnen de gemiddelde concentratie dsDNA per cel bekend is, was het mogelijk om het aantal cellen per monster af te leiden uit het gekwantificeerde DNA (figuur 8B).

DNA-kwantificering gaf aanleiding tot een grotere variabiliteit tussen biologische replicaten dan beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, maar nam over het algemeen toe voor elk tijdstip, waarbij de hoogste niveaus op dag 14 werden gekwantificeerd. IMR32-cellen lijken hogere celaantallen te bereiken op Coll-I-nHA-steigers, zoals aangegeven door DNA-concentratie, dan KellyLuc-cellen. Elke dichtheid werd vervolgens afzonderlijk beoordeeld voor de twee cellijnen om de reductie op verschillende tijdstippen te vergelijken. Eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd om significante verschillen in reductie tussen tijdstippen te detecteren (Figuur 8B).

Voor beide cellijnen en alle zaaidichtheden was er een significante toename (P<0,05) in celaantallen bij het vergelijken van dag 1 en dag 14, met uitzondering van KellyLuc bij zaaidichtheid 4 (1 × 105 cellen/steiger), wat op geen van de tijdstippen een significante toename opleverde. Net als bij de resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen, waren de stijgingen niet in alle gevallen significant bij het beoordelen van de intervallen van 7 dagen (dag 1 vs. dag 7, dag 7 vs. dag 14). Bij het vergelijken van de tijdpunttrends voor de levensvatbaarheid van cellen en DNA-kwantificering, waren er enkele kleine verschillen tussen de twee analyses. Over het algemeen werden echter vergelijkbare trends waargenomen, waarbij de gemiddelde waarden voor de meeste dichtheden tussen intervallen van 7 dagen toenamen. Dit toont het belang aan van het monitoren van celgroei met behulp van meer dan één methode.

Vervolgens werd een visuele beoordeling van de morfologie en verdeling van de celgroei op de steigers geïmplementeerd, waarbij traditionele hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring en IHC werden opgenomen. Verwacht wordt dat de verschillende groeipatronen van individuele cellijnen zullen leiden tot gevarieerde ruimtelijke arrangementen op steigers, inclusief verschillende graden van penetratie in de steiger en celclustering. Steigers waren met formaline gefixeerd, met paraffine ingebed en in secties van 5 mm gesneden (Figuur 9A), waardoor de steigers werden voorbereid op meerdere visualisatietechnieken, waaronder histologische kleuring en IHC.

Routinematige H&E-kleuring werd toegepast op Kelly-, KellyCis83- en IMR32-cellen die op dag 1, 7 en 14 op steigers op basis van collageen werden gekweekt (Figuur 9B). Dit maakte het mogelijk om de ruimtelijke oriëntatie van de cellen te visualiseren op twee op collageen gebaseerde steigers gedurende een periode van 14 dagen. Cisplatinegevoelige Kelly-cellen en resistente KellyCis83-cellen werden gekweekt op zowel Coll-I-nHA-steigers (Figuur 9B, i) als Coll-I-GAG-steigers (Figuur 9B, ii). In overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens groeiden KellyCis83-cellen sneller en infiltreerden ze dieper in beide steigersamenstellingen dan de minder invasieve Kelly-cellijn. De H&E-kleuring van een andere neuroblastoomcellijn, IMR32, gekweekt op Coll-I-nHA vertoont een contrasterend groeipatroon (Figuur 9B, iii). Deze cellijn groeide in grote, dicht opeengepakte clusters op de collageensteigers gedurende de periode van 14 dagen. Brightfield confocale microscopie kan worden gebruikt om de poreuze architectuur van op collageen gebaseerde steigers te visualiseren (Figuur 9C) als gevolg van de autofluorescentie van collageenvezels.

We kleurden cellen met phalloidine gericht op cytoskeletactine en de nucleaire tegenkleuring, 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), om specifieke celeigenschappen gedurende de experimentele tijdlijn te volgen. Met behulp van deze techniek werd een overvloed aan actine waargenomen in Kelly- en KellyCis83-cellen op Coll-I-GAG-steigers (Figuur 9D). Deze resultaten laten zien hoe meerdere beeldvormingstechnieken kunnen worden gebruikt om ruimtelijk opgeloste informatie af te leiden uit neuroblastoomcellen die met behulp van dit protocol op steigers zijn gekweekt. Deze karakterisering van celgroeipatronen op op collageen gebaseerde steigers gedurende een bepaalde periode zal het begrip en de interpretatie van eventuele stroomafwaartse biochemische assays verbeteren.

Eiwitexpressie door cellen die op op collageen gebaseerde steigers worden gekweekt, kan worden geanalyseerd om cellulaire activiteit te vergelijken met in vivo-scenario's . Eerder gepubliceerde gegevens onderzochten de expressie van chromogranine A (CgA) als een surrogaat-uitgescheiden marker van neuroblastoom door KellyLuc- en KellyCis83Luc-cellen die werden gekweekt in celmonolagen en op Coll-I-nHA- en Coll-I-GAG-steigers (Figuur 10). CgA werd beoordeeld in de geconditioneerde media met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Figuur 10A). CgA wordt sneller uitgescheiden in de agressievere chemoresistente KellyCis83-cellijn dan in Kelly (Figuur 10B,C). Dit was significant op dag 7 op zowel Coll-I-GAG- als Coll-I-nHA-steigers (P<0,05), terwijl er op dit tijdstip geen significant verschil was voor cellen die als monolaag werden gekweekt door conventionele 2D-kweek.

Deze resultaten benadrukken ook de beperkte experimentele tijdlijn bij het kweken van cellen in een monolaag, waarbij slechts 7 dagen groei haalbaar blijkt te zijn voordat cellen samenvloeiing bereiken. De groei van cellen op steigers overwint deze beperking omdat ze over een langere periode kunnen worden gehandhaafd in meer fysiologisch relevante omstandigheden. De bovenstaande combinatie van technieken om informatie te verkrijgen over de levensvatbaarheid van cellen, DNA-inhoud, cellulaire morfologie en ruimtelijke rangschikking, en expressieprofielen, vergemakkelijkt de beoordeling van de groei van neuroblastoomcellen op een reeks op collageen gebaseerde steigers. Dit protocol kan ook eenvoudig worden aangepast om te voldoen aan specifieke experimentele vereisten en gewenste toepassingen.

Figure 6
Figuur 6: Analyse van de levensvatbaarheid van cellen. (A) Algemene procedure voor het meten van de levensvatbaarheid van neuroblastoomcellen op steigers op basis van collageen met behulp van een colorimetrische cellevensvatbaarheidstest. De incubatietijd moet voor elke nieuwe cellijn worden geoptimaliseerd, verwijzend naar de richtlijnen van de fabrikant. (B) Procentuele vermindering van het reagens voor de levensvatbaarheid van cellen door KellyLuc- en IMR32-cellen gekweekt op Coll-I-nHA-steigers bij vier verschillende initiële zaaidichtheden, gemeten op dag 1, 7 en 14. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud met foutbalken die de standaarddeviatie vertegenwoordigen. Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageen steigers aangevuld met nHA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Levensvatbaarheid van cellen door zaaidichtheid voor cellen die gedurende een periode van 14 dagen op Coll-I-nHA zijn gekweekt. (A) KellyLuc; (B) IMR32. Titelcelnummers verwijzen naar de initiële celzaaidichtheid op de steigers op dag 0. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud, aangegeven met drievoudspunten, waarbij balken het gemiddelde vertegenwoordigen. One-Way ANOVA met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om significante verschillen te detecteren in % cellevensvatbaarheidsreagensreductie over de drie tijdstippen, genoteerd in de grafieken (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; ANOVA = variantieanalyse; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Kwantificering van DNA geëxtraheerd uit cellen in steigers. (A) Proces van het kwantificeren van dsDNA uit cellen die zijn gekweekt op op collageen gebaseerde steigers met behulp van een fluorescerende dsDNA-kleuring. (B) Celaantallen uit DNA-kwantificeringsanalyse door zaaidichtheid voor KellyLuc- en IMR32-cellen die gedurende een periode van 14 dagen op Coll-I-nHA zijn gekweekt. Celnummers met een titel verwijzen naar de initiële celzaaidichtheid op steigers op dag 0. De monsters werden beoordeeld in biologisch drievoud, aangegeven met drievoudspunten, waarbij balken het gemiddelde vertegenwoordigen. One-Way ANOVA met meerdere vergelijkingen werd gebruikt om significante verschillen in celaantallen over de drie tijdstippen te detecteren, genoteerd op de grafieken (ns P > 0,05, * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001, **** P ≤ 0,0001). Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; dsDNA = dubbelstrengs DNA; TE = Tris-EDTA; ANOVA = variantieanalyse; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Weefselverwerkingsstappen voor immunohistochemische analyse van scaffolds . (A) Schematische weergave van het protocol voor het verwerken van steigers voor beeldanalyse. Dit proces maakt routinematige histologische kleuring en specifieke antilichaamsondering mogelijk met behulp van primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. (B) Representatieve beelden van drie neuroblastoomcellijnen die zijn onderworpen aan H&E-kleuring. H&E-beelden worden gemaakt op dag 1, 7 en 14 om groeipatronen in de loop van het experiment te volgen. Schaalbalk = 200 μm. Gestippelde vierkanten vertegenwoordigen het gebied dat is gekozen voor ingezoomde 20x-afbeeldingen aan de linkeronderrand. Schaalbalk = 20 μm. (i en ii) H&E van Kelly en KellyCis83 neuroblastoomcellijnen (respectievelijk bovenste en onderste panelen) op twee soorten op collageen gebaseerde steigers. (iii) H&E van de IMR32-cellijn, die geclusterde cellulaire groei op de Coll-I-nHA-steiger vertegenwoordigt. (C) Representatief beeld van de Kelly-cellijn, onderworpen aan confocale helderveldmicroscopie. De collageen autofluorescentie maakt visualisatie van de poreuze steiger mogelijk. 10x schaalbalk = 200 μm, 20x schaalbalk = 20 μm. (D) Representatief beeld van ingebedde steigers gevolgd door analyse door IHC met falloidine en DAPI bij 10x vergroting, schaalbalk = 200 μm. Kleinere binnenvierkanten vertegenwoordigen ingezoomde afbeeldingen (20x), schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; GAG = glycosaminoglycaan; Coll-I-GAG = collageensteigers aangevuld met chondroïtine-6-sulfaat; H&E = hematoxyline en eosine; IHC = immunohistochemie; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Eiwitexpressie door neuroblastoomcellen gekweekt op 3D-collageen-gebaseerde steigers in vergelijking met 2D-plastic. (A) Een schema van hoe de CgA ELISA werd uitgevoerd op geconditioneerde media van cellen gekweekt op 2D-plastic of 3D-collageen-gebaseerde steigers. (B) CgA-eiwitexpressieniveaus afkomstig van geconditioneerde media van cellen die zijn gekweekt op een 2D-plastic monolaag. Omdat de cellen na 7 dagen samenvloeiing bereikten, was het tijdstip van 14 dagen niet leesbaar. Op dag 7 op plastic was er geen significant verschil in CgA-niveaus tussen KellyCis83-cellijnen. (C) CgA ELISA uitgevoerd met behulp van geconditioneerde media van cellen die gedurende 14 opeenvolgende dagen op steigers op basis van collageen zijn gekweekt. Op dag 7, op beide collageensteigers, zijn de CgA-niveaus hoger in de agressievere KellyCis83-cellijn, wat meer fysiologisch relevante niveaus van CgA in de 3D-matrix benadrukt in vergelijking met de 2D-monolaag. Dit cijfer is aangepast van Curtin et al.17. Afkortingen: 3D = driedimensionaal; 2D = tweedimensionaal; CgA = chromogranine A; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; nHA = nanohydroxyapatiet; Coll-I-nHA = collageensteigers aangevuld met nHA; GAG = glycosaminoglycaan; Coll-I-GAG = collageensteigers aangevuld met chondroïtine-6-sulfaat; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; HRP = mierikswortelperoxidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het 3D-scaffold-kankercelmodel heeft bewezen een waardevol en veelzijdig hulpmiddel te zijn voor het verkrijgen van mechanistisch inzicht in de groei, levensvatbaarheid en infiltratie van neuroblastoomcellen in een vereenvoudigde TME32. Het hier beschreven 3D-neuroblastoommodel bootst de minimale TME na en levert meer fysiologisch relevante gegevens op dan een 2D-monolaagcultuur. Een groot nadeel van 3D-celkweek is de toegenomen experimentele complexiteit en langere tijdsbestekken. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven voor het zaaien, groeien en onderhouden van neuroblastoomcellen op op collageen gebaseerde steigers, gevolgd door stroomafwaartse analyses en toepassingen, wat een robuuste karakterisering van celgroei oplevert. We wilden inzicht krijgen in de optimale celseeding-dichtheid voor de steigers om een voorspelbare en controleerbare omgeving te creëren voor het beoordelen van behandelingen tegen kanker in een snel experimenteel venster van 14 dagen. De combinatie van al deze beschreven eenvoudige protocollen biedt een goed afgeronde beoordeling van de groei van neuroblastoomcellen in het op steigers gebaseerde in-vitrokweeksysteem .

De kritieke punten in de opzet van het protocol zijn benadrukt om wetenschappers in staat te stellen dit snel in hun laboratoria vast te stellen. De aangegeven incubatietijden voor betere prestaties van de colorimetrische cellevensvatbaarheidstest maken bijvoorbeeld een diepere penetratie van het reagens in de poriën van de steiger mogelijk om alle cellen te bereiken. Bovendien is de fluorescerende dsDNA-kleuringstechniek robuust en eenvoudig; het vrijkomen van DNA uit de steigers vereist echter krachtige cellyse, omdat de cellen 'gevangen' zitten in collageenvezels.

Met behulp van de beschreven eenvoudige DNA-kwantificeringstest kunnen we met behulp van dit model de loggroeifase identificeren op op collageen gebaseerde steigers voor screening op geneesmiddelen tegen kanker. In de beschreven experimentele setting werden 4 initiële celzaaidichtheden gebruikt met een totale periode van 14 dagen en analysetijdstippen op dag 1, 7 en 14. We hebben vastgesteld dat KellyLuc-cellen die op 4 × 105 cellen/scaffold zijn gezaaid, het meest significant actieve proliferatievenster hebben tussen dag 7 en 14. Deze groeigegevens van de logfase zullen een betrouwbare interpretatie van verschillende celcytotoxiciteitsexperimenten mogelijk maken. Het elimineert speculatie over een afname van de groei of celdood als gevolg van onderdrukte groei op het poreuze 3D-platform in plaats van door toxiciteit van geneesmiddelen. De levensvatbaarheid van cellen is ook een veelgebruikte beoordeling voor de geschiktheid van 3D-platforms om de groei van verschillende celtypen te ondersteunen33,34. Hoewel er veel tests zijn om de levensvatbaarheid van cellen te meten, waaronder levende/dode kleuring, ATP-meting, proliferatietests, vonden we het gebruik van de Alamar Blue colorimetrische cellevensvatbaarheidstest een eenvoudige en effectieve techniek om DNA-kwantificeringsgegevens te ondersteunen.

Het gecombineerde gebruik van DNA-kwantificering en cellevensvatbaarheid leverde complementair bewijs dat de optimale dichtheid om cellen op het schavot te zaaien om gedurende een periode van 14 dagen verdere groei te bereiken, gemiddeld 2-4 × 105 cellen/steiger is. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast om te voldoen aan verschillende experimentele tijdschema's, analysetijdstippen en stroomafwaartse toepassingen. Hoewel dit protocol de evaluatie van monocultuurcelgroei van neuroblastoomcellen op steigers beschrijft, zijn de steigers gemakkelijk aanpasbaar voor gebruik als platform voor co-cultuur, beschreven door do Amaral et al., die collageen-GAG-steigers gebruikten om keratinocyten en fibroblasten samen te kweken in een onderzoek naar wondgenezing35.

Het beschreven 3D-model maakt het mogelijk om celgroei en -infiltratie te visualiseren met behulp van verschillende bekende technieken, zoals immunofluorescentie en standaard H&E. Het is belangrijk om de cellen samen met de karakterisering van de groei te visualiseren met behulp van biochemische assays vanwege de diversiteit van de celmorfologie en groeipatronen op steigers. Inzicht in het groeipatroon kan inzicht geven in groeigedrag en toekomstige respons op geneesmiddelen tegen kanker. IMR32-groei met behulp van DNA-kwantificering levert bijvoorbeeld vergelijkbare patronen op als Kelly, hoewel IMR32 bij visualisatie met behulp van H&E in grotere clusters groeit dan Kelly, die meer verspreide groei vertoonde (Figuur 9). Deze gevarieerde groeipatronen van cellijnen in steigers weerspiegelen het klinische scenario van tumorheterogeniteit. Het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen tegen kanker met behulp van een panel van cellijnen met verschillende morfologieën in 3D-steigers zal de voorspellende waarde voor de respons van de patiënt op dezelfde geneesmiddelen vergroten.

Detectie van gen- of eiwitexpressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere benaderingen zoals RT-qPCR of ELISA als het eiwit van belang wordt uitgescheiden. Een surrogaatmarker van neuroblastoomprogressie, chromogranine A (CgA)36, werd gebruikt om de groei van neuroblastoomcellen in 3D extra te karakteriseren. Zoals beschreven in eerder werk17, nam de CgA-secretie toe naarmate cellen zich vermenigvuldigden (Figuur 10). Hoewel monolaagse celkweek deze toename niet kon opvangen, omdat proliferatie betekende dat cellen volledige samenvloeiing bereikten in de kweekschalen, maakte het gebruik van de 3D-collageensteigers een langdurige beoordeling van de CgA-secretie mogelijk.

Dit 3D in vitro model is mogelijk niet geschikt voor alle onderzoeksvragen om de biologie van neuroblastoom en de respons op therapieën te bestuderen. Een van de beperkingen is ongelijke celpenetratie in steigers en de vorming van celclusters van verschillende grootte, die afhankelijk is van een bepaalde cellijn en kan leiden tot oncontroleerbare diffusie van voedingsstoffen en testmedicijnen. Deze eigenschap beïnvloedt de robuustheid van therapeutische screening. Ondanks deze beperking is het echter belangrijk om te bedenken dat inheemse tumoren ook heterogeen zijn in grootte en verdeling van kankercellen en vele andere celtypen in het tumorweefsel bevatten. Om deze beperking te overwinnen, stellen we voor om elke met cellen bevolkte steiger te gebruiken als een enkel microweefsel waarvoor de volgende parameters zullen worden geoptimaliseerd: (a) incubatietijden voor het cellevensvatbaarheidsreagens om de cellen en celclusters te bereiken, en (b) lysing van de cellen in Triton X-100-buffer door voorbewerking van cellen op steigers met een weefsellyser om het DNA van de cellen diep in de steiger vrij te maken.

Een andere technische beperking van dit protocol is het ontbreken van mechanische tests van elke batch nieuw vervaardigde steigers voor dit model. Het gebruik van het robuuste productieproces van de steigers, die uitgebreid zijn gekarakteriseerd met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de steigers, zoals druk- en trekmodulus, porositeit en visuele poriënstructuur en homogeniteit, zorgt er echter voor dat de kwaliteiten van de steiger behouden blijven door batches 21,24,27,30,37.

Samenvattend presenteert dit artikel een reeks eenvoudige methoden voor de analyse van cellulaire groei op op collageen gebaseerde steigers. Zowel de experimentele tijdlijn als de analysepunten kunnen worden uitgewisseld, afhankelijk van de specifieke onderzoeksvragen. Dit protocol is ook aanpasbaar aan andere celtypen. De hierboven getoonde resultaten leveren bewijs over hoe deze compilatie van methoden inzicht gaf in de optimale zaaidichtheid voor verschillende neuroblastoomcellijnen om continue groei gedurende 14 dagen te creëren. De samenvoeging van resultaten verkregen uit alle methoden in dit protocol levert een superieur begrip op van celgroei binnen de 3D-collageenmatrix. Toekomstig gebruik van dit model zal waarschijnlijk co-cultuursystemen omvatten die specifiek zijn voor het neuroblastoom TME en het testen van verschillende nieuwe geneesmiddelen tegen kanker.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het National Children's Research Centre (NCRC), Irish Research Council (IRC) en Neuroblastoma UK. De illustraties zijn gemaakt met behulp van BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
IMR-32 ATCC CCL-127
Kelly ECACC 82110411
KellyCis83 Made in lab – derived from Kelly (Piskareva et al., 2015) - Increasing exposure to cisplatin. Cross resistance acquired
SH-SY5Y ATCC CRL-2266
Disposable
0.22 µm syringe filter Millex SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf tube Eppendorf 0030 120.086
100 mL sterile Pot Starstedt -
10 mL plastic pipette Cellstar 607 180
15 mL Falcon tube Starstedt 62.554.502
25 mL plastic pipette Cellstar 760 180
50 mL Falcon tube Starstedt 62.547.254
5 mL plastic pipette Cellstar 606 180
6 mm Biopsy punches Kai Medical BP-60F
Aluminium foil - -
Cover Slip Menzel-Glaser -
HYPERflask Corning CLS10030
Microscope slides Thermo Scientific J1840AMNT
Opaque black 96-well plate Costar 3915
Sterile P10 tips Starlab S1121-3810
Sterile P1000 tips Starlab S1122-1830
Sterile P20 tips Starlab S1123-1810
Sterile P200 tips Starlab S1120-8810
T-175 (175 cm2 flask) Sarstedt 83.3912
T-75 (75 cm2 flask) Sarstedt 83.3911.302
Translucent clear 96 well plate Cellstar 655180
Translucent non-adherent 24 well plates Cellstar 83.3922.500
Equipment
Autoclave Astell -
Automatic tissue processor Leica TP1020
Centrifuge 5804 Eppendorf -
Hemocytometer Hausser  Scientific -
Incubator ThermoScientific -
Microtome Leica RM2255
Oven Memmert Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P10 pipette Gilson
P100 pipette Gilson
P1000 pipette Gilson
P20 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
P200 pipette Gilson Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Paraffin section flotation bath Electrothermal MH8517 Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Pipette electronic dispenser Corning StripipetterUltra Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Plate cooler Leica EG1140C Calibrated by: Cruinn diagnostics Ltd
Refrigerator -20 °C Liebherr -
Refrigerator -80 °C Liebherr -
Refrigerator 4 °C Liebherr -
Seesaw Rocker DLAb SK-D1807-E
Spectrophotometer – Victor3V Platereader PerkinElmer 1420
Tissue culture hood/Laminar flow hood GMI 8038-30-1044
Tissue Lyser Qiagen TissueLyser LT
Tweezers - -
Water bath Grant -
Wax embedder Leica EG1140H
Materials
1 L Water Adrona - Biosciences 568
1% Triton-X Sigma Aldrich 9002-93-1
10x PBS tablets Sigma Aldrich P4417-100TAB
37% paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Alamar Blue Cell Viability Reagent Invitrogen DAL1100
Collagen- glycosaminoglycan scaffold Tissue engineering research group (TERG)
Collagen-nanohydroxyapatite scaffold Tissue engineering research group (TERG)
dH20 Adrona - Biosciences 568
Eosin Sigma-Aldrich E4009 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOH Sigma-Aldrich 1.00983.2500 Made as per: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12 Gibco 21765-029
FBS Gibco 10270-106
Hemaytoxylin Sigma-Aldrich HHS32-1L
L-Glutamine Gibco 25030-024
MEM Gibco 21090-022
miRNA easy Kit Qiagen 217004
MNEAA’s Gibco 11140-035
Penicillin/streptomycin Gibco 015140-122
Qiazol Qiagen 79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
RPMI Gibco 21875-034
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S7795-500G
Tissue embedding Medium Sigma A6330-4LB
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Software
Excel - Excel 2016
ImageJ - -
Prism - Version 9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078 (2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028 (2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11 (2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38 (2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658 (2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679 (2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050 (2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371 (2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Tags

Driedimensionaal In vitro Biomimetisch model Neuroblastoom Op collageen gebaseerde steigers Kinderkanker Tumorweefsel Extracellulaire matrix (ECM) Ziekteprogressie Prognose van de patiënt Therapeutische respons Neuroblastoomcellijnen Nanohydroxyapatiet (nHA) Glycosaminoglycanen (GAG's) Bot en beenmerg Gemetastaseerde plaatsen Poreuze structuur Celgehechtheid Proliferatie Migratie Celclusters Therapieën In Vivo Situatie Op steigers gebaseerd kweeksysteem Tweedimensionale (2D) cel Kweek DNA-kwantificering levensvatbaarheid van cellen

Erratum

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 06/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Driedimensionaal <em>in vitro</em> biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly,… More

Gallagher, C., Murphy, C., Kelly, G., O’Brien, F. J., Piskareva, O. Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds. J. Vis. Exp. (173), e62627, doi:10.3791/62627 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter