Summary
Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.
Abstract
Il frazionamento dei polisomi mediante centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio è un potente strumento che può essere utilizzato per creare profili ribosomiali, identificare specifici mRNA tradotti dai ribosomi e analizzare i fattori associati ai polisomi. Mentre i produttori automatici di gradienti e i sistemi di frazionamento del gradiente sono comunemente usati con questa tecnica, questi sistemi sono generalmente costosi e possono essere proibitivi in termini di costi per i laboratori che hanno risorse limitate o non possono giustificare la spesa a causa della loro rara o occasionale necessità di eseguire questo metodo per la loro ricerca. Qui, viene presentato un protocollo per generare in modo riproducibile profili polisomici utilizzando attrezzature standard disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare senza strumenti di frazionamento specializzati. Inoltre, viene fornito un confronto dei profili polisomici generati con e senza un sistema di frazionamento del gradiente. Vengono discusse le strategie per ottimizzare e produrre profili polisomici riproducibili. Saccharomyces cerevisiae è utilizzato come organismo modello in questo protocollo. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente modificato e adattato per generare profili ribosomi per molti organismi e tipi di cellule diversi.
Introduction
I ribosomi sono complessi ribonucleoproteici mega-Dalton che svolgono il processo fondamentale di traduzione dell'mRNA in proteine. I ribosomi sono responsabili della sintesi di tutte le proteine all'interno di una cellula. I ribosomi eucariotici comprendono due subunità designate come la piccola subunità ribosomiale (40S) e la grande subunità ribosomiale (60S) in base ai loro coefficienti di sedimentazione. Il ribosoma completamente assemblato è designato come monosoma 80S. I polisomi sono gruppi di ribosomi impegnati nella traduzione di una singola molecola di mRNA. Il frazionamento dei polisomi mediante la centrifugazione del gradiente di densità del saccarosio è un potente metodo utilizzato per creare profili ribosomiali, identificare specifici mRNA associati alla traduzione dei ribosomi e analizzare i fattori associati ai polisomi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Questa tecnica è spesso usata per separare i polisomi da singoli ribosomi, subunità ribosomiali e particelle ribonucleoproteiche messaggere. I profili ottenuti dal frazionamento possono fornire preziose informazioni riguardanti l'attività di traslazione dei polisomi14 e lo stato di assemblaggio dei ribosomi15,16,17.
L'assemblaggio dei ribosomi è un processo molto complesso facilitato da un gruppo di proteine note come fattori di assemblaggio dei ribosomi 18,19,20,21. Questi fattori svolgono una vasta gamma di funzioni durante la biogenesi dei ribosomi attraverso interazioni con molte altre proteine, tra cui ATPasi, endo- ed eso-nucleasi, GTPasi, elicasi di RNA e proteine leganti l'RNA22. Il frazionamento dei polisomi è stato un potente strumento utilizzato per studiare il ruolo di questi fattori nell'assemblaggio dei ribosomi. Ad esempio, questo metodo è stato utilizzato per dimostrare come le mutazioni nella polinucleotide chinasi Grc3, un fattore di elaborazione pre-rRNA, possano influenzare negativamente il processo di assemblaggio del ribosoma17,23. Il profilo dei polisomi ha anche evidenziato e mostrato come i motivi conservati all'interno dell'ATPasi Rix7 siano essenziali per la produzione di ribosomi16.
La procedura per il frazionamento dei polisomi inizia con la produzione di lisati cellulari solubili da cellule di interesse. Il lisato contiene RNA, subunità ribosomiali e polisomi, nonché altri componenti cellulari solubili. Un gradiente di saccarosio continuo e lineare viene realizzato all'interno di un tubo di ultracentrifuga. La frazione solubile del lisato cellulare viene caricata delicatamente sulla parte superiore del tubo gradiente di saccarosio. Il tubo gradiente caricato viene quindi sottoposto a centrifugazione, che separa i componenti cellulari per dimensione all'interno del gradiente di saccarosio dalla forza di gravità. I componenti più grandi viaggiano più nel gradiente rispetto ai componenti più piccoli. La parte superiore del gradiente ospita i componenti cellulari più piccoli e più lenti, mentre i componenti cellulari più grandi e più veloci si trovano nella parte inferiore. Dopo la centrifugazione, il contenuto del tubo viene raccolto come frazioni. Questo metodo separa efficacemente subunità ribosomiali, monosomi e polisomi. La densità ottica di ciascuna frazione viene quindi determinata misurando l'assorbanza spettrale a una lunghezza d'onda di 254 nm. Tracciando l'assorbanza rispetto al numero di frazioni si ottiene un profilo polisomico.
I gradienti lineari di densità del saccarosio possono essere generati utilizzando un generatore di gradienti. Dopo la centrifugazione, i gradienti vengono spesso frazionati e le assorbanze misurate utilizzando un sistema automatico di frazionamento della densità 3,7,13,24,25. Mentre questi sistemi funzionano molto bene per produrre profili polisomici, sono costosi e possono essere proibitivi dal punto di vista dei costi per alcuni laboratori. Qui viene presentato un protocollo per generare profili polisomici senza l'uso di questi strumenti. Invece, questo protocollo utilizza apparecchiature tipicamente disponibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare.
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Protocol
1. Preparazione di gradienti di saccarosio del 7% - 47%
NOTA: L'intervallo lineare del gradiente di saccarosio può essere modificato per ottenere una migliore separazione a seconda del tipo di cella utilizzata. Questo protocollo è ottimizzato per i profili polisomici per S. cerevisiae.
- Preparare soluzioni madre di saccarosio al 7% e al 47% in tampone sfumato di saccarosio (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 1 mM DTT). Filtrare le soluzioni madre di saccarosio attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C.
- Preparare 14 mL di soluzioni di saccarosio al 17%, 27% e 37% erogando e miscelando le soluzioni madre di saccarosio al 7% e al 47% secondo le modalità descritte nella Tabella 1.
- Posizionare sei provette da centrifuga in polipropilene (14 x 89 mm) in un rack per provette a vista completa. Assicurarsi uno spazio sufficiente tra i tubi in modo che le azioni con un tubo non disturbino gli altri.
- Collegare un ago lungo a una siringa da 3 ml. Per questo protocollo, utilizzare un ago da 9 pollici, 22 G con una punta smussata (Figura 1), ma qualsiasi ago abbastanza lungo da raggiungere il fondo del tubo della centrifuga sarà sufficiente.
NOTA: Eseguire un riempimento di prova e una dispensazione per assicurarsi che la siringa possa contenere la soluzione di saccarosio senza gocciolamento prima di impostare i gradienti. - Aggiungere 2 ml di saccarosio al 7% sul fondo di ciascuna provetta da centrifuga.
- Aggiungere 2 mL di saccarosio al 17% sotto la soluzione al 7% posizionando la punta dell'ago nelle immediate vicinanze del fondo del tubo ed erogando la soluzione lentamente e con attenzione.
- Ripetere con 2 ml ciascuna delle soluzioni di saccarosio al 27%, 37% e 47%. Assicuratevi che ogni strato sia distinguibile l'uno dall'altro da una linea che segna la separazione delle densità (Figura 2).
NOTA: Se i gradienti non verranno utilizzati entro 48 ore, a questo punto, prima del loro assestamento in un gradiente continuo, congelare i tubi con soluzioni di saccarosio stratificate in azoto liquido e conservarli in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine. - Conservare i gradienti a 4 °C durante la notte per consentire ai gradienti di stabilizzarsi in una percentuale continua e crescente di saccarosio. Ci vogliono 8-12 ore perché le soluzioni di saccarosio stratificate si depositino in un gradiente lineare di saccarosio. Le pendenze lineari sono stabili fino a 48 ore. La conservazione notturna a 4 °C fornisce tempo sufficiente per lo scongelamento e la sedimentazione in un gradiente lineare per l'utilizzo di soluzioni di saccarosio congelate e stratificate. Utilizzare un densitometro per valutare la qualità del gradiente.
NOTA: è fondamentale conservare i gradienti in un luogo stabile in cui non vengano disturbati, poiché eventuali movimenti o vibrazioni interromperanno il gradiente.
2. Preparazione di estratti di cellule di lievito
- Inoculare il ceppo di lievito di interesse in 50 ml di estratto di peptone destrosio (YPD) e crescere durante la notte a 30 °C in un incubatore agitatore fino alla fase stazionaria.
NOTA: La temperatura può variare a seconda dei requisiti del ceppo di lievito. - Trasferire 10 ml di coltura in fase stazionaria in 1 L di terreno YPD fresco. Incubare le cellule con agitazione vigorosa a 30 °C (o altra temperatura adatta) fino a quando la coltura raggiunge la fase di crescita esponenziale media (OD600 = 0,4-0,6).
- Nella fase di crescita esponenziale media, aggiungere cicloeximide alla coltura ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml. Incubare su ghiaccio per 5 min.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
NOTA: A questo punto, le cellule possono essere congelate e conservate a -80 °C. - Risospendere le cellule in 700 μL refrigerati di tampone di estrazione polisomica (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/mL di cicloeximide, 0,2 mg/mL di eparina). Aggiungere 100 unità di inibitore della RNasi e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere ~ 400 μL di perle di vetro pre-refrigerate con un intervallo di dimensioni di 425-600 μm al tubo della centrifuga. Interrompere le cellule di lievito agitando vigorosamente in un battiperline per 5 minuti.
- Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Determinare la concentrazione dell'RNA nel lisato chiarificato misurando l'assorbanza a 260 nm con uno spettrofotometro o utilizzando un sistema di rilevamento dell'RNA basato sulla fluorescenza.
NOTA: Per misurazioni molto accurate della concentrazione di RNA, utilizzare kit di rilevamento dell'RNA basati sulla fluorescenza. - Assicurarsi che la concentrazione di RNA sia 0,5-1 μg/μL. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, ridurre il volume del tampone di estrazione dei polisomi utilizzato per risospendere le cellule in esperimenti futuri.
NOTA: Caricare il lisato sui gradienti immediatamente dopo la lisi e la quantificazione dell'RNA. Se necessario, congelare i lisati in azoto liquido e conservare a -80 °C per alcuni giorni.
3. Centrifugazione dei gradienti
- Caricare con attenzione il lisato sulla parte superiore delle sfumature. Posizionare la punta della pipetta contro la parete interna, nella parte superiore del tubo di polipropilene. Inclinare delicatamente il tubo e distribuire lentamente il lisato sulla parte superiore della pendenza gocciolando contro il muro. Fare molta attenzione a non disturbare o disturbare il gradiente durante il caricamento del lisato.
NOTA: la quantità di lisato caricata varia in base al tipo di cella. Anche il contenuto dell'RNA varierà. Potrebbe essere necessario eseguire una serie di esperimenti per determinare la quantità di lisato necessaria per generare un profilo polisomico ottimale. Per il lievito, 300 μg di RNA sono un buon punto di partenza per l'ottimizzazione. - Posizionare delicatamente i tubi nei secchi pre-refrigerati di un rotore a benna oscillante.
NOTA: Ogni tubo di centrifuga in polipropilene deve avere uguali volumi di gradiente e la quantità di lisato caricato. Questo può variare da tubo a tubo. Assicurarsi che la variazione non causi un errore di squilibrio durante l'ultracentrifugazione. - Centrifugare le pendenze a 260,110 x g per 150 minuti a 4 °C.
4. Frazione e raccolta dei dati
- Rimuovere con cautela i tubi della centrifuga dal rotore della benna oscillante e posizionarli in un portatubi.
- Etichettare le piastre a 96 pozzetti per conservare le frazioni e pre-raffreddarle sul ghiaccio.
NOTA: Utilizzare una piastra a 96 pozzetti adatta per uno spettrofotometro con una finestra ottica fino a 230 nm per le determinazioni degli acidi nucleici a 260 nm/280 nm. - Raccogliere frazioni da 100 μL o 200 μL partendo dalla parte superiore del gradiente inserendo con attenzione la punta di un pipet nella parte superiore del gradiente. Raccogliete le frazioni fino a quando l'intero gradiente non viene aliquotato. Il numero di frazioni dipenderà dal volume totale del gradiente.
NOTA: raccogliete le frazioni in modo da non interrompere il resto della sfumatura. Assicurarsi che tutte le frazioni abbiano lo stesso volume. Oltre al frazionamento manuale, un altro metodo a basso costo per il frazionamento consiste nell'utilizzare una piccola pompa peristaltica. - Trasferire ogni frazione nella piastra a 96 pozzetti per raggiungere il fondo del tubo della centrifuga. Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio in ogni momento.
- Misurare l'assorbanza di ciascuna frazione a 254 nm con uno spettrofotometro. Utilizzare le soluzioni di saccarosio al 7% e al 47% come spazi vuoti.
NOTA: Quando si misura l'assorbanza delle frazioni, tenere presente che per la maggior parte degli spettrometri e colorimetri, l'intervallo di assorbanza più efficace è 0,1-1. Se le misure di assorbanza sono fuori intervallo (≥1.0), le frazioni hanno troppo materiale. Diluire il campione, raccogliere nuovamente i dati e quindi tenere conto del fattore di diluizione quando si traccia il profilo. - Create il profilo del polisoma tracciando il numero di frazione rispetto all'assorbanza.
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Representative Results
Tre profili polisomici rappresentativi sono mostrati nella Figura 3. Tutti i profili provengono dallo stesso ceppo di lievito. Un tipico profilo polisomico avrà picchi ben risolti per le subunità ribosomiali 40S, 60S e 80S e per i polisomi. La cresta di ogni subunità ribosomiale e picco polisomico sarà evidente su ciascun profilo (Figura 3). Un profilo rappresentativo di un sistema automatico di frazionamento della densità è mostrato nella Figura 3A. I gradienti di saccarosio utilizzati per generare questo profilo sono stati preparati a mano come descritto in questo protocollo. Questo profilo mostrato nella Figura 3A è stato prodotto da un profilo di assorbanza continua quando il gradiente di saccarosio è stato spostato dal basso verso l'alto da una soluzione di inseguimento attraverso una cella di flusso del rivelatore e raccolto in frazioni. Poiché questi sistemi misurano continuamente l'assorbanza, possono registrare oltre 1.500 punti dati. Non è pratico generare manualmente lo stesso numero di punti dati. Il volume di frazione generalmente utilizzato per i profili manuali è di 100-200 μL. Un volume frazionario all'interno di questo intervallo produce un profilo con dettagli sufficienti per la maggior parte delle analisi comparative. I risultati rappresentativi ottenuti da frazionamenti sia da 100 μL che da 200 μL sono mostrati nella Figura 3B e nella Figura 3C. Tutti e tre i profili presentati hanno utilizzato gradienti di saccarosio preparati come descritto in questo protocollo per confrontare i dati prodotti. Per un esempio di un profilo polisomico che utilizza un generatore di gradienti per preparare gradienti di saccarosio rispetto alla preparazione manuale descritta in questo protocollo, un recente manoscritto di Chikashige et al. ha diversi esempi di profili di gradiente generati utilizzando un generatore di gradienti automatizzato e un sistema di frazionamento13.
| Concentrazione finale | mL di 7% Stock | mL di 47% Stock |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tabella 1: Preparazione delle soluzioni di saccarosio. Preparare 14 ml di soluzioni di saccarosio al 17%, 27% e 37% erogando e mescolando le soluzioni di saccarosio al 7% e al 47% nei volumi indicati.
Figura 1: Ago e siringa assemblati. Un ago da 9 pollici, 22 G con punta Hamilton a 3 punte in stile ago collegato a una siringa da 3 ml tramite un meccanismo di blocco Luer. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: L'aspetto finale degli strati sfumati di saccarosio del 7%-47%. Soluzioni di saccarosio al 7%, 17%, 27%, 37% e 47% sovrapposte a un altro come descritto nel protocollo. Gli strati del 17% e del 37% avevano una colorazione blu aggiunta per aiutare a distinguere gli strati per una fotografia; Nessuna colorazione deve essere aggiunta quando si esegue un esperimento reale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Profili polisomici. Tutti i gradienti di saccarosio utilizzati per generare questi profili sono stati preparati utilizzando il metodo descritto in questo protocollo. (A) Il profilo polisomico generato da un sistema di frazionamento automatizzato (Brandel Fractionator). (B) Il profilo polisomico generato dal frazionamento manuale di campioni di 200 μL descritto nel protocollo attuale. (C) Il profilo polisomico generato dal frazionamento manuale di campioni di 100 μL descritto nel protocollo attuale. Polisomi, picchi 40S, 60S e 80S sono indicati per ogni profilo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Qui è stato descritto un metodo per creare profili polisomici senza l'uso di costosi sistemi di frazionamento automatizzati. Il vantaggio di questo metodo è che rende la profilazione dei polisomi accessibile ai laboratori che non dispongono di sistemi di frazionamento automatizzati. I principali svantaggi di questo protocollo sono il noioso frazionamento manuale e la ridotta sensibilità rispetto al sistema di frazionamento a densità dedicato.
Questo protocollo prevede un'attenta preparazione dei gradienti di saccarosio con risoluzione sufficiente a separare subunità ribosomiali, monosomi e polisomi. Quando si preparano i gradienti di saccarosio, è fondamentale non introdurre bolle d'aria durante il caricamento degli strati sfumati. Le bolle d'aria salgono verso l'alto dal basso e possono interrompere la linearità del gradiente. Inoltre, l'esterno dell'ago deve essere pulito prima di ogni utilizzo e la soluzione di saccarosio in eccesso deve essere eliminata dal lume per garantire l'integrità di ogni strato sfumato. La conservazione notturna delle pendenze a 4 °C deve essere effettuata in una cella frigorifera. Le vibrazioni causate dall'accensione e dallo spegnimento di un compressore in un frigorifero possono disturbare la pendenza.
Un'altra parte critica di questo test è il volume del gradiente e la concentrazione dell'RNA. I tubi da centrifuga da 14 mm x 89 mm possono contenere un volume di 12 ml, ma questo è il volume massimo che può essere ospitato da questi tubi e questo volume è tipicamente pensato come riempimento eccessivo di questi tubi. Un buon volume di lavoro massimo che non riempie eccessivamente questi tubi è di 11,5 ml. Il gradiente di saccarosio stesso ha un volume di 10 ml; pertanto, il volume del tampone di estrazione dei polisomi utilizzato per risospendere le cellule non deve superare 1,5 ml. La quantità di RNA necessaria per generare un buon profilo varierà in base al tipo di cellula. Un certo numero di esecuzioni iniziali dovrebbe essere eseguito per determinare quale quantità di RNA genera un buon profilo polisomico. Una volta determinata questa quantità, dovrebbe sempre essere utilizzata con quel tipo specifico di cellula per mantenere la riproducibilità e per essere in grado di fare analisi comparative. Inoltre, per garantire che la stessa quantità di RNA venga caricata ogni volta, il metodo utilizzato per la quantificazione dell'RNA deve essere sempre lo stesso. Se uno spettrofotometro viene utilizzato per quantificare l'RNA, allora dovrebbe essere usato in ogni momento. Se viene utilizzato un fluorometro, dovrebbe essere usato in ogni momento. Gli strumenti e le tecniche di quantificazione variano ampiamente sia in termini di accuratezza che di sensibilità. L'utilizzo di diversi strumenti o tecniche per quantificare l'esperimento dell'RNA non genererà risultati riproducibili.
Questo metodo può essere adattato per ottenere informazioni importanti sullo stato della traduzione proteica in una cellula. Come accennato in precedenza, è possibile determinare la condizione delle subunità ribosomiali stesse all'interno del processo di assemblaggio. L'esecuzione di esperimenti in assenza di cicloeximide, che inibisce l'allungamento, consente l'analisi della velocità di deflusso, che indica se l'allungamento è alterato o meno26. Le singole frazioni sono una preziosa fonte di materiale per ulteriori esperimenti e analisi. Ad esempio, le frazioni possono essere utilizzate nei protocolli di blotting settentrionali o occidentali per identificare uno specifico RNA o proteina associata a sottopopolazioni ribosomiali. Infine, l'RNA può essere estratto dalle frazioni e utilizzato per identificare mRNA legati a ribosomi attivi mediante analisi microarray13,27 o mediante analisi di sequenziamento profondo su una libreria di DNA generata dall'mRNA totale 28.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. Percy Tumbale e la Dr. Melissa Wells per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto nazionale statunitense di scienze della salute ambientale (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
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