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Biochemistry

ग्रेडिएंट मेकर्स या फ्रैक्शनेशन सिस्टम के बिना पॉलीसोम प्रोफाइलिंग

Published: June 1, 2021 doi: 10.3791/62680
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि स्वचालित ढाल निर्माताओं या ढाल विभाजन प्रणालियों का उपयोग किए बिना पॉलीसोम प्रोफ़ाइल कैसे उत्पन्न करें।

Abstract

सुक्रोज घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग राइबोसोम प्रोफाइल बनाने, राइबोसोम द्वारा अनुवादित विशिष्ट एमआरएनए की पहचान करने और पॉलीसोम से जुड़े कारकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। जबकि स्वचालित ढाल निर्माताओं और ढाल विभाजन प्रणालियों का उपयोग आमतौर पर इस तकनीक के साथ किया जाता है, ये सिस्टम आम तौर पर महंगे होते हैं और उन प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकते हैं जिनके पास सीमित संसाधन हैं या अपने शोध के लिए इस पद्धति को करने की उनकी असंगत या सामयिक आवश्यकता के कारण खर्च को सही नहीं ठहरा सकते हैं। यहां, विशेष विभाजन उपकरणों के बिना अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध मानक उपकरणों का उपयोग करके पॉलीसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, ग्रेडिएंट फ्रैक्शनेशन सिस्टम के साथ और बिना उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल की तुलना प्रदान की जाती है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पॉलीसोम प्रोफाइल को अनुकूलित करने और उत्पादन करने की रणनीतियों पर चर्चा की जाती है। इस प्रोटोकॉल में एक मॉडल जीव के रूप में सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को कई अलग-अलग जीवों और सेल प्रकारों के लिए राइबोसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए आसानी से संशोधित और अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

राइबोसोम मेगा-डाल्टन राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हैं जो एमआरएनए को प्रोटीन में अनुवाद करने की मौलिक प्रक्रिया करते हैं। राइबोसोम एक कोशिका के भीतर सभी प्रोटीनों के संश्लेषण को पूरा करने के लिए जिम्मेदार हैं। यूकेरियोटिक राइबोसोम में उनके अवसादन गुणांक के अनुसार छोटे राइबोसोमल सबयूनिट (40 एस) और बड़े राइबोसोमल सबयूनिट (60 एस) के रूप में नामित दो सबयूनिट शामिल हैं। पूरी तरह से इकट्ठे राइबोसोम को 80 एस मोनोसोम के रूप में नामित किया गया है। पॉलीसोम राइबोसोम के समूह हैं जो एक एमआरएनए अणु का अनुवाद करने में लगे हुए हैं। सुक्रोज घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन राइबोसोम प्रोफाइल बनाने, राइबोसोम का अनुवाद करने से जुड़े विशिष्ट एमआरएनए की पहचान करने और पॉलीसोम से जुड़े कारकों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक शक्तिशाली विधि है , 13. इस तकनीक का उपयोग अक्सर एकल राइबोसोम, राइबोसोमल सबयूनिट्स और मैसेंजर राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कणों से पॉलीसोम को अलग करने के लिए किया जाता है। फ्रैक्शनेशन से प्राप्त प्रोफाइल पॉलीसोम 14 की अनुवाद गतिविधि और राइबोसोम 15,16,17 की असेंबली स्थिति के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

राइबोसोम असेंबली प्रोटीन के एक समूह द्वारा सुगम एक बहुत ही जटिल प्रक्रिया है जिसे राइबोसोम असेंबली फैक्टर18,19,20,21 के रूप में जाना जाता है। ये कारक एटीपीस, एंडो- और एक्सो-न्यूक्लियस, जीटीपेस, आरएनए हेलिकेस और आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन22 सहित कई अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत के माध्यम से राइबोसोम बायोजेनेसिस के दौरान कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला करते हैं। पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन राइबोसोम असेंबली में इन कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली उपकरण रहा है। उदाहरण के लिए, इस विधि का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया है कि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज जीआरसी 3, एक पूर्व-आरआरएनए प्रसंस्करण कारक में उत्परिवर्तन राइबोसोम असेंबली प्रक्रिया17,23 को नकारात्मक रूप से कैसे प्रभावित कर सकता है। पॉलीसोम प्रोफाइलिंग ने भी प्रकाश डाला है और दिखाया है कि एटीपीस रिक्स 7 के भीतर संरक्षित रूपांकन राइबोसोम उत्पादन16 के लिए आवश्यक हैं।

पॉलीसोम फ्रैक्शनेशन की प्रक्रिया रुचि की कोशिकाओं से घुलनशील सेल लाइसेट बनाने के साथ शुरू होती है। लाइसेट में आरएनए, राइबोसोमल सबयूनिट्स और पॉलीसोम, साथ ही अन्य घुलनशील सेलुलर घटक होते हैं। एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर एक निरंतर, रैखिक सुक्रोज ढाल बनाया जाता है। सेल लाइसेट के घुलनशील अंश को धीरे से सुक्रोज ग्रेडिएंट ट्यूब के शीर्ष पर लोड किया जाता है। लोडेड ग्रेडिएंट ट्यूब को तब सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है, जो गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा सुक्रोज ढाल के भीतर आकार द्वारा सेलुलर घटकों को अलग करता है। बड़े घटक छोटे घटकों की तुलना में ढाल में आगे यात्रा करते हैं। ढाल के शीर्ष पर छोटे, धीमी गति से यात्रा करने वाले सेलुलर घटक होते हैं, जबकि बड़े, तेज यात्रा करने वाले सेलुलर घटक नीचे पाए जाते हैं। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूब की सामग्री को अंशों के रूप में एकत्र किया जाता है। यह विधि प्रभावी रूप से राइबोसोमल सबयूनिट्स, मोनोसोम और पॉलीसोम को अलग करती है। प्रत्येक अंश का ऑप्टिकल घनत्व तब 254 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर वर्णक्रमीय अवशोषण को मापकर निर्धारित किया जाता है। अवशोषण बनाम अंश संख्या को प्लॉट करने से एक पॉलीसोम प्रोफ़ाइल उत्पन्न होती है।

रैखिक सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट को ग्रेडिएंट निर्माता का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्रेडिएंट ्स को अक्सर अंशित किया जाता है, और एक स्वचालित घनत्व फ्रैक्शनेशन सिस्टम 3,7,13,24,25 का उपयोग करके अवशोषण मापा जाता है। जबकि ये सिस्टम पॉलीसोम प्रोफाइल का उत्पादन करने के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं, वे महंगे हैं और कुछ प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकते हैं। यहां इन उपकरणों के उपयोग के बिना पॉलीसोम प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इसके बजाय, यह प्रोटोकॉल आमतौर पर अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है।

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Protocol

1. 7% - 47% सुक्रोज ग्रेडिएंट की तैयारी

नोट: सुक्रोज ढाल की रैखिक सीमा को उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर बेहतर पृथक्करण प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल S. Cerevisiae के लिए पॉलीसोम प्रोफाइल के लिए अनुकूलित है।

  1. सुक्रोज ग्रेडिएंट बफर (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, और 1 mM DTT) में 7% और 47% सुक्रोज के स्टॉक समाधान तैयार करें। सुक्रोज स्टॉक समाधान को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और 4 °C पर स्टोर करें।
  2. तालिका 1 में वर्णित तरीके से 7% और 47% सुक्रोज स्टॉक समाधानों को वितरित और मिलाकर 17%, 27%, और 37% सुक्रोज समाधानों के 14 एमएल तैयार करें।
  3. छह पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (14 x 89 मिमी) को एक पूर्ण दृश्य टेस्ट ट्यूब रैक में रखें। ट्यूबों के बीच पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करें ताकि एक ट्यूब के साथ क्रियाएं दूसरों को परेशान न करें।
  4. एक 3 एमएल सिरिंज के साथ एक लंबी सुई संलग्न करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक कुंद टिप (चित्रा 1) के साथ 9 इंच, 22 जी सुई का उपयोग करें, लेकिन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल तक पहुंचने के लिए पर्याप्त लंबी कोई भी सुई पर्याप्त होगी।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण भरण और वितरण करें कि सिरिंज ग्रेडिएंट ्स स्थापित करने से पहले बिना किसी टपकाए सुक्रोज समाधान को पकड़ सकती है।
  5. प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के निचले भाग में 7% सुक्रोज का 2 एमएल जोड़ें।
  6. ट्यूब तल के तत्काल आसपास के क्षेत्र में सुई की नोक को रखकर और घोल को धीरे-धीरे और सावधानी से वितरित करके 7% समाधान के नीचे 17% सुक्रोज का 2 एमएल जोड़ें।
  7. 27%, 37%, और 47% सुक्रोज समाधानों में से प्रत्येक को 2 एमएल के साथ दोहराएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक परत घनत्व के पृथक्करण को चिह्नित करने वाली रेखा द्वारा एक दूसरे से अलग है (चित्रा 2)।
    नोट: यदि ग्रेडिएंट का उपयोग 48 घंटों के भीतर नहीं किया जा रहा है, तो इस बिंदु पर, निरंतर ढाल में उनके निपटान से पहले, तरल नाइट्रोजन में स्तरित सुक्रोज समाधान के साथ ट्यूबों को फ्लैश फ्रीज करें और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  8. ग्रेडिएंट्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ताकि ग्रेडिएंट ्स को सुक्रोज के निरंतर, बढ़ते प्रतिशत में बसने की अनुमति मिल सके। स्तरित सुक्रोज समाधानों को रैखिक सुक्रोज ढाल में बसने में 8-12 घंटे लगते हैं। रैखिक ग्रेडिएंट 48 घंटे तक स्थिर होते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भंडारण जमे हुए, स्तरित सुक्रोज समाधानों का उपयोग करने के लिए एक रैखिक ढाल में पिघलने और निपटान के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है। ढाल की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक डेंसिटोमीटर का उपयोग करें।
    नोट: ग्रेडिएंट को एक स्थिर स्थान पर संग्रहीत करना महत्वपूर्ण है जहां उन्हें परेशान नहीं किया जाएगा, क्योंकि कोई भी आंदोलन या कंपन ढाल को बाधित करेगा।

2. खमीर सेल अर्क की तैयारी

  1. खमीर निकालने वाले पेप्टोन डेक्सट्रोज (वाईपीडी) मीडिया के 50 एमएल में रुचि के खमीर तनाव को टीका लगाएं और स्थिर चरण में एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं।
    नोट: तापमान खमीर तनाव आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  2. स्थिर चरण संस्कृति के 10 एमएल को ताजा वाईपीडी मीडिया के 1 एल में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस (या अन्य उपयुक्त तापमान) पर जोरदार झटकों के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति मध्य-घातीय विकास चरण (ओडी600 = 0.4-0.6) तक नहीं पहुंच जाती।
  3. मध्य-घातीय विकास चरण में, 0.1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर संस्कृति में साइक्लोहेक्सिमाइड जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई करें।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. पॉलीसोम निष्कर्षण बफर (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% ट्राइटन X-100, 0.1 mg/mL साइक्लोहेक्सिमाइड, 0.2 mg/mL हेपरिन) के ठंडे 700 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया। RNase इनहिबिटर की 100 इकाइयाँ जोड़ें और इसे 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 425-600 μm की आकार सीमा के साथ ~ 400 μL प्री-चिल्ड ग्लास बीड्स जोड़ें। 5 मिनट के लिए एक मोती-बीटर में जोरदार आंदोलन द्वारा खमीर कोशिकाओं को बाधित करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा लाइसेट को स्पष्ट करें।
  8. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 260 एनएम पर अवशोषण को मापकर या फ्लोरेसेंस-आधारित आरएनए डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके स्पष्ट लाइसेट में आरएनए की एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: बहुत सटीक आरएनए एकाग्रता माप के लिए, प्रतिदीप्ति-आधारित आरएनए डिटेक्शन किट का उपयोग करें।
  9. सुनिश्चित करें कि आरएनए एकाग्रता 0.5-1 μg / यदि आरएनए एकाग्रता बहुत कम है, तो भविष्य के प्रयोगों में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पॉलीसोम निष्कर्षण बफर की मात्रा को कम करें।
    नोट: लाइसिस और आरएनए मात्रा के तुरंत बाद लाइसेट को ग्रेडिएंट पर लोड करें। यदि आवश्यक हो, तो फ्लैश लाइसेट को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और कुछ दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. ग्रेडिएंट्स का सेंट्रीफ्यूजेशन

  1. ग्रेडिएंट के शीर्ष पर लाइसेट को सावधानीपूर्वक लोड करें। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब के शीर्ष पर, आंतरिक दीवार के खिलाफ पिपेट टिप रखें। धीरे से ट्यूब को कोण दें और धीरे-धीरे दीवार के खिलाफ ड्रिबलिंग करके ढाल के शीर्ष पर लाइसेट को वितरित करें। लाइसेट लोड करते समय ढाल को बाधित या परेशान न करने के लिए बहुत सावधानी बरतें।
    नोट: लोड किए गए लाइसेट की मात्रा प्रति सेल प्रकार अलग-अलग होगी। आरएनए की सामग्री भी अलग-अलग होगी। इष्टतम पॉलीसोम प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लाइसेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई प्रयोग करना आवश्यक हो सकता है। खमीर के लिए, 300 μg RNA अनुकूलन के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
  2. धीरे से ट्यूबों को झूलते हुए बाल्टी रोटर की पूर्व-ठंडी बाल्टी में रखें।
    नोट: प्रत्येक पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ढाल की समान मात्रा और लोड किए गए लाइसेट की मात्रा होनी चाहिए। यह ट्यूब से ट्यूब में भिन्न हो सकता है। सुनिश्चित करें कि भिन्नता अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान असंतुलन त्रुटि का कारण नहीं बनती है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 150 मिनट के लिए 260,110 x g पर ग्रेडिएंट को सेंट्रीफ्यूज करें।

4. अंश और डेटा संग्रह

  1. स्विंगिंग बाल्टी रोटर से सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सावधानीपूर्वक हटा दें और उन्हें ट्यूब होल्डर में रखें।
  2. अंशों को संग्रहीत करने और बर्फ पर पूर्व-ठंड लगाने के लिए 96-वेल प्लेटों को लेबल करें।
    नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए उपयुक्त 96-वेल प्लेट का उपयोग करें जिसमें 260 एनएम / 280 एनएम पर न्यूक्लिक एसिड निर्धारण के लिए 230 एनएम तक ऑप्टिकल विंडो है।
  3. ढाल के शीर्ष में सावधानीपूर्वक एक पिपेट टिप डालकर ढाल के शीर्ष से शुरू होने वाले 100 μL या 200 μL अंशों को इकट्ठा करें। अंशों को तब तक एकत्र करें जब तक कि पूरे ढाल को अलग नहीं किया जाता है। अंशों की संख्या कुल ढाल मात्रा पर निर्भर करेगी।
    नोट: अंशों को इस तरह से इकट्ठा करें जो शेष ढाल को बाधित न करे। सुनिश्चित करें कि सभी अंशों में समान मात्रा है। मैनुअल फ्रैक्शनेशन के अलावा, फ्रैक्शनेशन के लिए एक और कम लागत वाली विधि एक छोटे पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करना है।
  4. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के निचले भाग तक पहुंचने के लिए प्रत्येक अंश को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। एकत्रित अंशों को हर समय बर्फ पर रखें।
  5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 254 एनएम पर प्रत्येक अंश के अवशोषण को मापें। रिक्त स्थान के रूप में 7% और 47% सुक्रोज समाधान का उपयोग करें।
    नोट: अंशों के अवशोषण को मापते समय, ध्यान रखें कि अधिकांश स्पेक्ट्रोमीटर और कलरमीटर के लिए, सबसे प्रभावी अवशोषण सीमा 0.1-1 है। यदि अवशोषण माप सीमा से बाहर हैं (≥1.0), तो अंशों में बहुत अधिक सामग्री होती है। नमूने को पतला करें, डेटा को याद करें, और फिर प्रोफ़ाइल को प्लॉट करते समय कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए खाता बनाएं।
  6. अंश संख्या बनाम अवशोषण को प्लॉट करके पॉलीसोम प्रोफ़ाइल बनाएं।

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Representative Results

तीन प्रतिनिधि पॉलीसोम प्रोफाइल चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। सभी प्रोफाइल एक ही खमीर तनाव से हैं। एक विशिष्ट पॉलीसोम प्रोफाइल में 40 एस, 60 एस और 80 एस राइबोसोमल सबयूनिट्स के साथ-साथ पॉलीसोम के लिए अच्छी तरह से हल की गई चोटियां होंगी। प्रत्येक राइबोसोमल सबयूनिट और पॉलीसोम शिखर की शिखा प्रत्येक प्रोफ़ाइल पर स्पष्ट होगी (चित्रा 3)। एक स्वचालित घनत्व विभाजन प्रणाली से एक प्रतिनिधि प्रोफ़ाइल चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। इस प्रोफ़ाइल को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सुक्रोज ग्रेडिएंट इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हाथ से तैयार किए गए थे। चित्रा 3 ए में दिखाया गया यह प्रोफ़ाइल एक निरंतर अवशोषण प्रोफ़ाइल से निर्मित किया गया था क्योंकि सुक्रोज ढाल को डिटेक्टर प्रवाह सेल के माध्यम से पीछा समाधान द्वारा नीचे से ऊपर विस्थापित किया गया था और अंशों में एकत्र किया गया था। क्योंकि ये सिस्टम लगातार अवशोषण को मापते हैं, वे 1,500 से अधिक डेटा बिंदुओं को रिकॉर्ड कर सकते हैं। मैन्युअल रूप से समान संख्या में डेटा बिंदु उत्पन्न करना अव्यावहारिक है। आम तौर पर मैनुअल प्रोफाइल के लिए उपयोग की जाने वाली अंश मात्रा 100-200 μL है। इस सीमा के भीतर एक अंश मात्रा अधिकांश तुलनात्मक विश्लेषणों के लिए पर्याप्त विवरण के साथ एक प्रोफ़ाइल उत्पन्न करती है। 100 μL और 200 μL दोनों से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3B और चित्रा 3C में दिखाए गए हैं। प्रस्तुत सभी तीन प्रोफाइल ने प्राप्त डेटा की तुलना करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित सुक्रोज ग्रेडिएंट का उपयोग किया। एक पॉलीसोम प्रोफाइल के उदाहरण के लिए जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित मैनुअल तैयारी के विपरीत सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करने के लिए एक ढाल निर्माता का उपयोग करता है, चिकाशिगे एट अल द्वारा हाल ही में पांडुलिपि में स्वचालित ढाल निर्माता और फ्रैक्शनेशन सिस्टम13 का उपयोग करके उत्पन्न ग्रेडिएंट प्रोफाइल के कई उदाहरण हैं।

अंतिम एकाग्रता 7% स्टॉक का एमएल 47% स्टॉक का एमएल
7% 14 0
17% 10.5 3.5
27% 7 7
37% 3.5 10.5
47% 0 14

तालिका 1: सुक्रोज समाधान की तैयारी। संकेतित मात्रा में 7% और 47% सुक्रोज स्टॉक समाधानों को वितरित और मिलाकर 17%, 27% और 37% सुक्रोज समाधानों के 14 एमएल तैयार करें।

Figure 1
चित्र 1: इकट्ठी सुई और सिरिंज। एक 9 इंच, 22 जी सुई जिसमें हैमिल्टन सुई बिंदु शैली 3 टिप है जो लूर लॉक तंत्र के माध्यम से 3 एमएल सिरिंज से जुड़ी हुई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 7% -47% सुक्रोज ढाल परतों की अंतिम उपस्थिति। प्रोटोकॉल में वर्णित 7%, 17%, 27%, 37%, और 47% सुक्रोज समाधान दूसरे के शीर्ष पर स्तरित हैं। 17% और 37% परतों में एक तस्वीर के लिए परतों को अलग करने में मदद करने के लिए नीले रंग को जोड़ा गया था; वास्तविक प्रयोग करते समय कोई रंग नहीं जोड़ा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पॉलीसोम प्रोफाइल। इन प्रोफाइल को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी सुक्रोज ग्रेडिएंट इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग करके तैयार किए गए थे। (ए) एक स्वचालित फ्रैक्शनेशन सिस्टम (ब्रांडेल फ्रैक्शनेटर) द्वारा उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल। (बी) वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित 200 μL नमूनों को हाथ से अंशित करके उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल। (सी) वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित 100 μL नमूनों को हाथ से अंशित करके उत्पन्न पॉलीसोम प्रोफाइल। प्रत्येक प्रोफ़ाइल के लिए पॉलीसोम, 40 एस, 60 एस और 80 एस चोटियों को इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां महंगे स्वचालित फ्रैक्शनेशन सिस्टम के उपयोग के बिना पॉलीसोम प्रोफाइल बनाने की एक विधि का वर्णन किया गया है। इस विधि का लाभ यह है कि यह पॉलीसोम प्रोफाइलिंग को उन प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है जिनके पास स्वचालित फ्रैक्शनेशन सिस्टम नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख नुकसान थकाऊ हाथ विभाजन और समर्पित घनत्व विभाजन प्रणाली की तुलना में कम संवेदनशीलता हैं।

यह प्रोटोकॉल राइबोसोमल सबयूनिट्स, मोनोसोम और पॉलीसोम को अलग करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ सुक्रोज ग्रेडिएंट की सावधानीपूर्वक तैयारी पर जोर देता है। सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करते समय, ढाल परतों को लोड करते समय हवा के बुलबुले पेश नहीं करना महत्वपूर्ण है। हवा के बुलबुले नीचे से शीर्ष तक उठते हैं और ढाल की रैखिकता को बाधित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक उपयोग से पहले सुई के बाहर को मिटा दिया जाना चाहिए, और प्रत्येक ढाल परत की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सुक्रोज समाधान को लुमेन से हटा दिया जाना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्रेडिएंट का रात भर भंडारण एक ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए। रेफ्रिजरेटर में कंप्रेसर स्विच ऑन और ऑफ करने के कारण होने वाले कंपन ढाल को बाधित कर सकते हैं।

इस परख का एक और महत्वपूर्ण हिस्सा ढाल की मात्रा और आरएनए की एकाग्रता है। 14 मिमी x 89 मिमी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब 12 एमएल की मात्रा धारण कर सकते हैं, लेकिन यह अधिकतम मात्रा है जिसे इन ट्यूबों द्वारा समायोजित किया जा सकता है और इस मात्रा को आमतौर पर इन ट्यूबों को ओवरफिल करने के रूप में माना जाता है। एक अच्छा अधिकतम कार्य मात्रा जो इन ट्यूबों को ओवरफिल नहीं करती है वह 11.5 एमएल है। सुक्रोज ढाल में 10 एमएल की मात्रा होती है; इसलिए, कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पॉलीसोम निष्कर्षण बफर की मात्रा 1.5 एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए। एक अच्छी प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आरएनए की मात्रा सेल प्रकार से भिन्न होगी। यह निर्धारित करने के लिए कई प्रारंभिक रन किए जाने चाहिए कि आरएनए की कितनी मात्रा एक अच्छी पॉलीसोम प्रोफ़ाइल उत्पन्न करती है। एक बार जब यह राशि निर्धारित हो जाती है, तो इसे हमेशा प्रजनन क्षमता बनाए रखने और तुलनात्मक विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए उस विशिष्ट सेल प्रकार के साथ उपयोग किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कि हर बार आरएनए की समान मात्रा लोड की जाती है, आरएनए मात्रा के लिए उपयोग की जाने वाली विधि हमेशा समान होनी चाहिए। यदि आरएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग किया जाता है, तो इसका उपयोग हर समय किया जाना चाहिए। यदि फ्लोरोमीटर का उपयोग किया जाता है, तो इसका उपयोग हर समय किया जाना चाहिए। उपकरण और मात्रा निर्धारण तकनीक सटीकता और संवेदनशीलता दोनों में व्यापक रूप से भिन्न होती है। प्रयोग करने के लिए आरएनए प्रयोग की मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न उपकरणों या तकनीकों का उपयोग करने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न नहीं होंगे।

इस विधि को एक सेल में प्रोटीन अनुवाद की स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, विधानसभा प्रक्रिया के भीतर राइबोसोमल सबयूनिट्स की स्थिति निर्धारित की जा सकती है। साइक्लोहेक्सिमाइड की अनुपस्थिति में प्रयोगों का प्रदर्शन करना, जो बढ़ाव को रोकता है, रन-ऑफ दर विश्लेषण को सक्षम करता है, जो इंगित करता है कि बढ़ाव बदल गया हैया नहीं। व्यक्तिगत अंश आगे के प्रयोगों और विश्लेषण के लिए सामग्री का एक मूल्यवान स्रोत हैं। उदाहरण के लिए, राइबोसोमल उप-आबादी से जुड़े एक विशिष्ट आरएनए या प्रोटीन की पहचान करने के लिए उत्तरी या पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल में अंशों का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, आरएनए को अंशों से निकाला जा सकता है और माइक्रोएरे विश्लेषण13,27 द्वारा या कुल एमआरएनए 28 से उत्पन्न डीएनए लाइब्रेरी पर गहरे अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा सक्रिय राइबोसोम से बंधे एमआरएनए की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकताहै।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि के आलोचनात्मक पठन के लिए डॉ पर्सी टुम्बले और डॉ मेलिसा वेल्स को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरनमेंटल हेल्थ साइंसेज (एनआईईएचएस; ज़िया ईएस 103247 से आर.ई.एस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Fractionator Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader BMG Labtech
Cycloheximide Sigma Aldrich C7698
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
Glass Beads, acid washed Sigma Aldrich G8772 425–600 μm
Heparin Sigma Aldrich H4784
Magnesium Chloride, 1 M KD Medical CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub Hamilton Company 7748-08 custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes Beckman Coulter 331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack Fisher Scientific 14-810-54A
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32855
RNAse Inhibitor Applied Biosystems N8080119
Sucrose Sigma Aldrich S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg Beckman Coulter 331336
Syringe, 3 mL Coviden 888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4 KD Medical RGF-3340
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
UV-Star Microplate, 96 wells Greiner Bio-One 655801

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References

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जैव रसायन अंक 172
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Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome … More

Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems. J. Vis. Exp. (172), e62680, doi:10.3791/62680 (2021).

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