Summary
该协议描述了如何在不使用自动梯度制作器或梯度分级分离系统的情况下生成多聚体谱。
Abstract
通过蔗糖密度梯度离心进行多聚体分级分离是一种强大的工具，可用于创建核糖体谱，鉴定核糖体翻译的特定mRNA，并分析多聚体相关因子。虽然自动梯度测定器和梯度分馏系统通常与这种技术一起使用，但这些系统通常价格昂贵，并且对于资源有限或由于不经常或偶尔需要执行此方法而无法证明费用合理的实验室来说成本过高。在这里，提出了一种协议，使用大多数分子生物学实验室中可用的标准设备（无需专门的分级分离仪器）可重复地生成多聚体谱。此外，还提供了使用和不使用梯度分馏系统生成的多聚体谱图的比较。讨论了优化和产生可重复的多体谱的策略。 酿酒酵母 在本协议中用作模式生物。然而，该协议可以很容易地修改和调整，以产生许多不同的生物体和细胞类型的核糖体谱。
Introduction
核糖体是巨型道尔顿核糖核蛋白复合物，执行将mRNA翻译成蛋白质的基本过程。核糖体负责进行细胞内所有蛋白质的合成。真核核糖体包括两个亚基，根据其沉降系数指定为小核糖体亚基（40S）和大核糖体亚基（60S）。完全组装的核糖体被指定为80S单体。多聚体是参与翻译单个mRNA分子的核糖体组。通过蔗糖密度梯度离心分馏多聚体是一种强大的方法，用于创建核糖体谱，鉴定与翻译核糖体相关的特定mRNA，并分析多聚体相关因子1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13.该技术通常用于从单个核糖体、核糖体亚基和信使核糖核蛋白颗粒中分离多聚体。从分级分离中获得的图谱可以提供有关多聚体14的翻译活性和核糖体15，16，17的组装状态的宝贵信息。
核糖体组装是一个非常复杂的过程，由一组称为核糖体组装因子18，19，20，21的蛋白质促进。这些因子通过与许多其他蛋白质（包括ATP酶，内切和外切核酸酶，GTP酶，RNA解旋酶和RNA结合蛋白）的相互作用，在核糖体生物发生过程中执行广泛的功能22。多聚体分级分离一直是用于研究这些因素在核糖体组装中的作用的有力工具。例如，该方法已被用于证明多核苷酸激酶Grc3（一种前rRNA加工因子）的突变如何对核糖体组装过程产生负面影响17，23。多聚体分析还强调并展示了ATPase Rix7中的保守基序对核糖体生产至关重要16。
多聚体分级分离的过程始于从感兴趣的细胞中制备可溶性细胞裂解物。裂解物含有RNA、核糖体亚基和多聚体，以及其他可溶性细胞成分。在超速离心管内进行连续的线性蔗糖梯度。将细胞裂解物的可溶性部分轻轻上样到蔗糖梯度管的顶部。然后对装载的梯度管进行离心，离心通过重力在蔗糖梯度内按大小分离细胞成分。较大的分量比较小的分量更深入梯度。梯度的顶部容纳较小，移动较慢的细胞成分，而较大，快速移动的细胞成分位于底部。离心后，将管中的内容物收集为馏分。该方法可有效分离核糖体亚基、单体和多聚体。然后通过测量254nm波长处的光谱吸光度来确定每个级分的光密度。绘制吸光度与分数数的关系图可生成多聚体谱图。
可以使用梯度制作器生成线性蔗糖密度梯度。离心后，通常对梯度进行分馏，并使用自动密度分馏系统3，7，13，24，25测量吸光度。虽然这些系统在生产多聚体谱方面效果很好，但它们价格昂贵，并且对一些实验室来说成本过高。这里提出了一种在不使用这些仪器的情况下生成多聚体谱的协议。相反，该协议利用大多数分子生物学实验室中通常可用的设备。
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Protocol
1. 制备7%-47%蔗糖梯度
注意：蔗糖梯度的线性范围可以根据所使用的细胞类型进行修改，以实现更好的分离。该协议针对 酿酒酵母的多体谱进行了优化。
- 在蔗糖梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2 和 1 mM DTT）中制备 7% 和 47% 蔗糖储备溶液。过滤器通过0.22μm过滤器对蔗糖储备溶液进行灭菌，并储存在4°C。
- 通过按 表1中所述的方式分配和混合7%和47%蔗糖储备溶液，制备14 mL的17%，27%和37%蔗糖溶液。
- 将六个聚丙烯离心管（14 x 89 mm）放入全视图试管架中。确保管子之间有足够的空间，以便一个管子的操作不会干扰其他管子。
- 将长针连接到 3 mL 注射器上。对于此方案，请使用带有钝头的9英寸，22 G针头（图1），但任何足够长的针头足以到达离心管底部就足够了。
注意：在设置梯度之前，执行测试填充和分配，以确保注射器可以容纳蔗糖溶液而不会滴落。 - 将 2 mL 的 7% 蔗糖加入每个离心管的底部。
- 将针尖放置在管底附近并缓慢而小心地分配溶液，在 7% 溶液下方加入 2 mL 的 17% 蔗糖。
- 重复 27%、37% 和 47% 蔗糖溶液各 2 mL。确保每层都可以通过标记密度分离的线来区分（图2）。
注意：如果梯度在48小时内不使用，那么此时，在它们沉降成连续梯度之前，将管子与液氮中的分层蔗糖溶液快速冷冻，并储存在-80°C冰箱中长期储存。 - 将梯度在4°C下储存过夜，以使梯度沉淀成连续的，增加百分比的蔗糖。层状蔗糖溶液需要8-12小时才能沉降成线性蔗糖梯度。线性梯度稳定长达48小时。在4°C下过夜储存为解冻和沉降到线性梯度中提供了足够的时间，以便使用冷冻的分层蔗糖溶液。使用密度计评估梯度质量。
注意：将渐变存储在不会受到干扰的稳定位置至关重要，因为任何运动或振动都会破坏渐变。
2. 酵母细胞提取物的制备
- 将感兴趣的酵母菌株接种到50mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中，并在30°C下在振荡培养箱中生长过夜至固定相。
注意：温度可能因酵母菌株要求而异。 - 将 10 mL 固定相培养物转移到 1 L 新鲜 YPD 培养基中。在30°C（或其他合适的温度）下剧烈摇动孵育细胞，直到培养物达到中期指数生长期（OD600 = 0.4-0.6）。
- 在指数生长期中期，向培养物中加入终浓度为0.1mg / mL的环己酰亚胺。在冰上孵育5分钟。
- 通过在4°C下以3，000× g 离心10分钟来收获细胞。
注意：此时，细胞可以冷冻并储存在-80°C。 - 将细胞重悬于冷藏的 700 μL 多聚体提取缓冲液中（20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl 2、1 mM DTT、1% Triton X-100、0.1 mg/mL 环己胺、0.2 mg/mL 肝素）。加入 100 单位的 RNase 抑制剂并将其转移到 1.5 mL 离心管中。
- 向离心管中加入~400μL尺寸范围为425-600μm的预冷玻璃珠。通过在打珠器中剧烈搅拌5分钟来破坏酵母细胞。
- 通过在4°C下以8，000× g 离心5分钟来澄清裂解物。
- 通过使用分光光度计或使用基于荧光的RNA检测系统测量260nm处的吸光度来确定澄清裂解物中RNA的浓度。
注意：要获得非常准确的RNA浓度测量，请使用基于荧光的RNA检测试剂盒。 - 确保RNA浓度为0.5-1μg/μL。如果RNA浓度太低，请在未来的实验中减少用于重悬细胞的多聚体提取缓冲液的体积。
注意：裂解和RNA定量后立即将裂解物加载到梯度上。如有必要，将裂解物在液氮中快速冷冻，并在-80°C下储存几天。
3. 梯度离心
- 小心地将裂解物加载到梯度的顶部。将移液器吸头靠在聚丙烯管顶部的内壁上。轻轻地倾斜试管，并通过滴在壁上慢慢将裂解物分配到梯度的顶部。上样裂解物时，请非常小心，不要破坏或干扰梯度。
注意：上样的裂解物量因细胞类型而异。RNA的含量也会有所不同。可能需要进行许多实验以确定生成最佳多聚体谱所需的裂解物量。对于酵母，300 μg RNA 是优化的良好起点。 - 轻轻地将管子放入摆动式铲斗转子的预冷桶中。
注意：每个聚丙烯离心管应具有相等的梯度体积和加载的裂解物量。这可能因管而异。确保变异在超速离心过程中不会导致不平衡误差。 - 在4°C下以260，110× g 离心梯度150分钟。
4. 馏分和数据收集
- 小心地从水平吊斗转子上取下离心管，并将其放入管架中。
- 标记96孔板以储存馏分并在冰上预冷。
注意：使用适用于分光光度计的 96 孔板，该分光光度计的光学窗口低至 230 nm，用于 260 nm/280 nm 的核酸测定。 - 小心地将移液器吸头插入梯度顶部，从梯度顶部开始收集 100 μL 或 200 μL 级分。收集馏分，直到整个梯度被等分。分数的数量将取决于总梯度体积。
注意：以不破坏梯度其余部分的方式收集分数。确保所有分数的体积相等。除了手动分馏外，另一种低成本的分馏方法是使用小型蠕动泵。 - 将每个馏分转移到96孔板中以到达离心管的底部。将收集的馏分始终放在冰上。
- 用分光光度计测量每个级分在254nm处的吸光度。使用7%和47%蔗糖溶液作为空白。
注意：测量馏分的吸光度时，请记住，对于大多数光谱仪和色度计，最有效的吸光度范围为0.1-1。如果吸光度测量值超出范围（≥1.0），则馏分的材料过多。稀释样品，重新收集数据，然后在绘制轮廓时考虑稀释因子。 - 通过绘制分数数与吸光度的关系来创建多聚体谱图。
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Representative Results
图3显示了三个代表性的多聚体谱。所有配置文件都来自相同的酵母菌株。典型的多体谱将具有40S，60S和80S核糖体亚基以及多聚体的良好分离峰。每个核糖体亚基和多聚体峰的嵴在每个轮廓上都很明显（图3）。自动密度分馏系统的代表性曲线如图3A所示。用于生成该轮廓的蔗糖梯度是按照本协议中所述手动制备的。图3A所示的曲线由连续吸光度曲线产生，因为蔗糖梯度被通过检测器流通池的追逐溶液自下而上移位并分馏收集。由于这些系统连续测量吸光度，因此可以记录1，500多个数据点。手动生成相同数量的数据点是不切实际的。通常用于手动分析的馏分体积为100-200 μL。在此范围内的一小部分体积可产生具有足够细节的轮廓，以进行大多数比较分析。从100 μL和200 μL分级分离中获得的代表性结果如图3B和图3C所示。所提供的所有三种图谱都利用按照本协议中所述制备的蔗糖梯度来比较产生的数据。对于利用梯度制造商制备蔗糖梯度而不是本协议中描述的手动制备的多体谱的示例，Chikashige等人最近的手稿有几个使用自动梯度制造商和分馏系统生成的梯度谱的示例13。
| 最终浓度 | mL 7% 原液 | mL 47% 原液 |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
表1：蔗糖溶液的制备。 通过按指定体积分配和混合 7% 和 47% 蔗糖储备溶液，制备 14 mL 的 17%、27% 和 37% 蔗糖溶液。
图1：组装好的针头和注射器。 带有汉密尔顿针尖式 3 吸头的 9 英寸、22 G 针头通过鲁尔锁定机构连接到 3 mL 注射器。 请点击此处查看此图的大图。
图2：7%-47%蔗糖梯度层的最终外观。 7%，17%，27%，37%和47%蔗糖溶液分层在另一种溶液之上，如协议中所述。17% 和 37% 图层添加了蓝色，以帮助区分照片的图层;进行实际实验时不应添加着色。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：多聚体谱图。 用于生成这些谱的所有蔗糖梯度均使用本协议中描述的方法制备。（A）由自动分馏系统（布兰德尔分馏器）生成的多聚体图谱。（B） 通过手动分馏当前协议中描述的 200 μL 样品生成的多聚体谱。（C） 通过手动分馏当前协议中描述的 100 μL 样品生成的多聚体图谱。每个谱图都标明了多聚体、40S、60S和80S峰。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述了一种无需使用昂贵的自动分馏系统即可创建多聚体谱的方法。这种方法的优点是，它使没有自动分级分离系统的实验室可以使用多聚体分析。与专用密度分级分离系统相比，该方案的主要缺点是繁琐的手工分馏和灵敏度降低。
该方案需要仔细制备蔗糖梯度，其分辨率足以分离核糖体亚基，单体和多聚体。在制备蔗糖梯度时，在加载梯度层时不要引入气泡至关重要。气泡从底部上升到顶部，会破坏梯度的线性。此外，每次使用前应擦拭针头的外部，并从腔中吸出多余的蔗糖溶液，以确保每个梯度层的完整性。梯度在4°C下过夜储存必须在冷藏室中进行。压缩机在冰箱中打开和关闭引起的振动会破坏梯度。
该测定的另一个关键部分是梯度的体积和RNA的浓度。14 mm x 89 mm 离心管可容纳 12 mL 的体积，但这是这些离心管可以容纳的最大体积，该体积通常被认为是这些管装满。不会过度填充这些试管的最大工作体积为 11.5 mL。蔗糖梯度本身的体积为 10 mL;因此，用于重悬细胞的多聚体提取缓冲液的体积不应超过1.5mL。生成良好谱所需的RNA量因细胞类型而异。应进行多次初始运行以确定多少量的RNA产生良好的多聚体谱。一旦确定该量，应始终将其与该特定细胞类型一起使用，以保持可重复性并能够进行比较分析。此外，为了确保每次上样相同数量的RNA，用于RNA定量的方法必须始终相同。如果使用分光光度计定量RNA，则应始终使用它。如果使用荧光计，则应始终使用。仪器和定量技术在准确性和灵敏度方面差异很大。利用不同的仪器或技术对RNA实验进行定量不会产生可重复的结果。
该方法可以调整为获取有关细胞中蛋白质翻译状态的重要信息。如上所述，可以确定组装过程中核糖体亚基本身的状况。在没有抑制伸长率的环己胺的情况下进行实验，可以进行径流速率分析，这表明伸长率是否改变26。单个馏分是进一步实验和分析的宝贵材料来源。例如，这些级分可用于北方或蛋白质印迹方案，以鉴定与核糖体亚群相关的特定RNA或蛋白质。最后，可以从级分中提取RNA，并通过微阵列分析13，27 或通过对由总mRNA28生成的DNA文库进行深度测序分析来鉴定与活性核糖体结合的mRNA。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Percy Tumbale博士和Melissa Wells博士对这份手稿的批判性阅读。这项工作得到了美国国家卫生研究院校内研究计划的支持;美国国家环境健康科学研究所（NIEHS;ZIA ES103247 至 R.E.S）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
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