Summary
Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.
Abstract
Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomlar tarafından çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Otomatik gradyan üreticileri ve gradyan fraksiyonasyon sistemleri bu teknikle yaygın olarak kullanılırken, bu sistemler genellikle pahalıdır ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir veya araştırmaları için bu yöntemi nadiren veya ara sıra gerçekleştirme ihtiyaçları nedeniyle masrafı haklı çıkaramazlar. Burada, özel fraksiyonasyon aletleri olmadan çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanarak çoğaltılabilir polizom profilleri üretmek için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, gradyan fraksiyonasyon sistemi olan ve olmayan polizom profillerin karşılaştırılması sağlanmaktadır. Tekrarlanabilir polizom profillerini optimize etme ve üretme stratejileri tartışılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae bu protokolde model organizma olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokol birçok farklı organizma ve hücre tipi için ribozom profilleri oluşturmak üzere kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.
Introduction
Ribozomlar, mRNA'yı proteinlere dönüştürmenin temel işlemini gerçekleştiren mega-Dalton ribonükleoprotein kompleksleridir. Ribozomlar, bir hücre içindeki tüm proteinlerin sentezini gerçekleştirmekten sorumludur. Ökaryotik ribozomlar, sedimantasyon katsayılarına göre küçük ribozomal alt birim (40S) ve büyük ribozomal alt birim (60S) olarak adlandırılan iki alt birimden oluşur. Tamamen monte edilmiş ribozom, 80S monozomu olarak adlandırılır. Polizomlar, tek bir mRNA molekülünü çevirmekle uğraşan ribozom gruplarıdır. Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomların çevrilmesiyle ilişkili spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Bu teknik genellikle polizomları tek ribozomlardan, ribozomal alt birimlerden ve haberci ribonükleoprotein parçacıklarından ayırmak için kullanılır. Fraksiyonasyondan elde edilen profiller, polizomların çeviri aktivitesi14 ve ribozomların montaj durumu15,16,17 hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Ribozom montajı, ribozom montaj faktörleri18,19,20,21 olarak bilinen bir grup protein tarafından kolaylaştırılan çok karmaşık bir süreçtir. Bu faktörler, ribozom biyogenezi sırasında, ATPazlar, endo ve ekzo-nükleazlar, GTPazlar, RNA helikazlar ve RNA bağlayıcı proteinler22 dahil olmak üzere diğer birçok proteinle etkileşimler yoluyla çok çeşitli işlevler yerine getirir. Polizom fraksiyonasyonu, bu faktörlerin ribozom montajındaki rolünü araştırmak için kullanılan güçlü bir araç olmuştur. Örneğin, bu yöntem, bir pre-rRNA işleme faktörü olan polinükleotid kinaz Grc3'teki mutasyonların ribozom montaj işlemini nasıl olumsuz yönde etkileyebileceğini göstermek için kullanılmıştır17,23. Polizom profilleme ayrıca ATPase Rix7 içindeki korunmuş motiflerin ribozom üretimi için nasıl gerekli olduğunu vurgulamış ve göstermiştir16.
Polizom fraksiyonasyonu prosedürü, ilgilenilen hücrelerden çözünür hücre lizatları yapmakla başlar. Lisat RNA, ribozomal alt birimler ve polizomların yanı sıra diğer çözünür hücresel bileşenleri içerir. Bir ultrasantrifüj tüpü içinde sürekli, doğrusal bir sakkaroz gradyanı yapılır. Hücre lizatının çözünür fraksiyonu, sakkaroz gradyan tüpünün üstüne yavaşça yüklenir. Yüklü gradyan tüpü daha sonra santrifüjlemeye tabi tutulur, bu da hücresel bileşenleri sakkaroz gradyanı içindeki boyuta göre yerçekimi kuvveti ile ayırır. Daha büyük bileşenler, gradyana daha küçük bileşenlerden daha fazla gider. Degradenin üst kısmı daha küçük, daha yavaş hareket eden hücresel bileşenleri barındırırken, altta daha büyük, daha hızlı hareket eden hücresel bileşenler bulunur. Santrifüjlemeden sonra, tüpün içeriği fraksiyonlar halinde toplanır. Bu yöntem ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları etkili bir şekilde ayırır. Her fraksiyonun optik yoğunluğu daha sonra spektral absorbansın 254 nm dalga boyunda ölçülmesiyle belirlenir. Absorbans ve fraksiyon sayısının çizilmesi polizom profili verir.
Doğrusal sakkaroz yoğunluk gradyanları, bir gradyan oluşturucu kullanılarak üretilebilir. Santrifüjlemeyi takiben, gradyanlar genellikle fraksiyone edilir ve absorbanslar otomatik bir yoğunluk fraksiyonasyonsistemi 3,7,13,24,25 kullanılarak ölçülür. Bu sistemler polizom profilleri üretmek için çok iyi çalışsa da, pahalıdır ve bazı laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir. Burada, bu aletleri kullanmadan polizom profilleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bunun yerine, bu protokol tipik olarak çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan ekipmanı kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. %7 -%47 sakkaroz gradyanlarının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanının doğrusal aralığı, kullanılan hücre tipine bağlı olarak daha iyi ayırma elde etmek için değiştirilebilir. Bu protokol, S. cerevisiae için polizom profilleri için optimize edilmiştir.
- Sakkaroz gradyan tamponunda %7 ve %47 sakarozlu stok çözeltileri hazırlayın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ve 1 mM DTT). Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 μm'lik bir filtreyle sterilize eder ve 4 °C'de saklar.
- %7 ve %47 sakaroz stok çözeltilerini Tablo 1'de açıklanan şekilde dağıtarak ve karıştırarak %17, %27 ve %37'lik 14 mL sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
- Altı polipropilen santrifüj tüpünü (14 x 89 mm) tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk bırakın, böylece bir tüple yapılan eylemler diğerlerini rahatsız etmez.
- 3 mL'lik bir şırıngaya uzun bir iğne takın. Bu protokol için, künt uçlu 9 inç, 22 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 1), ancak santrifüj tüpünün dibine ulaşacak kadar uzun herhangi bir iğne yeterli olacaktır.
NOT: Degradeleri ayarlamadan önce şırınganın sakkaroz çözeltisini damlama olmadan tutabildiğinden emin olmak için bir test dolgusu ve dağıtımı gerçekleştirin. - Her santrifüj tüpünün dibine %7 sakarozun 2 mL'sini ekleyin.
- İğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek ve çözeltiyi yavaş ve dikkatli bir şekilde dağıtarak% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun 2 mL'sini ekleyin.
- % 27,% 37 ve% 47 sakkaroz çözeltilerinin her biri 2 mL ile tekrarlayın. Her katmanın birbirinden yoğunlukların ayrılmasını işaretleyen bir çizgi ile ayırt edilebildiğinden emin olun (Şekil 2).
NOT: Eğer gradyanlar 48 saat içinde kullanılmayacaksa, bu noktada, sürekli bir gradyana yerleşmeden önce, tüpleri sıvı azotta katmanlı sakkaroz çözeltileri ile flaş dondurun ve uzun süreli depolama için -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın. - Degradelerin sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmesine izin vermek için gradyanları gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Katmanlı sakkaroz çözeltilerinin doğrusal bir sakkaroz gradyanına yerleşmesi 8-12 saat sürer. Doğrusal gradyanlar 48 saate kadar kararlıdır. 4 ° C'de gece boyunca depolama, dondurulmuş, katmanlı sakkaroz çözeltilerinin kullanılması için çözülme ve doğrusal bir gradyana yerleşme için yeterli zaman sağlar. Degrade kalitesini değerlendirmek için bir densitometre kullanın.
NOT: Herhangi bir hareket veya titreşim gradyanı bozacağından, gradyanları rahatsız edilmeyecekleri sabit bir yerde saklamak çok önemlidir.
2. Maya hücresi ekstraktlarının hazırlanması
- İlgilenilen maya suşunu 50 mL maya özü pepton dekstroz (YPD) ortamına aşılayın ve sallanan bir inkübatörde sabit faza kadar gece boyunca 30 ° C'de büyür.
NOT: Sıcaklık, maya suşu gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir. - 10 mL sabit faz kültürünü 1 L taze YPD ortamına aktarın. Kültür orta-üstel büyüme fazına ulaşana kadar hücreleri 30 ° C'de (veya başka bir uygun sıcaklıkta) kuvvetli sallanarak inkübe edin (OD600 = 0.4-0.6).
- Üstel büyüme evresinin ortasında, kültüre 0.1 mg / mL'lik son konsantrasyonda sikloheksimid ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 3.000 x g'de santrifüjleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca hasat edin.
NOT: Bu noktada, hücreler dondurulabilir ve -80 ° C'de saklanabilir. - Soğutulmuş 700 μL polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT,% 1 Triton X-100, 0.1 mg / mL sikloheksimid, 0.2 mg / mL heparin). 100 birim RNaz İnhibitörü ekleyin ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Santrifüj tüpüne 425-600 μm boyut aralığına sahip ~400 μL önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Maya hücrelerini 5 dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyon ile bozun.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüjleme ile lizatı netleştirin.
- Berraklaştırılmış lizattaki RNA'nın konsantrasyonunu, bir spektrofotometre ile 260 nm'deki absorbansı ölçerek veya floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak belirleyin.
NOT: Çok doğru RNA konsantrasyon ölçümleri için, floresan bazlı RNA algılama kitleri kullanın. - RNA konsantrasyonunun 0.5-1 μg / μL olduğundan emin olun. RNA konsantrasyonu çok düşükse, gelecekteki deneylerde hücreleri yeniden askıya almak için kullanılan polizom ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın.
NOT: Lisatı lizis ve RNA kantitasyonundan hemen sonra gradyanlara yükleyin. Gerekirse, lizatları sıvı azotta flaş dondurun ve birkaç gün boyunca -80 ° C'de saklayın.
3. Degradelerin santrifüjlenmesi
- Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu iç duvara, polipropilen tüpün üstüne yerleştirin. Tüpü yavaşça açın ve lizatı duvara doğru sallayarak yavaşça gradyanın üstüne dağıtın. Lisatı yüklerken gradyanı bozmamaya veya rahatsız etmemeye büyük özen gösterin.
NOT: Yüklenen lizat miktarı hücre türüne göre değişir. RNA'nın içeriği de değişecektir. Optimal bir polizom profili oluşturmak için gereken lizat miktarını belirlemek için bir dizi deney yapmak gerekebilir. Maya için, 300 μg RNA optimizasyon için iyi bir başlangıç noktasıdır. - Tüpleri, sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yavaşça yerleştirin.
NOT: Her polipropilen santrifüj tüpü eşit miktarda gradyana ve yüklenen lizat miktarına sahip olmalıdır. Bu tüpten tüpe değişebilir. Varyasyonun ultrasantrifüjleme sırasında dengesizlik hatasına neden olmadığından emin olun. - Degradeleri 4 °C'de 150 dakika boyunca 260.110 x g'de santrifüj yapın.
4. Kesir ve veri toplama
- Santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.
- Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin.
NOT: 260 nm/280 nm'de nükleik asit tayinleri için 230 nm'ye kadar optik penceresi olan spektrofotometre için uygun 96 delikli bir plaka kullanın. - Degradenin üst kısmına dikkatlice bir pipet ucu yerleştirerek gradyanın üstünden başlayarak 100 μL veya 200 μL fraksiyonları toplayın. Tüm gradyan aliquoted olana kadar kesirleri toplayın. Kesirlerin sayısı toplam gradyan hacmine bağlı olacaktır.
NOT: Kesirleri, gradyanın geri kalanını bozmayacak şekilde toplayın. Tüm kesirlerin eşit hacme sahip olduğundan emin olun. Manuel fraksiyonasyona ek olarak, fraksiyonasyon için bir başka düşük maliyetli yöntem de küçük bir peristaltik pompa kullanmaktır. - Santrifüj tüpünün dibine ulaşmak için her fraksiyonu 96 delikli plakaya aktarın. Toplanan fraksiyonları her zaman buzun üzerinde tutun.
- Her fraksiyonun absorbansını 254 nm'de bir spektrofotometre ile ölçün. % 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerini boşluk olarak kullanın.
NOT: Fraksiyonların absorbansını ölçerken, çoğu spektrometre ve kolorimetre için en etkili absorbans aralığının 0,1-1 olduğunu unutmayın. Absorbans ölçümleri aralık dışındaysa (≥1.0), fraksiyonlar çok fazla malzemeye sahiptir. Örneği seyreltin, verileri yeniden toplayın ve ardından profili çizerken seyreltme faktörünü hesaba katın. - Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3'te üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Tüm profiller aynı maya suşundan gelmektedir. Tipik bir polizom profili, 40S, 60S ve 80S ribozomal alt birimleri ve polizomlar için iyi çözülmüş zirvelere sahip olacaktır. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgin olacaktır (Şekil 3). Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu profili oluşturmak için kullanılan sakkaroz gradyanları, bu protokolde açıklandığı gibi elle hazırlanmıştır. Şekil 3A'da gösterilen bu profil, sakkaroz gradyanı aşağıdan yukarıya doğru bir dedektör akış hücresi aracılığıyla bir kovalamaca çözeltisi ile yer değiştirdiği ve fraksiyonlar halinde toplandığı için sürekli bir absorbans profilinden üretilmiştir. Bu sistemler sürekli olarak absorbansı ölçtüğünden, 1.500'den fazla veri noktası kaydedebilirler. Aynı sayıda veri noktasını el ile oluşturmak pratik değildir. Genellikle manuel profiller için kullanılan kesir hacmi 100-200 μL'dir. Bu aralıktaki bir kesir hacmi, çoğu karşılaştırmalı analiz için yeterli ayrıntıya sahip bir profil verir. Hem 100 μL hem de 200 μL fraksiyonasyonlarından elde edilen temsili sonuçlar Şekil 3B ve Şekil 3C'de gösterilmiştir. Her üç profil de, elde edilen verileri karşılaştırmak için bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış sakkaroz gradyanlarını kullandı. Bu protokolde açıklanan manuel hazırlığın aksine, sakkaroz gradyanları hazırlamak için bir gradyan oluşturucu kullanan bir polizom profili örneği için, Chikashige ve ark. tarafından yakın zamanda yapılan bir el yazması, otomatik bir gradyan yapıcı ve fraksiyonasyon sistemi13 kullanılarak oluşturulan gradyan profillerinin birkaç örneğine sahiptir.
| Son Konsantrasyon | mL %7 Stok | mL% 47 Stok |
| 7% | 14 | 0 |
| 17% | 10.5 | 3.5 |
| 27% | 7 | 7 |
| 37% | 3.5 | 10.5 |
| 47% | 0 | 14 |
Tablo 1: Sakkaroz çözeltilerinin hazırlanması. %7 ve %47 sakaroz stok çözeltilerini belirtilen hacimlerde dağıtarak ve karıştırarak %17, %27 ve %37'lik 14 mL sakkaroz çözeltileri hazırlayın.
Resim 1: Montajlı iğne ve şırınga. Bir Luer kilit mekanizması aracılığıyla 3 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş Hamilton iğne noktası stili 3 uçlu 9 inç, 22 G iğne. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: %7-%47 sakkaroz gradyan tabakalarının son görünümü. %7, %17, %27, %37 ve %47 sakkaroz çözeltileri, protokolde açıklandığı gibi bir diğerinin üzerine katmanlanmıştır. %17 ve %37 katmanlara, bir fotoğrafın katmanlarını ayırt etmeye yardımcı olmak için mavi renklendirme eklenmiştir; gerçek bir deney yapılırken renklendirme eklenmemelidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Polizom profilleri. Bu profilleri oluşturmak için kullanılan tüm sakkaroz gradyanları, bu protokolde açıklanan yöntem kullanılarak hazırlanmıştır. (A) Otomatik fraksiyonasyon sistemi (Brandel Fraksiyonatör) tarafından üretilen çoklu profil. (B) Mevcut protokolde tanımlanan 200 μL numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili. (C) Mevcut protokolde tanımlanan 100 μL numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili. Polizomlar, 40S, 60S ve 80S zirveleri her profil için belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, pahalı otomatik fraksiyonasyon sistemleri kullanılmadan polizom profilleri oluşturmanın bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemin avantajı, polizom profillemeyi otomatik fraksiyonasyon sistemlerine sahip olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmesidir. Bu protokolün en büyük dezavantajları, sıkıcı el fraksiyonasyonu ve özel yoğunluk fraksiyonasyon sistemine kıyasla daha az hassasiyettir.
Bu protokol, ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları ayırmak için yeterli çözünürlüğe sahip sakkaroz gradyanlarının dikkatli bir şekilde hazırlanmasını gerektirir. Sakkaroz gradyanları hazırlanırken, gradyan katmanları yüklerken hava kabarcıkları sokmamak çok önemlidir. Hava kabarcıkları alttan yukarıya doğru yükselir ve gradyanın doğrusallığını bozabilir. Ek olarak, iğnenin dış kısmı her kullanımdan önce silinmeli ve her gradyan tabakasının bütünlüğünü sağlamak için fazla sakkaroz çözeltisi lümenden uzaklaştırılmalıdır. Degradelerin 4 ° C'de gece boyunca depolanması soğuk bir odada yapılmalıdır. Bir kompresörün buzdolabında açılıp kapanmasının neden olduğu titreşimler gradyanı bozabilir.
Bu tahlilin bir diğer kritik kısmı, gradyanın hacmi ve RNA'nın konsantrasyonudur. 14 mm x 89 mm santrifüj tüpleri 12 mL'lik bir hacme sahip olabilir, ancak bu, bu tüpler tarafından barındırılabilecek maksimum hacimdir ve bu hacim tipik olarak bu tüplerin aşırı doldurulması olarak düşünülür. Bu tüpleri aşırı doldurmayan iyi bir maksimum çalışma hacmi 11,5 mL'dir. Sakkaroz gradyanının kendisi 10 mL'lik bir hacme sahiptir; bu nedenle, hücreleri yeniden askıya almak için kullanılan polizom ekstraksiyon tamponunun hacmi 1,5 mL'yi geçmemelidir. İyi bir profil oluşturmak için gerekli RNA miktarı hücre tipine göre değişecektir. Ne miktarda RNA'nın iyi bir polizom profili oluşturduğunu belirlemek için bir dizi başlangıç çalışması yapılmalıdır. Bu miktar belirlendikten sonra, tekrarlanabilirliği korumak ve karşılaştırmalı analiz yapabilmek için her zaman belirli hücre tipi ile birlikte kullanılmalıdır. Ayrıca, her seferinde aynı miktarda RNA'nın yüklenmesini sağlamak için, RNA kantitasyonu için kullanılan yöntem her zaman aynı olmalıdır. RNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanılıyorsa, o zaman her zaman kullanılmalıdır. Bir florometre kullanılıyorsa, her zaman kullanılmalıdır. Cihazlar ve nicelleştirme teknikleri hem doğruluk hem de hassasiyet açısından büyük farklılıklar gösterir. RNA deneyini ölçmek için farklı araçlar veya teknikler kullanmak, tekrarlanabilir sonuçlar üretmeyecektir.
Bu yöntem, bir hücredeki protein translasyonunun durumu hakkında önemli bilgiler elde etmek için uyarlanabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, ribozomal alt birimlerin montaj sürecindeki durumları belirlenebilir. Uzamayı engelleyen sikloheksimidin yokluğunda deneyler yapmak, uzamanın değiştirilip değiştirilmediğini gösteren akış hızı analizini mümkün kılar26. Bireysel fraksiyonlar, daha ileri deneyler ve analizler için değerli bir malzeme kaynağıdır. Örneğin, fraksiyonlar, ribozomal alt popülasyonlarla ilişkili spesifik bir RNA veya proteini tanımlamak için Kuzey veya Batı lekelenme protokollerinde kullanılabilir. Son olarak, RNA fraksiyonlardan ekstrakte edilebilir ve mikroarray analizi13,27 veya toplam mRNA28'den üretilen bir DNA kütüphanesi üzerinde derin dizileme analizi ile aktif ribozomlara bağlı mRNA'ları tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Dr. Percy Tumbale ve Dr. Melissa Wells'e bu makaleyi eleştirel okumaları için teşekkür eder. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247 ila R.E.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al.
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E.
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R.
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).
