Summary
이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜에 의해 번역되는 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자를 분석하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 자동화된 그래디언트 메이커와 그래디언트 분획 시스템이 일반적으로 이 기술과 함께 사용되지만 이러한 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 자원이 제한되어 있거나 연구를 위해 이 방법을 드물게 또는 가끔 수행해야 하기 때문에 비용을 정당화할 수 없는 실험실의 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 특수 분획 기기 없이 대부분의 분자 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비를 사용하여 폴리솜 프로파일을 재현 가능하게 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 더욱이, 그래디언트 분별 시스템의 유무에 관계없이 생성된 폴리솜 프로파일의 비교가 제공된다. 재현 가능한 폴리솜 프로파일을 최적화하고 생산하기 위한 전략이 논의됩니다. 사카로미세스 세레비시아는 이 프로토콜에서 모델 유기체로 활용됩니다. 그러나 이 프로토콜은 다양한 유기체 및 세포 유형에 대한 리보솜 프로파일을 생성하도록 쉽게 수정 및 조정할 수 있습니다.
Introduction
리보솜은 mRNA를 단백질로 번역하는 기본 과정을 수행하는 메가 달튼 리보 핵 단백질 복합체입니다. 리보솜은 세포 내의 모든 단백질 합성을 수행하는 역할을합니다. 진핵 생물 리보솜은 침강 계수에 따라 작은 리보솜 소단위 (40S)와 큰 리보솜 소단위 (60S)로 지정된 두 개의 하위 단위로 구성됩니다. 완전히 조립 된 리보솜은 80S 모노 솜으로 지정됩니다. 폴리솜은 단일 mRNA 분자를 번역하는 데 관여하는 리보솜 그룹입니다. 자당 밀도 구배 원심분리에 의한 폴리솜 분획은 리보솜 프로파일을 생성하고, 리보솜 번역과 관련된 특정 mRNA를 식별하고, 폴리솜 관련 인자 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 분석하는 데 사용되는 강력한 방법입니다. ,13. 이 기술은 종종 단일 리보솜, 리보솜 서브 유닛 및 메신저 리보 핵 단백질 입자에서 폴리 솜을 분리하는 데 사용됩니다. 분획으로부터 수득된 프로파일은 폴리솜(14)의 번역 활성 및 리보솜(15,16,17)의 조립 상태에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
리보솜 조립은 리보솜 조립 인자18,19,20,21로 알려진 단백질 그룹에 의해 촉진되는 매우 복잡한 과정입니다. 이들 인자는 ATPases, endo- 및 exo-뉴클레아제, GTPases, RNA 헬리카제 및 RNA 결합 단백질(22)을 포함하는 많은 다른 단백질과의 상호작용을 통해 리보솜 생물발생 동안 광범위한 기능을 수행한다. 폴리솜 분획은 리보솜 조립에서 이러한 요인의 역할을 조사하는 데 사용되는 강력한 도구였습니다. 예를 들어, 이 방법은 프리-rRNA 프로세싱 인자인 폴리뉴클레오티드 키나아제 Grc3에서의 돌연변이가 리보솜 조립 공정(17,23)에 어떻게 부정적인 영향을 미칠 수 있는지를 입증하기 위해 활용되었다. 폴리솜 프로파일링은 또한 ATPase Rix7 내의 보존된 모티프가 리보솜 생산에 어떻게 필수적인지를 강조하고 보여주었다(16).
폴리솜 분획 절차는 관심 세포로부터 용해성 세포 용해물을 만드는 것으로 시작됩니다. 용해물은 RNA, 리보솜 서브 유닛 및 폴리 솜뿐만 아니라 다른 가용성 세포 성분을 포함합니다. 연속적인 선형 자당 구배는 초원심분리기 튜브 내에서 만들어집니다. 세포 용해물의 가용성 분획은 자당 구배 튜브의 상부에 부드럽게 적재된다. 그런 다음 로드된 그래디언트 튜브는 원심분리를 거쳐 중력에 의해 자당 그래디언트 내에서 크기에 따라 세포 구성 요소를 분리합니다. 큰 구성 요소는 작은 구성 요소보다 기울기로 더 멀리 이동합니다. 그라디언트의 상단에는 더 작고 느리게 이동하는 셀룰러 구성 요소가 있는 반면, 더 크고 빠르게 이동하는 셀룰러 구성 요소는 하단에 있습니다. 원심 분리 후, 튜브의 내용물은 분획으로 수집된다. 이 방법은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 폴리 솜을 효과적으로 분리합니다. 각 분획의 광학 밀도는 254 nm의 파장에서 스펙트럼 흡광도를 측정하여 결정됩니다. 흡광도 대 분수 수를 플로팅하면 폴리솜 프로파일이 생성됩니다.
선형 자당 밀도 구배는 그래디언트 메이커를 사용하여 생성할 수 있습니다. 원심분리 후, 구배는 종종 분획되고, 흡광도는 자동 밀도 분별 시스템 3,7,13,24,25를 사용하여 측정된다. 이러한 시스템은 폴리솜 프로파일을 생성하는 데 매우 잘 작동하지만 비용이 많이 들고 일부 실험실에서는 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서는 이러한 기기를 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다. 대신, 이 프로토콜은 대부분의 분자 생물학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 장비를 활용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 7% - 47% 자당 구배의 제조
참고: 자당 구배의 선형 범위는 사용된 세포 유형에 따라 더 나은 분리를 달성하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 S. cerevisiae의 폴리솜 프로파일에 최적화되어 있습니다.
- 슈크로스 구배 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mMMgCl2 및 1 mM DTT) 중에서 7% 및 47% 슈크로스의 스톡 용액을 준비한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통해 슈크로스 원액을 멸균하고 4°C에서 보관한다.
- 표 1에 기재된 방식으로 7% 및 47% 슈크로스 스톡 용액을 분주 및 혼합하여 17%, 27% 및 37% 슈크로스 용액 14mL를 준비한다.
- 6개의 폴리프로필렌 원심분리기 튜브(14 x 89mm)를 전체 보기 시험관 랙에 놓습니다. 한 튜브의 동작이 다른 튜브를 방해하지 않도록 튜브 사이에 충분한 공간을 확보하십시오.
- 3mL 주사기에 긴 바늘을 부착합니다. 이 프로토콜의 경우 끝이 뭉툭한 9인치, 22G 바늘을 사용하되(그림 1) 원심분리 튜브의 바닥에 도달할 만큼 충분히 긴 바늘이면 충분합니다.
알림: 그라디언트를 설정하기 전에 주사기가 물방울 없이 자당 용액을 담을 수 있는지 확인하기 위해 테스트 충전 및 분배를 수행하십시오. - 각 원심분리기 튜브의 바닥에 7% 자당 2mL를 추가합니다.
- 바늘 끝을 튜브 바닥 바로 근처에 놓고 용액을 천천히 조심스럽게 분주하여 7% 용액 아래에 17% 자당 2mL를 추가합니다.
- 27%, 37% 및 47% 자당 용액을 각각 2mL씩 반복하십시오. 각 레이어가 밀도 분리를 표시하는 선으로 서로 구별 가능한지 확인합니다(그림 2).
알림: 그래디언트가 48시간 이내에 사용되지 않을 경우 이 시점에서 연속 그래디언트로 정착되기 전에 액체 질소에 층상 자당 용액으로 튜브를 급속 동결하고 장기 보관을 위해 -80°C 냉동고에 보관하십시오. - 그래디언트가 연속적으로 정착되어 자당의 비율이 증가할 수 있도록 그래디언트를 4°C에서 밤새 보관하십시오. 층상 자당 용액이 선형 자당 구배로 정착하는 데 8-12시간이 걸립니다. 선형 그래디언트는 최대 48시간 동안 안정적입니다. 4°C에서 하룻밤 보관하면 동결되고 층상 수크로스 용액을 사용하기 위한 선형 구배로 해동 및 침강하기에 충분한 시간이 제공됩니다. 농도계를 사용하여 그라디언트 품질을 평가합니다.
알림: 그라디언트는 움직임이나 진동이 그라디언트를 방해하므로 방해받지 않는 안정적인 장소에 보관하는 것이 중요합니다.
2. 효모세포 추출물의 제조
- 관심 효모 균주를 50mL의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지에 접종하고 진탕 인큐베이터에서 30°C에서 밤새 고정상으로 성장시킵니다.
알림: 온도는 효모 균주 요구 사항에 따라 다를 수 있습니다. - 10mL의 고정상 배양물을 1L의 새로운 YPD 배지로 옮깁니다. 배양이 중간 지수 성장 단계 (OD600 = 0.4-0.6)에 도달 할 때까지 30 ° C (또는 다른 적절한 온도)에서 격렬한 진탕으로 세포를 배양합니다.
- 중간 지수 성장 단계에서 사이클로헥시미드를 0.1mg/mL의 최종 농도로 배양물에 추가합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
- 세포를 4°C에서 10분 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 수확한다.
참고: 이 시점에서 세포를 동결하여 -80°C에서 보관할 수 있습니다. - 세포를 냉각된 700μL의 폴리솜 추출 완충액(20mM 트리스-HCl pH 7.4, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 1% 트리톤 X-100, 0.1mg/mL의 사이클로헥시미드, 0.2mg/mL의 헤파린)에 재현탁시킨다. 100 단위의 RNase 억제제를 추가하고 1.5mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
- 425-600 μm 크기 범위의 ~400 μL의 사전 냉각 유리 비드를 원심분리 튜브에 추가합니다. 5분 동안 비드 비터에서 격렬한 교반으로 효모 세포를 방해합니다.
- 용해물을 4°C에서 5분 동안 8,000 x g 에서 원심분리하여 명확히 합니다.
- 분광 광도계로 260nm에서 흡광도를 측정하거나 형광 기반 RNA 검출 시스템을 사용하여 정제된 용해물에서 RNA의 농도를 결정합니다.
참고: 매우 정확한 RNA 농도 측정을 위해 형광 기반 RNA 검출 키트를 사용하십시오. - RNA 농도가 0.5-1 μg/μL인지 확인하십시오. RNA 농도가 너무 낮으면 향후 실험에서 세포를 재현탁하는 데 사용되는 폴리솜 추출 완충액의 부피를 줄입니다.
참고: 용해 및 RNA 정량 직후 구배에 용해물을 로드합니다. 필요한 경우 용해물을 액체 질소에서 급속 동결하고 며칠 동안 -80°C에서 보관합니다.
3. 그래디언트의 원심분리
- 용해물을 그라디언트 상단에 조심스럽게 로드합니다. 피펫 팁을 폴리프로필렌 튜브 상단의 내벽에 대고 놓습니다. 튜브를 부드럽게 각도를 맞추고 벽에 드리블하여 용해물을 그라디언트 상단에 천천히 분배합니다. 용해물을 적재할 때 그래디언트를 방해하거나 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오.
참고: 로드된 용해물의 양은 세포 유형에 따라 다릅니다. RNA의 함량도 다양합니다. 최적의 폴리솜 프로파일을 생성하는데 필요한 용해물의 양을 결정하기 위해 다수의 실험을 수행하는 것이 필요할 수 있다. 효모의 경우 300μg의 RNA가 최적화를 위한 좋은 출발점입니다. - 스윙 버킷 로터의 사전 냉각된 버킷에 튜브를 부드럽게 놓습니다.
알림: 각 폴리프로필렌 원심분리기 튜브는 동일한 부피의 그래디언트와 로드된 용해물의 양을 가져야 합니다. 이것은 튜브마다 다를 수 있습니다. 변동으로 인해 초원심분리 중에 불균형 오류가 발생하지 않는지 확인하십시오. - 그래디언트를 260,110 x g 에서 4°C에서 150분 동안 원심분리합니다.
4. 분수 및 데이터 수집
- 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기 튜브를 조심스럽게 제거하고 튜브 홀더에 넣습니다.
- 96웰 플레이트에 라벨을 붙여 분획을 저장하고 얼음에 미리 식힙니다.
참고: 260nm/280nm에서 핵산 측정을 위해 230nm까지의 광학 창이 있는 분광 광도계에 적합한 96웰 플레이트를 사용하십시오. - 그래디언트 상단에 피펫 팁을 조심스럽게 삽입하여 그래디언트 상단에서 시작하여 100μL 또는 200μL 분획을 수집합니다. 전체 그래디언트가 부분 인용 될 때까지 분수를 수집하십시오. 분수의 수는 총 그라디언트 볼륨에 따라 달라집니다.
참고: 그라데이션의 나머지 부분을 방해하지 않는 방식으로 분수를 수집합니다. 모든 분수의 부피가 같은지 확인하십시오. 수동 분획 외에도 분획을 위한 또 다른 저비용 방법은 소형 연동 펌프를 사용하는 것입니다. - 각 분획을 96웰 플레이트로 옮겨 원심분리기 튜브의 바닥에 도달합니다. 수집 된 분획을 항상 얼음 위에 보관하십시오.
- 분광광도계로 254 nm에서 각 분획의 흡광도를 측정한다. 7 % 및 47 % 자당 용액을 블랭크로 사용하십시오.
알림: 분획의 흡광도를 측정할 때 대부분의 분광계 및 색도계에서 가장 효과적인 흡광도 범위는 0.1-1입니다. 흡광도 측정값이 범위(≥1.0)를 벗어나면 분획에 물질이 너무 많습니다. 샘플을 희석하고 데이터를 다시 수집한 다음 프로필을 플로팅할 때 희석 계수를 고려합니다. - 분수 대 흡광도를 플로팅하여 폴리솜 프로파일을 만듭니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
세 가지 대표적인 폴리솜 프로파일이 그림 3에 나와 있습니다. 모든 프로파일은 동일한 효모 균주에서 추출됩니다. 일반적인 폴리솜 프로파일은 40S, 60S 및 80S 리보솜 서브유닛과 폴리솜에 대해 잘 분해된 피크를 갖습니다. 각 리보솜 서브 유닛의 마루와 폴리솜 피크는 각 프로파일에서 분명합니다 (그림 3). 자동화된 밀도 분별 시스템으로부터의 대표적인 프로파일이 도 3A에 도시되어 있다. 이 프로파일을 생성하기 위해 사용된 슈크로스 그래디언트는 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 수작업으로 제조하였다. 도 3A에 도시된 이 프로파일은 수크로스 구배가 검출기 유동 셀을 통해 체이스 용액에 의해 아래에서 위로 변위되고 분획으로 수집됨에 따라 연속적인 흡광도 프로파일로부터 생성되었다. 이러한 시스템은 흡광도를 지속적으로 측정하기 때문에 1,500개 이상의 데이터 포인트를 기록할 수 있습니다. 동일한 수의 데이터 요소를 수동으로 생성하는 것은 실용적이지 않습니다. 수동 프로파일에 일반적으로 사용되는 분획 부피는 100-200 μL입니다. 이 범위 내의 분획 부피는 대부분의 비교 분석에 충분한 세부 정보를 가진 프로파일을 생성합니다. 100 μL 및 200 μL 분획 모두로부터 수득된 대표적인 결과는 도 3B 및 도 3C에 나타내었다. 제시된 모든 3개의 프로파일은 산출된 데이터를 비교하기 위해 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 제조된 슈크로스 구배를 이용하였다. 이 프로토콜에 기술된 수동 준비와는 대조적으로 슈크로스 그래디언트를 제조하기 위해 그래디언트 메이커를 이용하는 폴리솜 프로파일의 예를 위해, Chikashige et al.의 최근 원고는 자동화된 그래디언트 메이커 및 분별 시스템(13)을 사용하여 생성된 그래디언트 프로파일의 몇몇 예를 갖는다.
| 최종 농도 | 7% 재고 mL | 47% 재고 mL |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
표 1: 수크로오스 용액의 제조. 표시된 부피의 17%, 27% 및 37% 자당 스톡 용액을 분주하고 혼합하여 14mL의 7% 및 47% 자당 용액을 준비합니다.
그림 1: 조립된 바늘과 주사기. Luer 잠금 메커니즘을 통해 3mL 주사기에 부착된 해밀턴 바늘 포인트 스타일 3개의 팁이 있는 9인치, 22G 바늘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 7%-47% 자당 그래디언트 층의 최종 모습. 7%, 17%, 27%, 37%, 및 47% 슈크로스 용액은 프로토콜에 기재된 바와 같이 다른 용액 위에 겹쳐진다. 17 % 및 37 % 레이어에는 사진의 레이어를 구별하는 데 도움이되도록 파란색이 추가되었습니다. 실제 실험을 수행 할 때 색상을 추가해서는 안됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 폴리솜 프로파일. 이들 프로파일을 생성하기 위해 사용된 모든 슈크로스 구배는 이 프로토콜에 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. (A) 자동 분별 시스템(브랜델 분류기)에 의해 생성된 폴리솜 프로파일. (B) 현재 프로토콜에 기재된 200 μL 샘플을 손으로 분획하여 생성된 폴리솜 프로파일. (c) 현재 프로토콜에 기재된 100 μL 샘플을 손으로 분별함으로써 생성된 폴리좀 프로파일. 폴리솜, 40S, 60S 및 80S 피크가 각 프로파일에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에서는 값비싼 자동 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법이 설명되었습니다. 이 방법의 장점은 자동화된 분획 시스템이 없는 실험실에서 폴리솜 프로파일링에 액세스할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 단점은 지루한 손 분획과 전용 밀도 분별 시스템에 비해 감도가 감소한다는 것입니다.
이 프로토콜은 리보솜 서브 유닛, 모노 솜 및 폴리 솜을 분리하기에 충분한 해상도로 자당 구배의 신중한 준비를 수반합니다. 자당 그라디언트를 준비할 때 그래디언트 레이어를 로드하는 동안 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다. 기포는 아래에서 위로 올라가 그라디언트의 선형성을 방해 할 수 있습니다. 또한 매번 사용하기 전에 바늘 외부를 닦아야하며 각 그라디언트 층의 무결성을 보장하기 위해 과도한 자당 용액을 내강에서 제거해야합니다. 4 ° C에서 그라디언트의 밤새 보관은 차가운 방에서 수행해야합니다. 냉장고에서 압축기를 켜고 끌 때 발생하는 진동은 기울기를 방해할 수 있습니다.
이 분석의 또 다른 중요한 부분은 구배의 부피와 RNA의 농도입니다. 14mm x 89mm 원심분리 튜브는 12mL의 부피를 담을 수 있지만 이는 이러한 튜브가 수용할 수 있는 최대 부피이며 이 부피는 일반적으로 이러한 튜브를 과도하게 채우는 것으로 간주됩니다. 이 튜브를 과도하게 채우지 않는 양호한 최대 작업량은 11.5mL입니다. 자당 구배 자체의 부피는 10mL입니다. 따라서 세포를 재현탁하는 데 사용되는 폴리솜 추출 완충액의 부피는 1.5mL를 초과해서는 안 됩니다. 양호한 프로파일을 생성하는 데 필요한 RNA의 양은 세포 유형에 따라 다릅니다. 양호한 폴리솜 프로파일을 생성하는 RNA의 양을 결정하기 위해 여러 번의 초기 실행을 수행해야 합니다. 이 양이 결정되면 재현성을 유지하고 비교 분석을 수행할 수 있도록 항상 특정 세포 유형과 함께 사용해야 합니다. 또한 매번 동일한 양의 RNA가 로드되도록 하려면 RNA 정량에 사용되는 방법이 항상 동일해야 합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량하는 경우 항상 사용해야합니다. 형광계를 사용하는 경우 항상 사용해야합니다. 기기 및 정량 기술은 정확도와 감도 모두에서 매우 다양합니다. 실험을 위해 RNA 실험을 정량하기 위해 다른 기기 또는 기술을 활용하면 재현 가능한 결과가 생성되지 않습니다.
이 방법은 세포에서 단백질 번역 상태에 대한 중요한 정보를 얻는 데 적용될 수 있습니다. 위에서 언급했듯이, 조립 공정 내에서 리보솜 서브 유닛 자체의 상태를 결정할 수 있습니다. 신장을 억제하는 사이클로헥시미드가 없는 상태에서 실험을 수행하면 연신율이 변경되는지 여부를 나타내는 유출율 분석이 가능합니다(26). 개별 분획은 추가 실험 및 분석을위한 귀중한 재료 공급원입니다. 예를 들어, 분획은 리보솜 서브 집단과 관련된 특정 RNA 또는 단백질을 확인하기 위해 북부 또는 웨스턴 블로팅 프로토콜에서 사용될 수 있습니다. 마지막으로, RNA는 분획으로부터 추출될 수 있고, 마이크로어레이 분석(13,27) 또는 총 mRNA(28)로부터 생성된 DNA 라이브러리에 대한 딥 시퀀싱 분석에 의해 활성 리보솜에 결합된 mRNA를 식별하는데 사용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 이 원고를 비판적으로 읽어준 Percy Tumbale 박사와 Melissa Wells 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립 보건원 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다. 미국 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS; ZIA ES103247에서 R.E.S)로).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
